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Study of the effect of the podocyte-specific palladin knockout in mice with a 129 genetic background
(2023)
Worldwide, chronic kidney disease is one of the leading public health problems. Podocytes, highly specialized postmitotic cells in the filtration unit of the kidney glomerulus, are essential for the size selectivity of the filtration barrier. Loss of the complex 3D morphology of their interdigitating foot processes, effacement and detachment of the cells from the capillaries lead to proteinuria and often loss of kidney function.
Since the morphology of podocyte foot processes is highly dependent on an intact actin cytoskeleton and actin-binding proteins, we investigated the role of the actin-binding protein palladin in podocytes from mice with a 129 genetic background, that is more susceptible to kidney injury. PodoPalld129-/- mice were examined at 6 and 12 months of age using immunofluorescence staining, electron and 3D super-resolution microscopy as well as qRT-PCR.
Our analysis of PodoPalld129-/- mice at 6 and 12 months of age showed that podocyte- specific knockout of palladin results in dilation of the capillary tuft accompanied by loss of mesangial cells, indicating the influence of palladin on glomerular tuft formation. Besides, we observed morphological abnormalities such as an enlarged sub-podocyte space, cyst formations and an increased number of cell-cell contacts between podocytes and parietal epithelial cells in PodoPalld129-/- mice compared to controls. Moreover, palladin knockout resulted in downregulation of the slit diaphragm protein nephrin as well as an age-dependent significant increase in podocyte foot process effacement. Although there was a significant change in foot process morphology, we did not detect albuminuria in PodoPalld129-/- mice of both age groups. However, we found an increase of trefoil factor 1 (Tff1) in the urine of the mice, indicating an altered, more permeable filtration barrier.
Considering that palladin has several binding sites for important actin-binding and regulatory proteins, we studied the expression of Lasp-1, Pdlim2, VASP and Klotho in dependence on palladin. We found a remarkable reduction in, for example, phosphorylated Lasp-1 as well as Klotho, which could influence the morphology of podocyte foot processes.
Compared with PodoPalldBL/6-/- mice, PodoPalld129-/- mice showed stronger glomerular tuft dilation and developed podocytes with increased morphological abnormalities, underlining the importance of the genetic background.
In conclusion, these results demonstrate the essential role of palladin for podocyte morphology in mice with a 129 genetic background.
80% of chronic kidney diseases are caused by the loss and the damage of a differentiated and postmitotic cell type, the podocytes. The size-selectivity of the blood filtration barrier is highly dependent on the complex interdigitation of the podocyte foot processes as well as of the slit membrane which is spanned in between. Changes of this specific morphology as well as a detachment of podocytes lead to the clinical hallmark of a nephrotic syndrome e.g. proteinuria and oedema formation.
Since specific drugs or therapies are usually not available, patients are often dependent on dialysis and transplantation. Therefore, intensive studies are necessary to understand the pathogenesis of glomerulopathies as well as to identify specific drugs. In the past, it was already demonstrated that the zebrafish is an ideal model to study kidney function and to screen for drugs, since the larvae quickly develop a simple glomerulus that is comparable to the glomeruli of mice, rat and human.
In the present work, a zebrafish model was established to study a specific glomerulopathy named focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). FSGS is mainly characterized by histology of the glomeruli which shows segmental scar formation and matrix deposition due to an activation of parietal epithelial cells (PEC) lining the Bowman’s capsule. For this purpose, we used the nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ) system, in which a cytotoxic agent is exclusively generated in podocytes by the enzyme NTR resulting in apoptosis of cells. Firstly, the parameters for development of an FSGS-like disease were evaluated and the glomerular response to podocyte depletion was examined during three days after the induction of podocyte damage. Using classic histological techniques, immunofluorescence staining and transmission electron microscopy, it was possible to demonstrate that zebrafish larvae phenocopy human FSGS in important characteristics after partial podocyte depletion. Secondly, by intravascular injection of fluorescence-labeled high molecular weight dextran, we found that the filtration barrier became leaky. Moreover, we identified a severe podocyte foot process effacement, formation of subpodocyte space pseudocysts and loss of the slit membrane protein podocin. Morphometrical, histological and ultrastructural analysis revealed an enlargement of the glomerulus, proliferation of cuboidal PECs and intraglomerular deposition of extracellular matrix components, all typical hallmarks of FSGS. Further, we observed adhesions between the parietal and the visceral glomerular cell layer forming sclerotic lesions. However, it remains still unclear whether an inflammatory response is involved in the development of sclerotic lesions. Our microscopic analysis provided some evidence for immigration of immunocompetent cells like neutrophils, presumably due to induction of apoptosis in our model.
Taken together, in the present work a zebrafish model was established with characteristics of mammals FSGS which will be useful for pathomechanism studies as well as for drug screening.
Jedes Jahr werden alleine in Deutschland circa 2,6 Millionen viszeralchirugische Operationen
durchgeführt, die insgesamt gesehen eine Mortalität von fast 2 % aufweisen. Ein häufiges Problem
bei der Durchführung dieser Eingriffe ist, dass die Patienten eine Dysfunktion des Immunsystems
entwickeln, die die Anfälligkeit gegenüber infektiösen Komplikationen erhöht.
Die Faktoren der Immundysfunktion sind zwar in Teilen bekannt, aber die Pathophysiologie
dahinter bleibt unbekannt. Das Verständnis der Pathophysiologie ist unerlässlich, um gute
therapeutische Optionen zu finden. Überdies werden Tiermodelle benötigt, die die klinische
Situation wiederspiegeln.
Mit dem murinen Modell der surgically-induced immune dysfunction werden die Reaktionen des
humanen Immunsystems in weiten Teilen nachempfunden, wobei ein wesentliches Ziel der Arbeit
war, die Kinetik der Immunveränderungen über einen 72 h-Zeitraum zu untersuchen.
Die Operation löst deutlichen Stress bei den Tieren aus und führt von Beginn an sowohl zu pro –
als auch antiinflammatorischen Prozessen, die vor allem abakteriell ausgelöst werden.
