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Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Verfahren zur morphometrischen Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Biomaterialien stellt eine reproduzierbare, vielfältig anwendbare Methode dar. Das Programm ImageJ ermöglicht ein einfaches, modifiziertes Adaptieren dieses Analyseverfahrens an verschiedene immunhistochemische Untersuchungen. Die Anwendung des etablierten manuellen Zählverfahrens ermöglichte in den nachfolgenden Untersuchungen den Nachweis, dass das Konzept der Beschichtung von Implantatmaterialien mit einer biomimetischen Membran, basierend auf dem Phospholipid POPE, keine negativen Einflüsse auf die akute und chronische Entzündungsreaktion im das Implantat umgebenden Gewebe zeigte. Die Herstellung von biomimetischen Oberflächen als Implantatbeschichtung, die von den Zellen als körpereigen erkannt wird, könnte somit die langfristige Integration des Implantats in den Wirtsorganismus verbessern. Zusammen mit den In-vitro-Ergebnissen [Willumeit et al., 2007], in denen günstige Auswirkungen dieser Beschichtung auf Zell- und Bakterienadhäsion nachgewiesen wurden, zeigen die In-vivo-Befunde der vorliegenden Arbeit das Potential von Phospholipidbeschichtungen zum Erreichen von lang andauernder Integrität und Biofunktionalität metallischer Implantate in der klinischen Anwendung.
Ziel der Arbeit war die Untersuchung der lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen nach intramuskulärer Implantation von Niedertemperatur-Plasmapolymer-modifizierten Titanplättchen (Ti) im Tiermodell Ratte. Ausgangspunkt dafür waren vorherige Zellkultur-Untersuchungen zu Ti-Proben mit einer positiv geladenen Schicht aus plasma-polymerisiertem Allylamin (PPAAm) beziehungsweise einer negativ geladenen Schicht aus plasma-polymerisierter Acrylsäure (PPAAc). Diese In-vitro-Studien ergaben für eine Beschichtung mit PPAAm positive Effekte auf das Wachstum von Osteoblasten sowie für eine Beschichtung mit PPAAc auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen. Für die darauf aufbauenden in dieser Arbeit durchgeführten In-vivo-Untersuchungen war es zunächst notwendig, eine Methode zur quantitativen histologischen Untersuchung der lokalen Gewebsreaktionen nach Implantation von Ti-Proben zu etablieren. Deren Evaluierung zeigte eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und damit die Eignung des Bildanalyse-Verfahrens für die weiteren Untersuchungen. Anschließend erfolgten unter Anwendung dieser Methode morphometrische immunhistochemische Untersuchungen der lokalen Entzündungsantwort nach intramuskulärer Implantation von PPAAc- und PPAAm-beschichteten Ti-Plättchen. Hierzu wurden in einer ersten Studie für beide Beschichtungen die Gesamt-Monozyten und -Makrophagen sowie die MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen im Periimplantatgewebe nach 56 Tagen Implantationsdauer im Vergleich zu unbeschichteten Kontrollproben untersucht. Dabei ergab sich für die PPAAc-beschichteten Ti-Plättchen im Vergleich zu PPAAm-beschichteten Implantaten und Kontrollen eine verstärkte chronische Entzündungsreaktion. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in einer anschließenden zweiten Studie für drei verschiedene PPAAm-Beschichtungen, die sich hinsichtlich der Plasmaprozessparameter im Duty cycle unterschieden, die Gewebsreaktionen im Kurz- und Langzeitverlauf analysiert. Dafür erfolgte eine Untersuchung der Gesamt-Monozyten und -Makrophagen, der gewebsständigen Makrophagen, der T Lymphozyten und der MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen 7, 14 und 56 Tage nach Implantation für diese drei PPAAm-Varianten im Vergleich zu Kontrollen. Im Ergebnis waren die lokalen Gewebsreaktionen für die zwei PPAAm-Varianten mit dem höheren Duty cycle im Langzeitverlauf schwächer ausgeprägt als für die PPAAm-Schicht mit dem geringen Duty cycle und die Kontrollen. Dieses Ergebnis stand im Einklang mit entsprechenden Unterschieden