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Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zur Beantwortung der Forschungsfrage 1 Lagerungsversuche durchgeführt. Diese zeigten, dass bei einem Lagerungszeitraum von bis zu sieben Tagen die Intensität aller gefärbten Strukturen mit der Zeit abnahm. Die Abnahme der Intensität war bei den meisten angefärbten Strukturen bereits ab dem ersten Lagerungstag zu beobachten. Zudem zeigte sich, dass Thrombospondin nur mit EDTA-antikoaguliertem Blut darstellbar war. Mit Hilfe dieser Arbeit konnte aber nicht nur die Abnahme der Intensität über den Lagerungszeitraum nachgewiesen werden, sondern auch, dass es innerhalb des Lagerungszeitraum zu Veränderungen der Strukturverteilung der angefärbten Strukturen kam. Filamin A und NMMIIA lagen an Tag 0 fixiert und gefärbt noch diffus verteilt im Thrombozyten vor und stellten sich im Anschluss ab dem ersten Lagerungstag vermehrt als eine Ringstruktur dar. Veränderungen der Struktur über den Lagerungszeitraum fand sich ebenso bei ß1-Tubulin. Alle weiteren Strukturen blieben über den gelagerten Zeitraum unverändert.
Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit Blutausstriche nach ihrer Intensität und Struktur beurteilt, die an Tag 0 fixiert wurden und im Anschluss fixiert bis Tag 7 gelagert wurden. Erst nach der fixierten Lagerung bis zu dem entsprechenden Lagerungstag wurden die Blutausstriche gefärbt. Bei dieser Methode, der an Tag 0 fixierten Blutausstriche, zeigte sich eine stärkere Intensität der angefärbten Strukturen, als wenn sie unfixiert gelagert wurden.
Zur Beantwortung der Forschungsfrage 2 wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Visualisierung der Signalkaskade mit Hilfe von phosphorylierten Kinasen und der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch die Anfärbung der phosphorylierten Kinasen in der Fluoreszenzmikroskopie konnte keine ausreichende Sensitivität und Spezifität erreicht werden und wurde aus diesem Grund nicht weiterverfolgt. Der parallele Ansatz mit der Durchflusszytometrie zeigte hingegen erfolgreiche Ergebnisse. Mit Hilfe von Zeitreihen konnte der optimale Zeitpunkt der Inkubation mit den Induktoren vor der duchflusszytometrischen Untersuchung bestimmt werden. Dieser lag bei drei Minuten. Durch die Verwendung verschiedener Induktoren konnte eine Phosphorylierung der SRC-, SYK- und AKT1/2/3-Kinasen gezeigt werden. Bei der SRC-Kinase eigneten sich besonders TRAP-6, U46619 und Kollagen als potente Induktoren. Bei der SYK-Kinase waren es U46619, TRAP-6, Convulxin und ADP. Zusätzlich zeigte die SYK-Kinase in der Negativkontrolle die geringste Hintergrund-Phosphorylierung. Zur niedrigsten nachweisbaren Phosphorylierung kam es bei der AKT1/2/3-Kinase. Eine Induktion mit TRAP-6 zeigte dabei die für AKT1/2/3 stärkste Phosphorylierung. Durchflusszytometrisch war somit eine gute Darstellung der Phosphorylierung der verwendeten drei Kinasen durch kleinsten Blutmengen möglich.
Für die gezielten Inhibitionsversuche dieser Arbeit wurde unter anderem die Medikamentenfamilie der Sartane zur GPVI-Rezeptorinhibition verwendet. Es zeigte sich, dass besonders bei der Induktion mit U46619 und Verwendung eines Vertreters der Familie der Sartane bei allen drei Kinasen die Phosphorylierung der Kinase deutlich gesenkt werden konnte. Die Phosphorylierung lag durch die Inkubation (1 min) mit einem Sartan auf dem Niveau der Negativkontrolle. Bei Induktion mit Convulxin und Verwendung von Losartan steigerte sich hingegen die Phosphorylierung bei allen drei Kinasen. Bei durchflusszytometrischer Untersuchung von Patientenblut, bei in vivo-Einnahme von Telmisartan, konnte im Vergleich mit drei gesunden Spendern gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der SRC-Kinase bei Convulxin und Kollagen deutlich reduziert ist. In der Aggregometrie nach Born konnte bei allen verwendeten Sartanen eine Reduktion der Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden.