Dennoch überwiegt in der frühen postoperativen Phase die proinflammatorische Reaktion mit
Anstieg der neutrophilen Granulozyten, Anstieg der Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems
und der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine. Zwischen dem 6 h- und 24 h-Zeitpunkt
gewinnt die antiinflammatorische Reaktion die Oberhand. Dieses zeigt sich durch eine
Lymphozytopenie mit Zunahme des Anteils der regulatorischen T-Zellen, durch eine verminderte
MHCII-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen, durch eine Zunahme der Aktivität des
Enzyms Indolamin-2,3-Dioxygenase, durch die Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen
und durch eine verminderte Stimulierbarkeit von murinen Splenozyten.
Diese Immunreaktionen werden nicht nur durch die SID sondern auch durch eine einfache
Laparotomie ausgelöst, wobei sie dann weniger deutlich ausgeprägt sind und schneller ablaufen.
Von dieser Kinetik ausgehend, kann an diesem Modell der Nutzen von potentiellen Therapien
geprüft werden, wobei bis zum 6 h-Zeitpunkt antiinflammatorisch wirkende Substanzen vorteilhaft
sein könnten, die im Weiteren von immunstimulierenden Medikamente abgelöst werden.
Insgesamt weist dieses Modell viele Parallelen mit der humanen postoperativen
Immundysfunktion auf, sodass es der Grundlagenforschung viele Möglichkeiten eröffnet.
Tod kardiovaskulärer Ursache ist laut Statistiken der WHO zum Zeitpunkt dieser Arbeit wie auch in den Jahren zuvor die Haupttodesursache weltweit. Hypertension und konsekutive myokardiale Hypertrophie sind jeweils unabhängige Risikofaktoren für kardiovaskuläre Mortalität. Im Umkehrschluss geht eine Reduktion myokardialer Hypertrophie mit einer verbesserten kardialen Leistungsfähigkeit und gesteigerten Überlebensraten einher. In dieser Arbeit vorangegangenen Studien ergaben sich erste Hinweise, dass bestimmte Arzneistoffe unabhängig von deren Wirkung auf den Blutdruck eine Regression myokardialer Hypertrophie erreichen können. Die vorliegenden Studien zeigten jedoch Schwächen in ihren Designs, insbesondere durch die Wahl der jeweils genutzten Hypertrophiemodelle. Zur Untersuchung Blutdruck-unabhängiger Effekte auf die myokardiale Hypertrophie ist die Wahl des Hypertrophiemodells jedoch entscheidend. In der vorliegenden Arbeit konnte mit der cyp1a1ren-2 transgenen Ratte ein Phänotyp von hohen Proreninspiegeln mit Bluthochdruck und kardialer Hypertrophie in vollständig reversibler Weise induziert werden. Mit der gewählten Dosis von 0,167 % des zur Induktion des Transgens notwendigen sekundären Pflanzenstoffs Indol-3-Carbinol über eine Gabedauer von vier Wochen war es möglich, eine konzentrische Hypertrophie des linken Ventrikels mittels der MRT-Bildgebung dokumentiert zu induzieren. Die Hypertrophie wie auch die Hypertonie waren nach Ablauf der vierwöchigen Substitutionsdauer im Verlauf der folgenden Wochen der Untersuchung vollkommen reversibel. Im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit höheren Dosen von I3C ergab sich kein Hinweis auf einen bleibenden Endorganschaden, insbesondere war die kardiale Funktion unbeeinträchtigt. Ferner gestattet die in vivo-Bildgebung mit den Versuchstieren Langzeitstudien über eine ausgedehnte Dauer, bei der im Gegensatz zu Versuchen ohne Bildgebungsverfahren keine Ergebnisse jeweils durch Sektion der Tiere erhoben werden müssen. Durch das bildgebende Verfahren wird demnach die Anzahl der notwendigen Versuchstiere erheblich reduziert. Zudem wird durch den Verzicht auf invasive Maßnahmen bei den hinsichtlich der Hypertrophie im MRT untersuchten Tiere ein proinflammatorischer und konsekutiv potentiell die Untersuchungsergebnisse verfälschender Einfluss vermieden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem eine Zeitfenster isoliert werden, in dem sich das Potential für weitergehende Studien von Arzneistoffen hinsichtlich derer etwaigen Blutdruck-unabhängigen antihypertrophen Wirkung auf das Myokard ergibt.