in den physikochemischen Schichteigenschaften wie zum Beispiel der Schichtdicke, der Aminogruppendichte und der Proteinadsorption. Darüber hinaus wurden das Serumprofil und die Korrelationen der pro-inflammatorischen Zytokine IL-2 und IFNγ sowie der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 vor sowie wöchentlich für 56 Tage nach Implantation von PPAAc-und PPAAm-beschichteten Implantaten sowie Kontrollen analysiert. Diese Untersuchungen ergaben für die PPAAc-Gruppe in der Spätphase einen gegensätzlichen Verlauf von IL-4 und IL-10 sowie abweichende Korrelationen des IL-10 mit den anderen untersuchten Zytokinen, während in der PPAAm-Gruppe die systemischen Reaktionen und die Korrelationen zwischen den untersuchten Zytokinen mit den Befunden in der Kontrollgruppe vergleichbar waren. Die Gesamtbetrachtung der in dieser Arbeit erhobenen In-vivo-Ergebnisse mit den vorherigen In-Vitro-Befunden zeigt, dass eine positiv geladene PPAAm-Beschichtung einen vielversprechenden Ansatz zur Erzeugung von zelladhäsiven Implantatoberflächen mit dem Ziel einer Verbesserung des Einwachsens von Ti-Implantaten darstellt. Darüber hinaus konnte für die PPAAm-Beschichtung gezeigt werden, dass Variationen in den Plasmaprozessparametern zu Unterschieden in den physikochemischen Eigenschaften und den daraus resultierenden In-vivo-Gewebsreaktionen führen. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in vier wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht (Walschus et al. 2011 J Microsc 242:94–99; Schröder et al. 2010 J Adh Sci Technol 24:1191–1205; Hoene et al. 2010 Acta Biomater 6:676–683; Walschus et al. 2012 J Mater Sci Mater Med 23:1299–1307).
Die initiale Integration von Implantaten ist von hoher Bedeutung für die spätere Stabilität und
Standzeit von beispielsweise Endoprothesen im Körper. Mit Hinblick auf die steigende Zahl
von Patienten, die ein Implantat benötigen, ist es von großer Bedeutung unterschiedliche
Implantatmaterialien und Oberflächenmodifizierungen bezüglich ihrer Eigenschaften und
Interaktionen mit dem Implantatlager zu untersuchen, um diese verbessern zu können.
Ziel der vorgestellten Arbeit war die Entwicklung und Etablierung eines Screeningmodells zur
Analyse der Auswirkung von verschiedenen Metallimplantaten auf die Mikrozirkulation in
unmittelbarer Nähe des Implantats.
Dazu wurde ein neues in vivo Modell an der Chorioallantoismembran des Hühnerembryos
entwickelt, angewendet und etabliert. Dieses stellt eine Modifikation des seit Jahrzehnten
etablierten HET-CAM (Hühnereitest an der Chorioallantoismembran) dar und ermöglicht
quantitative und qualitative intravitalmikroskopische Aussagen über die Funktionelle
Gefäßdichte (FGD) und die Leukozyten-Endothel-Interaktion (LEI).
Zunächst wurden im Zuge der Modellanwendung Nickel- und Titan-Implantate verglichen, um
die mögliche Reaktionsbreite des Modells zu untersuchen. Es folgte eine Etablierung des
Modells, indem die Oberfläche der Implantate kurz vor der Applikation mit kaltem
Atmosphärendruckplasma (CAP) behandelt wurde. Die intravitalmikroskopische
Untersuchung erfolgte jeweils 24 h nach Applikation.
Die Chorioallantoismembran der mit Nickel-Implantaten behandelten Hühnerembryonen
zeigte im Vergleich zur Titan- und der internen Kontrollgruppe eine signifikante Reduktion der
FGD sowie eine signifikante Erhöhung der LEI gegenüber der Kontrollgruppe. Durch
Vorbehandlung der Nickel-Implantate mit CAP konnte der Negativeffekt auf das Gefäßsystem
signifikant reduziert werden. Für Titanimplantate konnte mit Hinblick auf die FGD kein
zusätzlicher Effekt nach der Behandlung mit CAP detektiert werden.
Die vorgestellte Arbeit zeigt, dass sich das neue Modell als Screeningmodell dazu eignet, neue
Implantatmaterialien und Oberflächenmodifikationen an der Schwelle zwischen in vitro
Zellkultur und in vivo Tiermodellen zu untersuchen. Somit könnte es dabei helfen,
Tierversuche gezielter einzusetzen. Vorteile und Einschränkungen des Modells werden
diskutiert.
