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Zusammenfassung
Die Verordnung einer Stressulkusprophylaxe im Rahmen stationärer Aufenthalte ist im medizinischen Alltag weit verbreitet. Die Verschreibungspraxis einer SUP wurde bisher vor allem im Bereich der Intensivmedizin und der Inneren Medizin untersucht [33, 40, 42, 45, 46]. Allerdings konnte gezeigt werden, dass eine stressulkusbedingte gastrointestinale Blutung unter stationären Bedingungen ein sehr seltenes Ereignis darstellt [12,17]. Im Bereich chirurgischer, nicht kritisch erkrankter Patienten gibt es bislang nur wenige Studien zur aktuellen Praxis der Verschreibung einer SUP [16, 46].
Um die aktuelle Verschreibungspraxis einer SUP in einem chirurgischen Patientenkollektiv beschreiben und bezüglich des Vorliegens einer Indikation nach aktuellen Leitlinien charakterisieren zu können, wurden retrospektiv von Januar bis Juni 2016 Patientendaten an der Universitätsmedizin Greifswald erhoben und ausgewertet [49]. Des Weiteren erfolgte eine Untersuchung der landesweiten Verschreibungspraxis einer SUP auf der Basis einer Befragung der Abteilungsleiter und Mitarbeiter chirurgischer Abteilungen der Akutkliniken in Mecklenburg-Vorpommern [50].
Die Auswertung der retrospektiv erhobenen Patientendaten zeigte eindeutig, dass im weit überwiegenden Anteil der Patienten mit neu verordneter SUP keine Risikofaktoren für die Ausbildung von Stressulzera und stressulkusbedingten Blutungen vorlagen [49]. In 85.7-99.6 % der Patienten mit SUP konnte die Indikation für die Gabe nicht nachvollzogen werden [49].
Die Befragung chirurgisch tätiger Ärzte in Mecklenburg-Vorpommern zeigte, dass die Verschreibung der SUP nur in einer Minderzahl der Kliniken durch eine SOP geregelt war [50]. In den Kliniken mit vorhandener SUP war deren Inhalt nur einer Minderheit der klinisch tätigen Ärzte inhaltlich bekannt [50]. Eine kritische Reevaluation der Indikation einer SUP erfolgte nicht regelhaft bei Verlegung von Intensiv- auf die Normalstation oder bei Entlassung [50].
Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass bei chirurgischen Patienten auch heute noch eine massive Überverschreibung einer medikamentösen Stressulkusprophylaxe zur medizinischen Routine gehört [49, 50]. Dabei scheint von den behandelnden Ärzten das Risiko eines Auftretens stressulkusbedingter Blutungen massiv überschätzt beziehungsweise den Patientengruppen nicht regelrecht zugeordnet werden zu können [49, 50]. Angesichts der Tatsache, dass den zur SUP verwendeten Medikamente eine zunehmend größere Zahl unerwünschter Nebenwirkungen (bakterielle Gastroenteritis, akute interstitielle Nephritis, Vitamin-B12-Mangel, ein erhöhtes Risiko für eine Covid-19-Infektion, ambulant und nosokomial erworbene Pneumonien, Demenzerkrankungen, Osteoporose sowie Elektrolytstörungen) zugeordnet werden kann, sollte die Verschreibung der SUP nach einem festen Indikationsschemas erfolgen und im Laufe des stationären Aufenthaltes wiederholt kritisch hinterfragt werden [23-27].
Die Entwicklung einheitlicher Empfehlungen und Richtlinien zur Handhabung von SUP und die Sensibilisierung chirurgisch tätiger Ärzte im Rahmen von Fort- und Weiterbildungen erscheint somit, angesichts der erarbeiteten Daten, dringend notwendig zu sein.
Jedes Jahr werden alleine in Deutschland circa 2,6 Millionen viszeralchirugische Operationen
durchgeführt, die insgesamt gesehen eine Mortalität von fast 2 % aufweisen. Ein häufiges Problem
bei der Durchführung dieser Eingriffe ist, dass die Patienten eine Dysfunktion des Immunsystems
entwickeln, die die Anfälligkeit gegenüber infektiösen Komplikationen erhöht.