Die Neurotrophine (Nerve Growth Factor, Brain-derived Neurotrophic Factor, Neurotrophin-3 und Neurotrophin-4/5) zählen zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren des Nervensystems und sind von großer Bedeutung für Gehirnentwicklung und neuronale Plastizität. Sie vermitteln ihr Wirkungen über zwei Rezeptorsysteme: Trk-Rezeptoren binden Neurotrophine spezifisch und mit hoher Affinität. Sie aktivieren anti-apoptotische, wachstums- und differenzierungsfördernde Signalwege. Der niedrigaffine p75-Neurotrophinrezeptor (p75) hingegen kann Rezeptorkomplexe mit verschiedenen Ko-Rezeptoren und einer Vielzahl von Liganden bilden. Das Spektrum seiner möglichen Effekte ist beachtlich, wobei pro-apoptotische und wachstumshemmende Wirkungen überwiegen. Interessanterweise kommt es bei einer Reihe von pathologischen Prozessen zu einer vermehrten Expression von p75, etwa bei Morbus Alzheimer, Amyotropher Lateralsklerose, Chorea Huntington und nach Gehirnverletzungen. Inhibitoren der pro-apoptotischen und wachstumshemmenden Wirkung bergen Potenzial für die Therapie dieser Krankheitsbilder. Transgene p75-Knockout-Modelle sind ein wichtiges Instrument für ein besseres Verständnis des Rezeptors. Aus den bisher vorliegenden Daten zu Morphologie und Verhalten solcher Mäuse ergibt sich jedoch ein widersprüchliches Bild. Im gesunden adulten Nervensystem wird p75 insbesondere durch cholinerge Neurone des basalen Vorderhirns (BFCN) exprimiert. In mehreren Studien wurde bei p75-defizienten Mausstämmen eine Hypertrophie der BFCN und der cholinergen Innervation des Hippocampus beobachtet. Für ein weiteres wichtiges Zielgebiet von BFCN-Projektionen, die basolaterale Amygdala (BLA), liegen bisher jedoch keine Daten vor. Ein Ziel dieser Arbeit war daher die Erfassung der cholinergen Innervationsdichte dieses Kerngebiets bei jungen und gealterten p75-Knockout-Tieren und Vergleich mit den entsprechenden Wildtyp-Kontrollen. In allen Altersgruppen war bei p75-Defizienz eine erhöhte Faserdichte nachweisbar. Im Hippocampus unterliegen die cholinergen Neuriten bei Knockout-Tieren einer verstärkten Degeneration im Alter. Dieser Effekt trat in der BLA nicht auf. Da im adulten Hippocampus p75 physiologischerweise exprimiert wird, in der adulten Amygdala jedoch nicht, weist dies auf eine trophische Wirkung des Rezeptors für hippocampale cholinerge Neurone hin, die vermutlich in Assoziation mit Trk-Rezeptoren vermittelt werden. Eine Testung höherer Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz erbringt Hinweise auf die funktionellen Auswirkungen der morphologischen Veränderungen. Bisherige Studien zeigen Abweichungen bei lokomotorischer Aktivität, Angstverhalten und räumlichem Lernen, sind jedoch im Detail widersprüchlich. Geringe Kohortengrößen und ungenaue Angaben zur Testdurchführung schränken die Aussagekraft teilweise ein. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Prüfung dieser Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz mittels standardisierter Testmodelle unter Verwendung größerer Testkohorten. Im Open Field-Versuch wiesen Knockout-Tiere eine erhöhte motorische Aktivität auf. Im Holeboard-Versuch zeigte sich jedoch keine begleitende Zunahme zielgerichteter Exploration. In der Dark/Light Box fiel ein signifikanter Gruppenunterschied im Einfluss der zirkadianen Rhythmik auf das Verhalten in diesem Testmodell auf. Dies erschwert die Testinterpretation, trägt jedoch auch zur Erklärung der Diskrepanzen in der Literatur bei. Im Morris Water Maze zeigten Knockout-Tiere deutliche Defizite beim räumlichen Lernen. Als Ursache der Verhaltensauffälligkeiten kommen Veränderungen des cholinergen Systems, der neuronalen Plastizität und der zirkadianen Rhythmik in Betracht. Zudem sind Veränderungen weiterer Transmittersysteme wahrscheinlich. Die Untersuchung dieser Systeme und die Durchführung spezialisierter Verhaltenstests sind interessante Ansatzpunkte für zukünftige Studien.
Zur Reproduzierbarkeit von Augeninnendruckmessungen am Tiermodell mittels Ocular Response Analyzer
(2016)
Hintergrund: Für die Bestimmung des intraokularen Drucks stehen verschiedene Messprinzipien zur Verfügung. Alle Messmethoden, die von außen den Augeninnendruck (IOD) ermitteln, werden durch individuell variierende biomechanische Gewebeeigenschaften der HH beeinflusst. Die berührungslose Luft-Puls-Tonometrie gilt als ein von der Hornhaut-dicke weniger abhängiges Verfahren, welches den Intraokulardruck jedoch im Vergleich zur Goldmann-Applanationstonometrie (GAT) eher überschätzen soll. Vor diesem Hintergrund wurden die Reliabilität und der Einfluss des IOD auf die korneale Hysterese (CH) und den kornealen Resistenzfaktor (CRF) des Ocular Response Analy-zer (ORA) an einem tierexperimentellen Augenmodell untersucht. Methodik: Die Kontrolleinheit eines neu entwickelten biomechanischen Augenmodells (IAM) wurde für das Experiment am ORA an 10 Bulbi junger Schweine genutzt, um die ORA- Parameter IOPg (analog GAT), IOPcc (korrigierter IOD), CH und CRF zu ermitteln. Die Steuerungseinheit regelte in 5-mmHg-Schritten den wahren IOD zwischen 10 und 40 mmHg mithilfe von 2 Schrittmotoren über ein bidirektionales System. Nach der Ult-raschallpachymetrie wurden die Bulbi anhand der zentralen Hornhautdicke (CCT) in zwei Gruppen (Gruppe 1 CCT≤1450 μm, Gruppe 2 CCT>1450 μm) unterteilt. Bei stu-fenweiser Erhöhung und Absenkung (jeweils immer 5 mmHg) des wahren Intraokulard-ruckes (Istdruck) wurden die ORA-Parameter ermittelt. Ergebnisse: Die Differenz IOPg/Istdruck verhielt sich stets negativ und nahm mit steigendem Druck zu. Besonders groß war die Differenz bei den Schweinebulbi der Gruppe 1. Der IOPcc stand im niedrigen Druckbereich bis ca. 15 mmHg in einem positiven Verhältnis zum Istdruck. Mit steigendem IOD wurde die Differenz zum Istdruck negativ. Die Verhält-nisänderung war im Vergleich zum Kurvenverlauf des IOPg konstant. Die Hornhäute der Gruppe 2 waren fehleranfälliger. Die Differenz IOPg/Istdruck betrug im Median in der Gruppe 1 -7,9 mmHg und in der Gruppe 2 -7,0 mmHg. Der IOPcc wurde in geringe-rem Maße von der zentralen Hornhautdicke beeinflusst. Die Differenz war in der Grup-pe 1 im Median bei -1,8 mmHg und in der Gruppe 2 bei -2,8 mmHg. Die CH war mit einem Mittelwert von 5,5±2,7 mmHg in der Gruppe 1 und 7,1±2,1 mmHg (Gruppe 2) bei allen Drucklagen konstant. Schlussfolgerung: Die Untersuchungen am tierexperimentellen Augenmodell (IAM) zeigen, dass der IOPcc in einem Bereich zwischen 10 und 25 mmHg den wahren intrakameralen vor-herrschenden Druck misst. In diesem „physiologischen Bereich“ kann der ORA einen wichtigen diagnostischen Nutzen für die „Zieldruckbereich“-Einstellung zahlreicher Glaukompatienten haben. Bei höheren Druckwerten sind Abweichungen zu beobachten. Die CH in der Gruppe 2 ist größer, jedoch in beiden Gruppen über den gesamten Druckverlauf ohne signifikante Abweichung. Die CH ist demnach ein IOD- und CCT-unabhängiger Faktor. Das gemessene Verhalten der CH steht im Widerspruch zu den bislang in der Literatur veröffentlichten Daten. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergeb-nisse zeigen die Bedeutung zusätzlicher, noch nicht identifizierter Einflussfaktoren auf die CH. Umfangreichere Evaluierungen des ORA wären daher zur Analyse systemati-scher Abweichungen hilfreich, um dementsprechend die Software des ORA optimieren zu können.