Das Material Titan wird Aufgrund seiner biokompatiblen Eigenschaften für orthopädische und dentale Implantate eingesetzt. Neben der erfolgreichen Implantation kommt es jedoch in manchen Fällen zu Komplikationen. Ein Grund für die Komplikationen können Kohlenwasserstoff-Kontaminationen auf der Titanoxid-Oberfläche sein. Diese aus der Luft stammenden Kontaminationen wurden im Rahmen dieser Arbeit analysiert und deren Einfluss auf die Adsorption von Aminosäuren studiert. Als Modellsystem wurden Alkohole gewählt, da deren Konzentration in der Krankenhausluft stark erhöht ist. Zur Analyse der Adsorption auf Titanoxid wurden Isothermen im Druckbereich von 10^-6 bis 10^4 Pa mit Alkoholen und Wasser gemessen. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die Adsorption der Alkohole bei geringerem Druck (10^-6 Pa) beginnt als die des Wassers (10^-4 Pa). Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass sowohl das Wasser als auch die Alkohole schon bei Drücken adsorbieren, die unterhalb der Partialdrücke der jeweiligen Substanz in der Atmosphäre liegen. Zur Ermittlung der zugehörigen Adsorptionsenergien wurden die Daten an die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Brunauer-Emmet-Teller-Freundlich-Isotherme (BFI) angepasst. Die BFI unterscheidet sich von der klassischen Freundlichisotherme in der Beschreibung der lokalen Isothermen der heterogenen Oberfläche. So ist die klassische Freundlich-Isotherme durch eine Summe von Langmuir-Isothermen gegeben, wobei die BFI durch die Summation von lokalen BET-Isothermen entsteht. Aus der Anpassung der Rohdaten folgt, dass die Adsorptionsenergie der ersten Monolage für die Alkohole 95 kJ/mol ist und die Adsorptionsenergie des Wassers im Intervall zwischen 70 und 95 kJ/mol liegt. Sowohl der geringe Druck, bei dem Adsorption statt findet, als auch die Adsorptionsenergien zeigen, dass die Adsorption von Alkoholen aus der Luft an Titanoxid-Oberflächen thermodynamisch günstig ist. Zur Analyse der Haftstärke wurden die Alkohole des Modellsystems von der feuchten Titanoxid-Oberfläche desorbiert. Hierzu wurde die Technik der Thermischen Desorptions Spektrometrie (TDS) angewendet. Dabei wird die TiO2- Oberfläch konstant erhitzt und zu jeder Temperatur ein Massenspektrum der Desorbatgasphase gemessen. Damit im Spektrum zwischen der Oberflächenfeuchtigkeit und den Hydroxylfunktionen aus dem Alkohol unterschieden werden konnte, wurde zuerst D-Wasser und danach der Analyt-Alkohol an die Oberfläche adsorbiert. Aus den Daten der TDS wurden dann die Hauptreaktionen ermittelt und festgestellt, dass die kleinen Moleküle D2O, Methanol und Ethanol signifikant molekular desorbieren wohingegen Propanol und Butanol verstärkt zur Fragment-Desorption neigen. Beim Vergleich der Desorption der Alkohole mit Wasser wurde ermittelt, dass die Oberflächenfeuchtigkeit bei geringerer Temperatur beginnt zu desorbieren als die Alkohole. Bei erhöhter Temperatur über 600 K wurden die Desorptionsreaktionen durch den Zerfall der Desorbate überlagert. Um diese Ergebnisse quantifizieren zu können, wurden die Daten mit dem neu entwickelten RED1-Modell (Desroption mit überlagerter Reaktion) angepasst. Die Ergebnisse der Anpassung sind die Desorptionsenergien für die Alkohole (~162 kJ/mol) und für die Oberflächenfeuchtigkeit (~138 kJ/mol). Aus den Desorptionsenergien geht klar hervor, dass der Alkohol stärker an der TiO2-Oberfläche haftet als das Wasser und somit die Desorption unter physiologischen Bedingungen nicht zu erwarten ist. Außer den Desorptions-Energien wurden die Arrhenius-Parameter der Zerfallsreaktion