Refine
Year of publication
- 2015 (1) (remove)
Language
- German (1) (remove)
Keywords
- pUL34 (1) (remove)
WĂ€hrend des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzuklĂ€ren und funktionelle DomĂ€nen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgefĂŒhrte Analysen konnten zeigen, dass die TransmembrandomĂ€ne des pUL34, die fĂŒr die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion wĂ€hrend des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen AminosĂ€uren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler AminosĂ€uren zum Funktionsverlust des Proteins fĂŒhrt. Zur Identifikation möglicher funktioneller DomĂ€nen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen AminosĂ€uren schrittweise verkĂŒrzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale AminosĂ€uren keine BeeintrĂ€chtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 AminosĂ€uren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die AminosĂ€uren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz fĂŒr den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgefĂŒhrte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen HĂ€lfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgefĂŒhrte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 AminosĂ€uren fĂŒr die Interaktion mit pUL31 und damit fĂŒr die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-InteraktionsdomĂ€ne auf den Bereich von AminosĂ€ure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger AminosĂ€uren oder Motive innerhalb der InteraktionsdomĂ€ne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte AminosĂ€uren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion wĂ€hrend einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die fĂŒr die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer GlutaminsĂ€ure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell fĂŒr die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. FĂŒr ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G fĂŒr die Funktion des NEC wichtig sind. ZusĂ€tzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht fĂŒr die Bildung des NEC benötigt wird, aber fĂŒr die Funktion wĂ€hrend des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins bestĂ€tigt werden. AuĂerdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran wĂ€hrend des Kernaustritts spielt. HierfĂŒr wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern möglicherweise auch fĂŒr eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-MolekĂŒlen wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen fĂŒr die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend fĂŒhrten die hier durchgefĂŒhrten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren VerstĂ€ndnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle DomĂ€nen zu identifizieren. Die AufklĂ€rung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgefĂŒhrten Mutagenesestudien das VerstĂ€ndnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.