Sepsis zählt zu den führenden Todesursachen in Deutschland und die optimale Blutzuckerkontrolle bei Sepsispatienten in Hinblick auf ein verbessertes Outcome ist immer wieder Gegenstand vieler klinischer Studien. In unserer gemeinsamen Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Blutzuckerspiegel und Insulingabe auf die intestinale Mikrozirkulation im Rattenmodell unter Endotoxinämie. Als Sepsismodell diente die LPS-induzierte Endotoxinämie. Wir teilten die Versuchstiere zum einen in Gruppen mit niedrig dosierter Glukoseinfusion bzw. Placebogabe in Form von 0,9%iger Kochsalzlösung, in denen wir (hoch)normale Blutzuckerwerte zwischen 3-8 mmol/l messen konnten und zum anderen in Gruppen mit hoch dosierter Glukoseinfusion mit 2g/kg/h, wodurch wir hyperglykäme Werte über 10 (bis maximal 15) mmol/l erzielen konnten. Zu Beginn und am Ende des Experiments erfolgten jeweils eine arterielle Blutgasanalyse und Zytokinbestimmung (IL-1-alpha, MCP-1, TNF-alpha, IFN-gamma, GM-CSF, IL-4). Um die intestinale Mikrozirkulation beurteilen zu können, untersuchten wir mittels Intravitalmikroskopie zum einen die Leukozyten-Endothel-Interaktion in Form von „Rolling“ und „Sticking“, zum anderen die Funktionelle Kapillardichte in den 3 Muskelschichten des terminalen Ileums. Wir konnten feststellen, dass Insulingabe sowohl bei niedrig - als auch hoch dosierter Glukoseinfusion die Anzahl an fest adhärierenden Leukozyten („Sticker“) unter Endotoxinämie signifikant reduziert. Eine mögliche antiiflammatorische Wirkung. Ebenfalls zeigte sich eine deutliche Erholung der unter LPS-Einfluss verminderten Funktionellen Kapillardichte durch Insulin. IFN-gamma-, GM-CSF- und IL-4-Konzentrationen verringerten sich unter Endotoxinämie, wenn hochdosierte Glukoseinfusion appliziert wurde in Kombination mit - oder ohne Insulinbolus. Insgesamt sahen wir unter Insulineinfluss eine erhebliche Verbesserung der intestinalen Mikrozirkultion unter LPS-induzierter Endotoxinämie im Tiermodell. Zusätzlich verringerten sich die Konzentrationen obengenannter Zytokine unter Hyperglykämie in unserem LPS-Sepsismodell. Ob diese Veränderungen durch erhöhte Insulinfreisetzung der Versuchstiere hervorgerufen wurden, lässt sich für uns nicht klären.
Zerebrale kavernöse Malformationen sind Gefäßfehlbildungen des menschlichen zentralen Nervensystems, die mit einer Prävalenz von etwa 1:650 in der Bevölkerung auftreten und zu rezidivierenden Kopfschmerzen, Krampfanfällen und Gehirnblutungen führen können. Diese Läsionen treten sowohl sporadisch als auch als Konsequenz von erblichen Mutationen (familiäre Kavernomatose) mit unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität auf. Kausale Mutationen sind für die Gene CCM1 ( KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10) beschrieben. Die vorliegende Dissertationsarbeit mit dem Titel „Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Kandidatengens für kavernöse Gefäßmalformationen des zentralen Nervensystems“ hatte die Suche neuer CCM-assoziierter Gene und deren Beschreibung zur Aufgabe. Als Ausgangspunkt dienten fünf Indexpatienten aus der Kohorte Stahl et al. 2008, bei denen keine ursächliche Mutation in den bekannten CCM-Genen identifiziert werden konnte. Die Exomsequenzierung mittels SOLiD™ 5500XL ergab für die vier isolierten und den familiären Fall mehr als 210.000 Varianten. Nach Filterung und Priorisierung dieser Veränderungen wurden acht Kandidatengene definiert, von denen fünf mittels klassischer Sanger-Sequenzierung validiert werden konnten. Das vielversprechendste Kandidatengen, FAM222B (C17orf63), in dem 2012 keine Loss-of-function Mutationen bekannt waren und das für ein Protein unbekannter Struktur und Funktion kodiert, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Zunächst konnten durch einen Yeast Two-Hybrid Screen Interaktionspartner identifiziert werden, die sich in die bekannten CCM-Signalwege integrieren ließen. Funktionelle Studien mittels Morpholino- und TALEN-Technik im Zebrafischmodell und mit humanen Nabelschnurvenenendothelzellen zeigten jedoch keinen signifikanten Effekt von FAM222B auf die Angiogenese. Auch eine detaillierte Bewertung der Informationen, die erst Ende 2014 in der ExAC-Datenbank veröffentlicht wurden, spricht in Zusammenschau mit den experimentellen Daten eher dagegen, FAM222B als neues Kandidatengen für die Entstehung von CCMs einzustufen. Parallel zu den funktionellen Studien wurde die Kohorte von Stahl et al. 2008 kontinuierlich erweitert. Bei den molekulargenetischen Analysen fanden sich mehr kausale Mutationen im CCM3-Gen als bisher angenommen. Ferner konnte gezeigt werden, dass rund ein Drittel der Probanden vor Erreichen des Erwachsenenalters und ein Fünftel der Mutationsträger bereits vor dem 10. Lebensjahr erkranken.
Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören zu den Haupttodesursachen in der westlichen Bevölkerung. Die Morbidität und Mortalität der Herzinsuffizienz und ischämischer Erkrankungen sind trotz vielfältiger Therapieansätze weiterhin sehr hoch. Bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) konnte hinsichtlich der Genexpression des Carnitin-Transporters OCTN2 eine deutliche Reduktion festgestellt werden. Diese korrelierte signifikant mit einer verminderten Ejektionsfraktion (EF) und stellt somit einen möglichen Risikofaktor für die Entwicklung bzw. Progression einer DCM dar. Physiologisch ist die OCTN2-vermittelte Carnitin-Aufnahme von besonderer Bedeutung für die Energiegewinnung der Zelle über die Betaoxidation. Zusätzlich zu dieser endogenen Verbindung können jedoch auch zahlreiche Arzneistoffe, wie Mildronat, von OCTN2 transportiert werden und die Carnitin-Aufnahme hemmen. Ein Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es demzufolge, den Einfluss einer verminderten OCTN2-Funktion auf die Entwicklung einer DCM, anhand hämodynamischer Analysen (MRT und Konduktanz-Katheter-Technik) zu überprüfen. Dafür wurden Mäuse, die homo- oder heterozygot eine Mutation im Octn2-Gen (Slc22a5) aufwiesen (sogenannte juvenile viscerale Steatose-Mäuse) und entsprechende Kontrolltiere als Modell verwendet. Die heterozygot-defizienten Tiere unterschieden sich dabei sowohl hinsichtlich des Gehalts an freiem Carnitin im Serum und im Herzgewebe als auch hinsichtlich der hämodynamischen Parameter (wie z. B. EF, LVRI und dP/dtmin) nur wenig von den Kontrollen. Die Modulation des Carnitin-Spiegels durch pharmakologische Intervention mit Mildronat ging zwar mit einer Verminderung des Carnitin-Spiegels einher, resultierte jedoch nicht in einer pathophysiologisch veränderten Herzfunktion. Interessanterweise deuten einige kardiale und molekularbiologische Parameter (wie z. B. EF und NT-proBNP-Gehalt) unter Hemmung des OCTN2 tendenziell sogar auf eine leicht verbesserte Herzfunktion hin. Außerdem wurde in diesem Tiermodell auch der Einfluss der OCTN2-Funktion und damit der Carnitinversorgung für das Ausmaß der Gewebeschädigung beim akuten Myokardinfarkt untersucht. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls keine negativen Auswirkungen bei verminderter OCTN2-Funktion. Sie sprachen im Gegenteil für eine protektive Wirkung eines reduzierten Carnitin-Spiegels hinsichtlich Ischämie-bedingter kardialer Schädigungen. So zeigte sich ein deutlicher Gendosis-Effekt hinsichtlich Carnitin-Spiegel und Infarktareal, der durch Carnitin-Applikation teilweise wieder aufgehoben werden konnte. Insgesamt ist aus den Untersuchungen zur kardialen Bedeutung von OCTN2 hervorgegangen, dass eine moderate Beeinträchtigung der Transportfunktion und damit der Carnitin-Spiegel keinen negativen Einfluss auf die Herzfunktion besitzt.
Die Nutzung von Hochfeld MRT Systemen zur Volumetrie und Beurteilung intradiskaler Veränderungen ist innovativ und eröffnet einzigartige Möglichkeiten bei der nicht invasiven Diagnostik und Kontrolle von therapeutischen Effekten an der Bandscheibe. In der vorliegenden Studie wurden 76 porcine Bandscheiben von 15 Schweinen in vitro hinsichtlich der Volumenänderung des Nucleus pulposus nach Mikrodiskektomie mit dem MD SpineWand® (Fa. Arthrocare) untersucht. Ziel der Untersuchungen war es, die Größe dieser Volumenänderung mit Hilfe des 7 Tesla Hochfeld MRT (BioSpin ClinScan®, Fa. Bruker) zu objektivieren und einen signifikanten Volumenunterschied bei Durchführung des OP-Verfahrens mit und ohne Applikation der Coblationsenergie nachzuweisen. Das Volumen des Nucleus pulposus konnte durch Anwendung der Mikrodiskektomie sowohl mit als auch ohne Einschalten der Coblationsenergie reduziert werden. Der Vergleich der Gruppen zeigte mit p < 0,001 jedoch eine hochsignifikant größere Volumenreduktion in der Versuchsgruppe. Insgesamt konnte in den Bandscheiben der Versuchsgruppe (n = 38) eine absolute Reduktion des Nukleusvolumen um 229,03 mm³ gemessen werden, wobei der Effekt in den Bandscheiben der LWS (n = 19) mit 257,01 mm³ größer war als in den etwas kleineren Bandscheiben der BWS (201,05 mm³, n = 19). Relativ zu den Ausgangsvolumina entsprechen diese Ergebnisse einer Volumenreduktion des Nucleus pulposus um 24,66 % in der LWS und 22,96 % in der BWS. Für die Kontrollgruppe ohne Anschalten der Coblationsenergie ergaben sich vergleichsweise relative Volumenreduktionen um 6,04 % in der LWS (n = 19) und 4,99 % in der BWS (n = 19). Zieht man zusätzlich die Volumina der hypointensen intradiskalen Läsionen mit in die Berechnungen ein, so ergibt sich ein hypothetischer reduzierender Volumeneffekt in der Versuchsgruppe von 37,47 % (LWS) und 37,23 % (BWS). Die Studie hat als erste ihrer Art die Volumenreduktion nach minimalinvasiver Mikrodiskektomie am porcinen Modell in vitro beschrieben. Die Übertragung der Ergebnisse auf ein in vivo-Modell sowie den Menschen bleibt offen, stellt jedoch eine interessante Zielstellung künftiger Forschung dar.