ermittel. Diese liegen für die Alkohole und das Wasser in der gleichen Größenordnung (k0,rkt=0.07-7.22 s-1 und Erkt=26.91-43.33 kJ/mol). Zum Ende der Arbeit wurde der Einfluss der Kohlenwasserstoffschicht auf die Adsorption von Aminosäuren untersucht. Hierzu wurden die Oberflächen mit verschiedenen Methoden gereinigt, so dass die Adsorption auf der mit Kohlenwasserstoffen kontaminierten Oberfläche mit der Adsorption auf Oberflächen mit reduziertem Kohlenwasserstoffanteil verglichen werden konnte. Die Messungen zeigen, dass die Änderungen der Bedeckungen bei Adsorption auf kontaminierten Oberflächen kleiner sind als auf Oberflächen mit reduziertem Kohlenwasserstoff-Anteil. Dieser Effekt scheint in der Seitenkette der Aminosäure begründet zu sein. Die Kontamination scheint somit die Adsorption von Biomolekülen zu behindern. Unabhängig von dieser Arbeit konnten G. Müller et. al. zeigen51, dass mehr Zellen des Modellstamms für humane Osteoblasten MG63 auf der Oberfläche einer Titanlegierung gebunden werden, wenn der Kohlenwasserstoff-Anteil auf der Oberfläche reduziert ist. Da beide Arbeiten unabhängig und mit unterschiedlichen Methoden ein vergleichbares Ergebnis liefern, kann davon ausgegangen werden, dass die Luft im Operationssaal einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg der Implantation hat.
Zusammenfassung Entsprechend der Fragestellung der vorliegenden Arbeit war es Ziel, den Metall-Keramik- Verbund von vier Titankeramik-Systemen mit denen konventionell erprobter Metall- Keramiksysteme (NE- und hochgoldhaltiger Legierungen) unter Berücksichtigung unterschiedlicher Oberflächenkonditionierungen mittels ISO-Biegetest nach DIN 9693 (1990) zu vergleichen, um darzustellen, ob die Haltbarkeit nach keramischer Verblendung genauso sicher zu bewerten ist, wie von den Nichtedelmetall- und Edelmetall-Systemen bekannt. Es wurden zu diesem Zweck gegossene Probekörper in den Abmessungen 0,4 x 5 x 30 mm aus Reintitan Grad 1 (Dentaurum, Ispringen) entsprechend des ISO-Biegetestes erstellt und mit den Verblendkeramiken Vita- (VITA, Bad Säckingen), Duceratin- (Ducera, Rosbach), Tibond- (Detrey, Dreieich) sowie Tyspar-Titankeramik (Jeneric Pentron Deutschland, Kusterdingen) nach Herstellerangaben verblendet. Als Vergleichssysteme kamen die Legierungen Wiron 88, Wiron 99 (beide BEGO, Bremen) und D egudent U (DeguDent, Hanau) mit den Verblendkeramiken Vita VMK 68 und Vita Omega (beide VITA, Bad Säckingen) zum Einsatz. Als Oberflächenkonditionierungen pro Metall-Keramik-System mit je 10 Testkörpern kamen Sandstrahlungen mit 50 μm, 125 μm und 250μm, eine nur plangeschliffene Oberfläche mit einer 1200er Metallografie-Nassschleifscheibe (NSS), eine mit Rocatec (3M-ESPE, Seefeld) und eine mit 250 μm sandgestrahlte und mit Silicoater MD (Heraeus-Kulzer, Haunau) vorbereitete Oberfläche zur Anwendung. 1.) Die untersuchten Titan-Keramik-Systeme haben den Test nach ISO 9693 nicht bestanden. Wurde die Auswertung mit dem REM statt im Lichtmikroskop durchgeführt, stiegen die Bedeckungsgrade erheblich, führten aber nur bei der Kombination Duceratin-Titan (MKK 2) zum Bestehen des Testes mit mehr als 50 % Bedeckungsgrad im mittleren Probendrittel. 2.) Die getesteten Titan-Keramik-Systeme erreichten in der lichtmikroskopischen Auswertung signifikant nicht die Bedeckungsgrade von konventionellen und bewährten Metall-Keramik- Systemen auf NEM- (MKK 5 – MKK 7) und EM-Basis (MKK 8 – MKK9). 