Die weiteren Versuche mit dem PAR4-Rezeptorblocker Vorapaxar, zeigte im Durchflusszytometer bei der AKT1/2/3-Kinase keine Reduktion. Stattdessen konnte hier in der höchsten verwendeten Konzentration, sogar eine Zunahme der Phosphorylierung beobachtet werden. In der parallel durchgeführten Aggregometrie nach Born zeigte sich hingegen eine komplette Hemmung der Thrombozytenaggregation.
Um festzustellen, ob Proben für die Untersuchungen mit dem Durchflusszytometer versendet werden können, wurden in einem letzten Schritt erneut Lagerungsversuche durchgeführt. Durch die verwendeten Lagerungszeiträume sollte die Dauer, die durch den Transport bei einer Zentralisierung zustande kommt, imitiert werden. In dem durchgeführten Untersuchungsansatz war eine Lagerung über den Tag 0 nicht möglich. Zu einem späteren Zeitpunkt waren nur noch wenige bis keine Thrombozyten nachweisbar.
Als Teil der TRP-Ionenkanalfamilie handelt es sich bei dem TRPV4 um einen nicht selektiven Kationenkanal mit einer höheren Spezifität gegenüber Kalziumionen im Ver-gleich zu anderen Kationen. Dieser Kanal ist bereits in einer Vielzahl von Geweben mit unterschiedlichen Funktionen beschrieben worden, über seine genaue Funktion in der quergestreiften Muskulatur ist jedoch bisher wenig bekannt. Untersuchungen an Dystrophin-defizienten-Mausmuskelfasern – einem Modell für die Muskeldystrophie vom Typ Duchenne – zeigten einen erhöhten intrazellulären Kalzi-umgehalt auf, der für die pathogenetischen Veränderungen wie Muskelzellnekrosen und verstärkter Fibrosierung im Rahmen dieser Erkrankung verantwortlich gemacht wird. Durch seine hohe Ionenselektivität und dadurch bedingte Einflussnahme auf die Kalzi-umhomöostase ist eine Beteiligung des TRPV4 in diesem Zusammenhang denkbar. Pritshow et. al. konnten zudem zeigen, dass der TRPV4 Kanal in quergestreifter Musku-latur eines Wildtyp-Mausmodells unter gezielter Stimulation positiven Einfluss auf die maximale Kraftentwicklung und Ermüdungserscheinungen nimmt. Auf Basis dieser Erkenntnisse sind in der vorliegenden Arbeit elektrophysiologische Untersuchungen des TRPV4 Kanals mit den spezifischen Kanalaktivatoren 4α-PDD und GSK1016790A an isolierten TRPV4 Wildtyp-und Knockout-Skelettmuskelfasern der Maus durchgeführt worden. Untersuchungsgegenstand waren dabei mittels Kalium-chlorid induzierte Kalziumtransienten, die sich unter dem Einfluss der TRPV4 Kanalak-tivität veränderten. Die Ergebnisse zeigten, dass 4α-PDD in Wildtyp-Skelettmuskelfasern zu einer höheren Offenheitswahrscheinlichkeit des TRPV4 und damit auch zu einem vermehrten Ein-strom an Kalziumionen, erkennbar am langsameren Abklingen des Transienten, führt. Im Gegensatz dazu führte die Stimulation mit 4α-PDD in TRPV4 Knockout-Skelettmuskelfasern zu einem schnelleren Abklingen des Transienten im Vergleich zur Kontrolle – ein Effekt, der bis dato in der Literatur nicht erklärt werden kann. Des Wei-teren erreichten die induzierten Kalziumtransienten schneller das Maximum, Grund hierfür könnte eine mögliche Gegenregulation anderer TRP-Kanäle sein. Die Anwendung des selektiven TRPV4 Kanalaktivators GSK1016790A ergab keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zur unstimulierten Situation. Da es bisher keine Daten zur Verwendung von GSK1016790A im Zusammenhang mit Skelettmus-kelfasern gibt, die zum Vergleich herangezogen werden konnten, sind Aussage-und Interpretationsmöglichkeiten bezüglich Validität und Reliabilität begrenzt. Die Einflussnahme des TRPV4 auf die gemessenen Kalziumtransienten und der dadurch erzielten Modulation der Kalziumhomöostase in isolierten Skelettmuskelfasern ist durch die Ergebnisse belegt. Welche Interventionsmöglichkeiten sich damit bezüglich der Duchenne Muskeldystrophie ergeben, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