Das Pankreasadenokarzinom zeichnet sich durch aggressives Wachstum, frühe Metastasierung, späte Diagnosestellung und vermindertes Ansprechen auf zytostatische Therapien aus. Ziel der vorliegenden Arbeit ist zum Einen die Etablierung und Validierung eines Ganzkörper-Fluoreszenz-basierten Nachweises von Tumorwachstum und Metastasierung im Mausmodell als mögliche Basis für darauf aufbauende präklinische Pankreaskarzinom-Studien. Zum Anderen werden Vor- und Nachteile im Vergleich zum Schnittbildverfahren eines 7-Tesla-Kleintier-MRT untersucht. Nach stabiler Transfektion der murinen Adenokarzinom-Zelllinie Panc 02 mit eGFP-, RFP- und Lumineszenz-Expressionsvektoren wurde deren Fluoreszenz-/Lumineszenz-, Proliferations- und Apoptoseverhalten in vitro evaluiert. Nach orthotoper Injektion in den Pankreaskopf wurde das Tumorwachstum und Metastasierungsverhalten in vivo über einen Zeitverlauf von 21 Tagen mittels Ganzkörper-Fluoreszenz-Imaging und MRT untersucht. Ergänzend erfolgten im Anschluss entsprechende Analysen zu Proliferation und Apoptose in situ anhand der explantierten histologisch und immunhistochemisch aufgearbeiteten Organe. Die murine Panc 02 Adenokarzinom-Zelllinie konnte mit einer Proliferationsrate von 88,4 % bei 0 % Apoptose in vitro als besonders aggressiv wachsende Adenokarzinom-Zelllinie charakterisiert werden. Die Ergebnisse änderten sich auch in situ kaum. Während das Fluoreszenz-Imaging hochspezifisch, kostengünstig, untersucherunabhängig und einfach auswertbar progredientes lokales Tumorwachstum mit deutlicher peritonealer Metastasierung nachweisen konnte, zeigte das MRT eine bessere anatomisch-topographische Auflösung ohne Interferenz mit Haut, Haaren und Narbengewebe bei jedoch geringerer Sensitivität und Spezifität. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Kryo-Histologie konnte anschließend ein Tumornachweis bis auf Einzelzellebene erbracht werden. Zwischen den beiden bildgebenden Verfahren des Ganzkörper-Fluoreszenz-Imagings und MRTs konnte ein komplementäres Bild aufgezeigt werden.
Neurogenese in adulten Ratten ist vor allem in der Subventrikularzone und im Gyrus dentatus des Hippocampus aktiv und kann durch gezielte Aktivierung nach einem Schlaganfall zu einer verbesserten Funktionalität führen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob auch in gealterten Ratten eine Stimulation der endogenen Neurogenese nach Schlaganfall die Erholung verbessert. Dazu wurde das Neurogenese-verstärkende Pentylentetrazol zum ersten Mal auf seine Wirkung nach Schlaganfall in einem gealterten Tiermodell untersucht. Dazu wurde in 12-Monate alten Sprague-Dawley-Ratten eine transiente fokale Ischämie per Okklusion der mittleren Hirnschlagader (MCAO) ausgelöst und die endogene Neurogenese mit subkonvulsivem Pentylentetrazol verstärkt. Die funktionelle Erholung wurde mit mehreren Verhaltenstests über einen Zeitraum von sieben Wochen überwacht. Nach dem Ablauf des Überlebenszeitraums wurde von den gewonnenen Hirngeweben eine globale Genexpressionsanalyse vom Infarktareal sowie immunhistochemische Färbungen für Zellproliferation und neuronale Vorläuferzellen im Infarktgebiet und der ipsilateralen Subventrikularzone durchgeführt. Die Verhaltenstests Acht-Arm-Labyrinth und Schräge zeigten eine signifikant verbesserte Erholung bei Tieren mit postischämischer Pentylentetrazolbehandlung. Die immunhistochemische Färbung für den Neurogenese-Marker Doublecortin ergab eine signifikante Steigerung der Neuroblastenanzahl in der Subventrikularzone. Im Infarktkerngebiet konnte signifikant mehr beta-3- Tubulin-positives axonales Aussprossen detektiert werden. Die globale Genexpressionsanalyse wies auf signifikante Veränderungen von Genen der Inflammationsreaktion und der Neurogenese hin. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass eine postischämische Stimulation der Neurogenese mit Pentylentetrazol auf die funktionelle Erholung einen positiven Einfluss hat.