3.) Der Einfluss konventioneller Konditionierungsverfahren (Sandstrahlen) der Metalloberfläche war bei lichtmikroskopischer Auswertung signifikant gegenüber Oberflächenvorbereitungen mit „Silicoater MD“, „Rocatec“ und „1200er NSS“ auf die Keramikbedeckung bei den Titanverblendsystemen (MKK 1 bis MKK 4) und den NEM- Systemen (MKK 5 – MKK 7). Erfolgte die Auswertung im REM war auch bei der Kombination Duceratin-Titan (MKK 2) eine Bedeckung zwischen ca. 70 bis 80 % für „Silicoater MD“ und „Rocatec“, bei den NEM-Systemen (MKK 5 – MKK 7) ein Bedeck- ungsgrad zwischen ca. 90 bis 100 % zu messen. Die EM-Systeme (MKK 8 – MKK9) zeigen im LiMi eine signifikant niedrigere Bedeckung, sind in der REM-Auswertung jedoch unbeeinflusst. 4.) Tribochemisch anorganische Strahlbeschichtung (Rocatec) und organisch silikatische Konditionierung (z.B. Silicoater MD) verschlechtern den Metall-Keramikverbund; außer bei NE- und NEM-Legierungen signifikant und sind daher abzulehnen. 5.) Eine alleinige lichtmikroskopische Auswertung der abgescherten Oberflächen erbringt keine sichere Aussage über den realen Bedeckungsgrad und die Bruchcharakteristik. Von der LiMi-Auswertung des Bedeckungsgrades indirekt ohne metrische Werte auf den Verbund zu schließen, muss unter wissenschaftlichen Gesichtspunkten abgelehnt werden. 6.) Der ISO-Biegetest war von seiner Durchführung zwar in Bezug auf die Probekörperherstellung standardisierbar, nicht aber in allen Einzelheiten der Testdurchführung, was Druck, Biegegeschwindigkeit und Einfluss des E-Moduls betrifft. Der Verbund Metall-Keramik wurde über den Bedeckungsgrad definiert, somit ist kein Rückschluss auf die Verbundqualität möglich. Eine lichtmikroskopische Auswertung der verbliebenen Keramikbedeckung erbrachte signifikant schlechtere Werte als die REM- Auswertung. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Titan-Keramik-Systeme den originären Biegetest nach alter ISO-Norm nicht bestehen und damit im Widerspruch zu anderen Tests, z.B. Schwickerath-Test aus aktueller Norm und der täglichen Praxis stehen. Mit unter 10 % Keramikbedeckung auf den Verbundflächen besteht ein signifikanter Unterschied zu den konventionellen NE- und NEM-Legierungen.
Die demographische Entwicklung stellt uns besonders in der Unfallchirurgie vor neue Herausforderungen. Häufig handelt es sich um multimorbide, sehr alte Patienten, was eine möglichst gering invasive Versorgung von Frakturen attraktiv erscheinen läßt. Cerclagesysteme werden zur Versorgung von Periimplantatfrakturen bisher nur additiv eingesetzt. Als Grundlage für die biomechanische Untersuchung dient eine klinisch häufig festtgestellte Periimplantatfraktur am distalen Pol eines einliegenden Gamma-Nagels. Im Rahmen einer Pilotstudie sollte festgestellt werden ob bei genau dieser Fraktur (unkomplizierter langer Schrägbruch) eine alleinige Versorgung durch Cerclagen ausreichend Primärstabilität bietet. Hierzu wurden die zwei in der Klinik verwendeten Cerclagesysteme Edelstahldrahtcerclagen und Titanbandcerclagen gegenübergestellt. Die Versuch erfolgten an 8 paarigen Kadaverfemora. Nach Implantation des Gamma-Nagels und Osteotomie im typischen Frakturverlauf wurden die künstlichen Periimplantatfrakturen durch 3 Titanbandcerclagen oder 3 Edelstahldrahtcerclagen versorgt. Anschließend erfolgten statische, zyklische und destruktive Belastungstests. In der Auswertung konnten keine signifikanten Unterschiede in der Bruchspaltveränderung beider Cerclagensysteme festgestellt werden; beide Cerclagesysteme weisen somit eine gleiche Primärstabilität auf. Es kam zu keinem Versagen eines Cerclagesystems. Eine isolierte Versorgung durch Cerclagen der untersuchten Periimplantatfraktur erscheint bei vorliegenden Messwerten vielversprechend.