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In many industrial sectors biotechnological production processes have replaced pure chemical methods and allowed new, ecologically friendly and enzyme-based processes. Microorganisms, such as modified Bacillus strains are used in particular for the industrial enzyme synthesis. The two organisms Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus are of great industrial importance. B. licheniformis is able to secrete proteins in large amounts, while B. pumilus shows high resistance to oxidative stress. During production processes different conditions can occur that affect the physiology of the production hosts and may result in a quantitative, but also a qualitative impairment of the products. This influence is based on e.g. chemical processes, the setting of temperature, pH, or oxygen availability and can lead to various stress situations for the bacteria. Cells respond to changes in their environment by sensing stressors and initiate a response to the stress, which is usually implemented by an induction or derepression of various regulons. In order to conduct an optimal production process, the metabolism and stress responses of the utilized bacteria should be known exactly. The aim of this study was to analyze of the stress response of B. licheniformis to heat and salt stress, and the stress response of B. licheniformis and B. pumilus to oxidative stress. These analyses were performed at the level of transcriptomics using cDNA microarrays, which is the most direct and global method for the analysis of changes in the physiology of a cell. The identification of stress specific markers genes and their differentiation from the SigB regulated general stress response has been another purpose of this work. Knowledge of these marker genes enables a prompt analysis of the fermentation conditions and thus a possible optimization of the process. The transcriptome analyses of this work show that B. licheniformis responds to heat stress by the induction of heat shock genes belonging to different regulons. These include the htpG gene, the HrcA regulon or the CtsR regulon, encoding chaperones and proteases, which mainly contribute to the protein quality control. The heat stress response of B. licheniformis revealed no fundamental differences to the heat stress response of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. The general stress response (SigB regulon), which is activated by heat stress, could be analyzed in more detail by the study of a ΔsigB mutant of B. licheniformis. Salt stress also provokes a strong induction of the general stress response in B. licheniformis. Genes for the transport and synthesis of compatible solutes were strongly induced, as well as several genes for transport systems with more or less known functions. The synthesis of the osmoprotective metabolites proline and glycine betaine could be verified in more detail by a metabolomics approach. The response to oxidative stress showed differences between both B. licheniformis and B. pumilus, and also to the oxidative stress response of B. subtilis. In B. licheniformis, the genes of the glyoxylate cycle are induced during oxidative stress. An activation of the glyoxylate bypass under oxidative conditions could be confirmed by a metabolome analysis of B. licheniformis. In addition, the PerR regulon of B. licheniformis is extended to include another two genes compared to B. subtilis. In contrast, several genes of the PerR regulon lack in the genome of B. pumilus, such as katA (vegetative catalase) or ahpCF (alkyl hydroperoxide reductase). However, other genes were induced in B. pumilus that were upregulated under oxidative stress conditions neither in B. subtilis nor in B. licheniformis. In addition, known regulons, regulated by e.g. Spx, CtsR or SOS were induced in both organisms. In summary, this dissertation transcriptionally analyzes the stress responses of B. licheniformis to heat, salt and oxidative stress, and in addition the oxidative stress response of B. pumilus. Several stress-specific regulons were identified in both, B. pumilus and B. licheniformis, which also correspond to the stress response of B. subtilis. However, it was possible to additionally assign genes to the stress specific responses of both organisms and to find differences, such as the absence of parts of the PerR regulon of B. pumilus, or the activation of the glyoxylate pathway in B. licheniformis during oxidative stress.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.