Eine Maximalkomplikation der Sepsis stellt das Multiorganversagen dar, welches mit dem Auftreten einer disseminierten intravasalen Koagulopathie (DIC) und gleichzeitig einem letalen Endpunkt assoziiert ist. Es gibt bisher keine wirksame Therapie, zuletzt scheiterte die Anwendung von aktiviertem Protein C (APC) in klinischen Studien. Es fehlt an geeigneten Tiermodellen, um die Grundlagen der Pathophysiologie der DIC zu verstehen. Die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) stellt ein Modell der Schweren Sepsis dar. In der schweren Sepsis kommt es bei 37 % der Patienten zu einer DIC. Die klinischen Diagnosekriterien der DIC sollten im Mausmodell der CASP analysiert werden, um anschließend Untersuchungen zur Bedeutung des CC-Chemokinrezeptors 4 (CCR4) auf Thrombozyten für die DIC zu tätigen. Hierzu wurden zunächst durchflusszytometrische Untersuchungen zur Aktivierung des Thrombozyten in der Sepsis getätigt, welche zeigten, dass es zu einer vermehrten Ausschüttung von α-Granula im septischen Verlauf kam. Der Thrombozyt beteiligt sich anscheinend aktiv durch die Ausschüttung seines Sekretoms an den immunologischen Vorgängen einer Sepsis. Zusätzlich konnte mit molekularbiochemischen und proteinbiochemischen Methoden gezeigt werden, dass der Thrombozyt die Fähigkeit des Spleißens und der Proteinbiosynthese aus entwicklungsgeschichtlich jüngeren Zeiten konservierte. Im Modell der CASP zeigte die Wildtyp-Maus eine signifikant erniedrigte Thrombozytenzahl, erniedrigte Fibrinogenplasmaspiegel, Thrombozytenablagerung in der Leber und eine verlängerten extrinsische Gerinnungszeit. Diese Kriterien beschreiben das klinische Vorhandensein einer DIC. In den vergleichenden Untersuchungen des Ausmaßes der DIC der CCR4-defizienten Maus mit der Wildtyp-Maus konnten keine Unterschiede detektiert werden. Die CCR4-defiziente Maus hat einen Überlebensvorteil in der Sepsis trotz der klinischen Kriterien einer DIC. Sowohl der Fibrinogen-ELISA als auch die Immunfluoreszenzhistologien hatten methodisch bedingte Schwächen. Es bleibt jedoch festzuhalten, dass die vorgelegte Arbeit keinen negativen Einfluss des CCR4 auf die DIC detektieren konnte. Die Bedeutung der CCR4-vermittelten Aggregation des Thrombozyten für den Organismus bleibt unklar. Festzuhalten ist, dass das CASP-Modell geeignet ist um das klinisch-analytische Bild einer DIC in der Schweren Sepsis zu untersuchen. Vor dem Hintergrund mangelnder realitätsnaher Tiermodelle leistet dies einen Beitrag für weitere Forschung. Die Experimente zur mRNA-Regulation und Protein-Synthese bilden einen weiteren Baustein im Verständnis des Thrombozyten als kernlose Immunzelle. In ihrer Gesamtheit soll die vorgelegte Arbeit die Sichtweise auf Thrombozyten schärfen. Es handelt sich hierbei nicht um „Megakaryozytenzelltrümmer“, deren Funktion ausschließlich in der Blutgerinnung zu suchen ist. Vielmehr können Thrombozyten als eine Art Andenken an die Phylogenese des Immunsystems angesehen werden. Dreißigmillionen Jahre Entwicklungsgeschichte sind zwischen dem Amöbozyten und dem Thrombozyten vergangen und haben ein breites Rezeptor- und Mediatorrepertoire erhalten. Ob diese dem Organismus im Falle einer Sepsis nutzen oder eher schaden bleibt zu klären. Dass das Fehlen von Thrombozyten in bestimmten inflammatorischen Konstellationen einen Vorteil darstellt, ist auch für die abdominelle Sepsis untersucht. Die Depletion von Thrombozyten erzeugt eine 60 %-ige Verringerung des zellulären Ödems und des pulmonalen Schadens. In folgenden Untersuchungen soll das Modell der CASP genutzt werden um den Einfluss von Thrombozyten auf die DIC und das Überleben in der CASP zu untersuchen.
Die Auswirkungen eines abdominalchirurgischen Eingriffs auf das Immunsystem stellen im klinischen Alltag ein bedeutendes Problem dar. Ein operatives Trauma stört das Gleichgewicht des Immunsystems und verursacht eine Immundysfunktion. So ist die Mortalität einer postoperativ erworbenen Sepsis um ein Vielfaches höher als die einer spontan auftretenden. Deshalb sind dringend Modelle erforderlich, die es ermöglichen, die Mechanismen der postoperativen Immundysfunktion zu charakterisieren. Beim Intestinalen Manipulationsmodell (IMM), an der Universität Bonn ursprünglich als Ileusmodell konzipiert, wird bei eröffnetem Abdomen des Versuchstiers der Darm durch moderate Kompression manipuliert. Das simuliert die klinische Situation eines bauchchirurgischen Eingriffs. Unter der Fragestellung, ob sich IMM als Modell der postoperativen Immundysfunktion eignet, wurden verschiedene Parameter der systemischen Immunantwort untersucht. Um die Effekte durch die Manipulation des Darms darzustellen, verglichen wir verschiedene Schweregrade des operativen Traumas. In einem nächsten Schritt sollte geklärt werden, ob durch die Kombination IMM mit einem Sepsis-Modell, der problematische klinische Verlauf einer postoperativ auftretenden Sepsis simuliert werden kann. 1) Jede Form des chirurgischen Eingriffs führte zu einer Immundysfunktion. Dies konnte sechs Stunden postoperativ anhand einer erhöhten IL6-Konzentration im Serum, der supprimierten Sekretionsleistung stimulierter Splenozyten und einer Reduktion zirkulierender Lymphozyten gezeigt werden. Dabei war die Immunreaktion bei weitem nicht so schwer, dass eine gesteigerte Apoptoserate von Thymozyten beobachtet werden konnte. 2) Bei den genannten Effekten handelte es sich um weniger als drei Tage anhaltende Phänomene. Diese waren zudem abhängig vom Ausmaß des operativen Traumas, wie die protrahierte und verstärkte Zytokin-Sekretionsstörung stimulierter Splenozyten aus Mäusen mit dreimaliger Manipulation des Darms zeigte. 3) Die Überlebensrate einer postoperativ induzierten Sepsis war in den vor der Sepsisinduktion operierten Mäusen gegenüber den zuvor nicht operierten erhöht. Weiterhin unterschieden sich die operierten Gruppen voneinander abhängig vom Zeitpunkt der Sepsisinduktion. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IMM wichtige Merkmale einer postoperativen Immundysfunktion nachstellen kann. Zusätzlich erfüllt dieses Modell die Voraussetzungen, um die Auswirkungen einer postoperativ erworbenen Sepsis künftig untersuchen zu können.