Die Faktoren der Immundysfunktion sind zwar in Teilen bekannt, aber die Pathophysiologie
dahinter bleibt unbekannt. Das Verständnis der Pathophysiologie ist unerlässlich, um gute
therapeutische Optionen zu finden. Überdies werden Tiermodelle benötigt, die die klinische
Situation wiederspiegeln.
Mit dem murinen Modell der surgically-induced immune dysfunction werden die Reaktionen des
humanen Immunsystems in weiten Teilen nachempfunden, wobei ein wesentliches Ziel der Arbeit
war, die Kinetik der Immunveränderungen über einen 72 h-Zeitraum zu untersuchen.
Die Operation löst deutlichen Stress bei den Tieren aus und führt von Beginn an sowohl zu pro –
als auch antiinflammatorischen Prozessen, die vor allem abakteriell ausgelöst werden.
Dennoch überwiegt in der frühen postoperativen Phase die proinflammatorische Reaktion mit
Anstieg der neutrophilen Granulozyten, Anstieg der Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems
und der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine. Zwischen dem 6 h- und 24 h-Zeitpunkt
gewinnt die antiinflammatorische Reaktion die Oberhand. Dieses zeigt sich durch eine
Lymphozytopenie mit Zunahme des Anteils der regulatorischen T-Zellen, durch eine verminderte
MHCII-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen, durch eine Zunahme der Aktivität des
Enzyms Indolamin-2,3-Dioxygenase, durch die Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen
und durch eine verminderte Stimulierbarkeit von murinen Splenozyten.
Diese Immunreaktionen werden nicht nur durch die SID sondern auch durch eine einfache
Laparotomie ausgelöst, wobei sie dann weniger deutlich ausgeprägt sind und schneller ablaufen.
Von dieser Kinetik ausgehend, kann an diesem Modell der Nutzen von potentiellen Therapien
geprüft werden, wobei bis zum 6 h-Zeitpunkt antiinflammatorisch wirkende Substanzen vorteilhaft
sein könnten, die im Weiteren von immunstimulierenden Medikamente abgelöst werden.
Insgesamt weist dieses Modell viele Parallelen mit der humanen postoperativen
Immundysfunktion auf, sodass es der Grundlagenforschung viele Möglichkeiten eröffnet.
FTY720 ist ein Immunsuppressivum, das zur Behandlung der schubförmigen Multiplen Sklerose (MS) zugelassen ist. FTY720 dämpft das adaptive Immunsystem, indem es durch seinen funktionellen Antagonismus am Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor 1 zu einer Sequestration von T-Zellen in sekundär lymphatischen Organen führt. Bislang ist allerdings unklar, ob durch diese FTY720-induzierte Lymphopenie Patienten mit MS einem erhöhten Risiko für schwerere Verläufe postoperativer infektiöser Komplikationen, wie zum Beispiel einer abdominellen Sepsis, ausgesetzt sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Auswirkung einer FTY720-induzierten Lymphopenie auf den Verlauf einer postoperativen polymikrobiellen Sepsis im murinen colon ascendens stent peritonitis (CASP)-Modell zu untersuchen. Zunächst erfolgte eine ausführliche Charakterisierung verschiedener Leukozytenpopulationen und Zytokine im Verlauf der CASP, welche die Grundlage für die Untersuchung der FTY720-induzierten Veränderungen bildete. Anschließend erfolgte eine ausführliche Charakterisierung der Auswirkung von FTY720 auf Zellpopulationen und Zytokine in sekundär lymphatischen Organen nach Induktion einer CASP. Darüber hinaus wurde eine Überlebenskinetik mit FTY720- und Placebo behandelten Tieren im CASP-Modell durchgeführt. Hierbei wurde die Hälfte der Tiere der jeweiligen Gruppe mit einem Breitspektrumantibiotikum behandelt. Die Behandlung mit FTY720 nach CASP-Induktion bewirkte eine Umverteilung der Zellpopulationen im peripheren Blut, in der Peritonealhöhle und in der Milz. Sowohl die lymphoide als auch die myeloide Zellreihe waren hierbei betroffen. Allerdings gab es keinen Unterschied im Überleben zwischen FTY720- und Placebo behandelten Tieren nach CASP-Induktion. Die Behandlung mit einem Breitspektrumantibiotikum erhöhte das Überleben in FTY720- und Placebo behandelten Tieren gleichermaßen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Hemmung der T-Zellmigration sowie die Induktion einer peripheren Lymphopenie mit einer verminderten Anzahl an T- und B-Zellen das Überleben im CASP-Modell nicht beeinflusste. Es kann daher vermutet werden, dass die Behandlung mit FTY720 in Patienten mit MS, die an einer Sepsis leiden, wahrscheinlich mit keiner erhöhten Mortalität einhergeht.
TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Familie und kann Apoptose in vielen Tumorzellen auslösen, ohne dabei nicht transformierte Zellen zu schädigen. Leider haben viele Tumorzellen Mechnismen entwickelt, sich der TRAIL induzierten Apoptose zu entziehen. Es war Gegenstand dieser Arbeit die Rolle von TRAIL, seinen Rezeptoren den Bindungspartnern OPG und RANKL, sowie innerhalb chronischer Inflammation und Stress zu untersuchen. Vier verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien, MiaPaCa2, Panc1, BXPC3 und Colo357 wurden dabei in vitro auf die oben genannten Parameter untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRAIL Apoptose in MiaPaca2 um bis zu 27% steigert, Colo357 bis zu 35%. Panc1(<6%) und BXPC3(14%) zeigten sich nahezu resistent. Die Resistenz gegenüber TRAIL scheint mit der Abnahme funktioneller TRAIL-Rezeptoren DR4 und DR5 sowie der Zunahme nicht funktioneller Decoyrezeptoren DcR1/2 in Zusammenhang zu stehen. Interessanterweise zeigte sich keine Korrelation zwischen der Genexpression der TRAIL-Rezeptoren und der auf Proteinebene gemessenen TRAIL-Rezeptoren. OPG scheint ebenfalls die Resistenz gegenüber TRAIL zu fördern (BxPc3>Panc1>Colo357), es konnte bei MiaPaCa nicht gemessen werden. RANKL konnte nur in geringen Konzentrationen bei der Zelllinie Panc1 nachgewiesen werden. LPS, welches ein inflammatorisches Molekül darstellt zeigte insgesamt keinen Effekt, bzw. nur einen moderaten Anstieg von OPG bei Colo357. Chronischer Stress scheint ebenfalls keinen Effekt auf die TRAIL Wirkung zu haben.
Bei der Fokussanierung einer abdominellen Sepsis kommt meist eine Peritoneallavage mit physiologischer Kochsalzlösung zum Einsatz. Antibiotikahaltige Lösungen scheinen keinen Vorteil zu haben und der Zusatz von Antiseptika wie z. B. PHMB hat teils toxische Wirkungen. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die Kombination aus PHMB und Lipofundin® gegenüber PHMB in wässriger Lösung eine geringere Zytotoxizität bei erhaltener antiseptischer Aktivität in-vitro besitzt.
Um die Hypothese zu bestätigen, dass eine Peritoneallavage mit dieser Emulsion einen Vorteil für das Überleben der abdominellen Sepsis bietet, wurde eine Überlebenskinetik am Sepsismodell CASPI durchgeführt. In weiteren Experimenten wurde die bakterielle Besiedlung 24 h nach Sepsisinduktion in Blut, Lavage und Organen ermittelt. Des Weiteren erfolgten die Bestimmung der Zytokinspiegel, die Erstellung eines Blutbildes sowie die laborchemische Bestimmung des Serumkreatinins.