Hintergrund: LOX-1, ein Rezeptor für oxidiertes Low-Density Lipoprotein, wird von Endothelzellen, Makrophagen, vaskulären glatten Muskelzellen und anderen Zellen exprimiert. Seine Expression kann durch oxidiertes LDL (oxLDL), Angiotensin II, inflammatorische Zytokine (zum Beispiel Tumornekrose-Faktor alpha), Scherkräfte am Endothel und andere Faktoren induziert werden. LOX-1 ist bei der Entstehung von oxidativem Stress und der endothelialen Dysfunktion beteiligt und trägt vermutlich zur Instabilität von atherosklerotischen Plaques bei, was bei Patienten mit einer koronaren Herzkrankheit zum akuten Koronarsyndrom führen kann. Material und Methoden: Untersucht wurden Atherektomieproben von 37 Patienten (Alter 62,5 ± 9,7 Jahre, Body-Mass-Index 28,6 ± 5,3 kg/m2), die sich zwischen Juli 2001 und April 2005 wegen Brustschmerzen/Angina pectoris einer medizinisch indizierten Koronarangiographie mit in gleicher Sitzung durchgeführter Direktionaler koronarer Atherektomie (DCA) in der Klinik für Innere Medizin B der Universitätsmedizin Greifswald unterzogen hatten. Die in der DCA gewonnenen Atherektomieproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren, am Kryotom (Leica C19) ohne aufzutauen geschnitten (Schnittdicke 5 Mikrometer) und mit Hämatoxylin/Eosin (H.E.), Ölrot O (für Lipide), Elastica-van Gieson (für Kollagen) und von-Kossa (für Verkalkungen) gefärbt. Die LOX-1 Expression wurde durch ein Immunfluoreszenz-Verfahren mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper, der gegen die Aminosäuren 143 bis 273 des humanen LOX-1 Proteins gerichtet war, und einem FITC-markierten Sekundärantikörper nach dem ELISA-Prinzip (Enzyme-linked immunosorbent Assay) nachgewiesen. Die digitalen Aufnahmen wurden mit Corel PHOTO-PAINT 12, Scion Image und SigmaPlot 11 analysiert. Die LOX-1 Signalintensitäten wurden mit dem in der Koronarangiographie ermittelten Stenosegrad der betreffenden Plaques, dem Lipidgehalt in der Plaque und anderen Patientenparametern (z.B. Vorliegen eines akuten Koronarsyndroms) verglichen. Zur statistischen Analyse wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt und der Mann-Whitney-Rank-Test durchgeführt. Ergebnisse: Die LOX-1 Expression korrelierte mit dem Lipidgehalt der humanen koronaren Atherektomieproben, jedoch im Mittel statistisch nicht signifikant (p=0,056). Im Trend war die LOX-1 Expression in den Proben von Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom (n=11), bei Männern (n=26) und Rauchern (n=15) höher und in Patienten, die HMG-CoA-Reduktase-Hemmer einnahmen (zum Beispiel Simvastatin), niedriger (n=16). Keine Korrelationen fanden sich zwischen LOX-1 Expression und Stenosegrad, Plaquelokalisation, Alter, Body-Mass-Index, Arterieller Hypertonie (n=31), Diabetes mellitus Typ II (n=9) und Dyslipoproteinämie (n=32). Schlussfolgerungen: Die LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques ist positiv mit dem Lipidgehalt der Plaques assoziiert und ist im Trend höher in Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom. Eine hohe LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques könnte zu deren Instabilität somit zum Auftreten eines akuten Koronarsyndroms beitragen. Die Senkung des LDL-Angebots in der Arterienwand und Wege zur Plaquestabilisierung bei manifester Atherosklerose bleiben wichtigste Therapieziele.