Gegenstand: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die experimentelle Untersuchung eines mit verschiedenen Zusätzen modifizierten Calciumphosphatzementes an Minischweinen. Als Alternative zu autogenen Knochentransplantaten gewinnen Knochenersatzmaterialien zunehmend an Bedeutung. Der mit Chondroitinsulfat modifizierte Calciumphosphatzement soll für die Sanierung von Knochendefekten genutzt werden. Diese Arbeit untersucht die osteogene Potenz kleiner funktioneller Gruppen der extrazellulären Matrix wie Chondroitinsulfat. Material und Methode: Insgesamt wurden 40 Defekte an zehn adulten LEWE-Minischweinen im Unterkieferbereich gesetzt (4 Defekte pro Minischwein) und mit Knochenersatzmaterial gefüllt. Ein mit Eigenblut und autologer Spongiosa gefüllter Defekt wurde als Referenz genutzt. Die drei anderen Defekte wurden entweder mit Biozement D, mit Biozement D/Kollagen-I-Gemisch oder Biozement D/Kollagen-I/Chondoitinsulfat-Gemisch gefüllt. Alle drei Knochenersatzmaterialien basierten auf einem pastösen Hydroxylapatit-Zement-Gemisch. Die Versuchsauswertung erfolgte mittels histologischer Imageanalyse am unentkalkten Trenn-Dünnschliffpräparat. Alle zehn Tiere konnten nach komplikationsloser Einheilung nach drei Monaten einer histomorphometrischen Bewertung zugeführt werden. Der intraoperationem aushärtende Hydroxylapatit-Kollagen-I-Chondroitinsulfat-Zement zeigte osteokonduktive Materialeigenschaften. Die vom Defektrand ausgehende Resorption und knöcherne Substitution gestaltete sich außerordentlich rasch. Nach 3-monatiger Einheilzeit konnte bei Zweidrittel der Defektfläche ein knöchernes Remodeling nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen: Der neu entwickelte Hydroxylapatit-Kollagen-I-Chondroitinsulfat-Zement eignet sich als Knochenersatzmaterial am Tiermodell. Diese Schlussfolgerung basiert sowohl auf seiner guten knöchernen Integration und Resorption als auch durch seine gute Applizierbarkeit intra operationem. Der Zusatz von Chondroitinsulfat und Kollagen Typ I zu Calciumphosphatzementen führt zu einer statistisch signifikanten Steigerung des Knochenumbaus und der Knochenneubildung. Die vorliegenden Versuche belegen, dass durch Zugabe von Komponenten der extrazellulären Matrix wie Chondroitinsulfat die osteogene Potenz von Knochenersatzstoffen weiter gesteigert werden kann.
Beim Typ-1 Diabetes handelt es sich um eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die auf dem Zusammenspiel genetischer, immunologischer und umweltbedingter Faktoren beruht. Hilfreich bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Genloci sind diverse Tiermodelle, bei denen durch Kreuzungsstudien kongene Linien mit spontanen Rekombinationen im Bereich diabetes-suszeptibler oder diabetes-resistenter Genloci entstehen. Ein „Produkt“ solcher Kreuzungen ist die homozygote BB.6S m Rattenlinie, die obwohl Träger der diabetogenen Iddm1 und Iddm2 Genloci, nur eine T1D-Inzidenz von 10 % aufwies. Ursache für den diabetes-protektive Effekt war der alleinige chromosomale Austausch des diabetogenen Iddm4 Bereiches auf Chromosomen 6 der BB/OK Ratte durch den einer männlichen, diabetes-resistenten SH Ratte. Innerhalb dieser Arbeit sollten daher folgende Fragestellungen geklärt werden. 1. Ist die Iddm4 vermittelte Reduktion der Diabetesinzidenz auf die Expression eines oder mehrere potentieller diabetes-protektiver Gene zurückzuführen? 2. Wird das T1D Risiko durch den in diesem Bereich liegenden Imprintinglokus Dlk1-Dio3 beeinflusst? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine zweite kongene Rattenlinie generiert. Die BB.6S f Linie, deren Iddm4 Genlocus von weiblichen SH Ratten abstammte, zeichnete sich wie die BB.6S m durch eine massive Reduktion der T1D Inzidenz aus. Nur 13 % der BB.6S f Ratten entwickelten einen T1D. Bei der Analyse der Expression von Strukturgenen konnten keine einheitlichen Muster zwischen BB.6S m und BB.6S f Ratten im Bezug zu BB/OK Ratten detektiert werden. Erst die Analyse des Expressionsmusters von mikroRNAs, deren Gene im Iddm4 Bereich und hier insbesondere im Dlk1-Dio3 Gencluster lokalisiert sind, ergaben sich Hinweise auf die mikroRNAs mir-337, mir-345 und mir-299 als potenzielle Kandidaten für einen T1D Schutz. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob die T1D Inzidenz durch genomische Prägung der Gene des Dlk1-Dio3 Imprintingclusters beeinflusst wird: So sind auf dem väterlich vererbten Allel unter anderem die Gene Dlk1, Rtl1 und Dio3 aktiviert, während bei mütterlicher Abstammung Gtl2 und mikroRNAs exprimiert werden. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden heterozygote F1 Hybride aus den Kreuzungen (BB/OK x BB.6S m) und (BB.6S m x BB/OK) generiert. Die phänotypischen Daten belegen, dass die heterozygoten Tiere in der Regel eine höhere T1D Inzidenz aufwiesen, die zusätzlich in Abhängigkeit vom Geschlecht der Nachkommen und dem Vererbungsmuster zwischen 21 und 74 % variierte. Generell waren weibliche Nachkommen besser vor einem T1D geschützt als männlichen Nachkommen. Außerdem zeigte sich, dass die T1D Inzidenz niedriger war, wenn das SHR Allels väterlicherseits vererbt wurde. Diese Sachverhalte deuten einerseits auf eine Interaktion des Iddm4 Bereichs von Chromosom 6 mit dem biallelischen X-Chromosom hin. Eine weitere Analyse der Dlk1 Expression belegt, dass es beim Fehlen des paternalen SHR Allels überraschenderweise zu einer biallelischen Expression des Dlk1 Genes kommt. Dieser Effekt ist assoziiert mit dem Verlust der Iddm4 vermittelten T1D Protektion. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen zusammenfassend drei Aussagen zu. I. Es konnte unter Einsatz der beiden kongenen BB.6S Rattenlinien kein Gen identifiziert werden, das den durch den Iddm4 Bereich der SH Ratte vermittelten Diabetesschutz bewirkt. II. Die Diabetesinzidenz wird offensichtlich durch Interaktion zwischen Chromosom 6 und dem biallelischen X-Chromosom beeinflusst. III. Hier konnte erstmals tierexperimentell bestätigt werden, dass die Manifestation eines T1D durch Imprinting geprägt wird.