Die höchste Überlebensrate mit signifikantem Unterschied zu allen Vergleichsgruppen zeigte sich in der PHMB + Lipofundin®-Gruppe mit 68,4 %, gefolgt von der mit NaCl lavagierten Gruppe mit 38,1 %. Die hohe Überlebensrate in der erstgenannten Gruppe korrelierte mit der niedrigsten bakteriellen Belastung in allen untersuchten Kompartimenten. PHMB in wässriger Lösung führte zu einer signifikant erhöhten Sterblichkeit mit einer Überlebensrate von nur 5,3 %. Im Gegensatz zu allen anderen Gruppen bestanden signifikant erhöhte Kreatininspiegel, die auf ein akutes Nierenversagen hindeuteten.
Die Kombination von PHMB und Lipofundin® könnte in Zukunft eine neue Therapieoption zur Behandlung der abdominellen Sepsis darstellen. Bis dato sind die Mechanismen in vivo, die den diametralen Unterschied im Überleben zwischen PHMB in Emulsion und in wässriger Lösung ausmachen, nicht geklärt. Auch In-vivo-Studien zur Toxizität stehen aus.
Die von uns erhobenen Daten belegen eine transiente Dysfunktion des angeborenen und des adaptiven Immunsystems nach chirurgischen Operationen. Übereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen beobachteten wir eine Suppression des angeborenen Immunsystems mit einer reduzierten monozytären HLA– DR Expression im postoperativen Verlauf. Diese war abhängig von der Größe des Eingriffes. Die Intensität und Länge dieser postoperativen Immundysfunktion korrelierte mit der Schwere des chirurgischen Traumas. Patienten mit einer stärkeren und länger andauernden Immunsuppression haben dementsprechend ein erhöhtes Risiko für postoperative, infektiöse Komplikationen. Schwer septische Patienten zeigten unabhängig vom Outcome im Verlauf keinen Anstieg der Expressionsniveaus und verblieben in einem immunparalytischen Zustand. Im Gegensatz dazu stieg bei Patienten ohne postoperative Komplikationen die HLA– DR Expression zwischen dem ersten und dritten postoperativen Tag signifikant an. Ein Zusammenhang mit dem Auftreten einer postoperativen schweren Sepsis, in unserem Patientenkollektiv meist am 6 Tag postoperativ auftretend wird durch unsere Daten nahe gelegt. Die Einteilung der Sepsis in Typ A und Typ B verbindet die postoperativ vorhandene Immunsuppression chirurgischer Patienten mit dem dadurch gesteigerten Risiko einer schweren Sepsis. Bei Patienten mit einer Typ B Sepsis ist das Immunsystem aufgrund der vorhergehenden Operation wesentlich eingeschränkt. Insbesondere im Zusammenhang mit dem weitaus schlechteren Outcome bei Patienten mit Typ B Sepsis ist eine frühzeitige Bestimmung des Immunstatus postoperativ als präventive Maßnahme zur frühzeitigen Erkennung dieser Erkrankung sinnvoll. Eine präoperative Disposition für einen komplizierten Verlauf charakterisiert durch eine verminderte Oberflächenaktivität der Monozyten, wie sie von anderen Arbeitsgruppen bei Malignomen beobachtet wurde konnte nicht nachgewiesen werden. Ebenfalls veränderten neoadjuvante Therapieschemen weder die prä-, noch die postoperative Expression von HLADR Molekülen auf der Oberfläche von Monozyten. Neben dem angeborenen Immunsystem kam es nach großen chirurgischen Eingriffen zu einer Alteration der adaptiven Abwehr. Alle in unserer Studie eingeschlos- senen Patienten waren postoperativ von einer generalisierten Reduktion der transkriptionalen Aktivität der T– Zellen betroffen, diese war bei Patienten mit septischen Komplikationen stärker ausgeprägt. Die Ursachen für die schnelle Änderung des Phänotyps der Monozyten und T– Lymphozyten nach chirurgischen Eingriffen müssen in weiteren Untersuchungen genauer analysiert werden. Unsere Resultate belegen, dass die Determination von Monozyten und T– Zell Parametern zur frühzeitigen Identifikation von Hochri- sikopatienten nach chirurgischen Eingriffen sinnvoll ist. In weiteren prospektiven Studien muss geklärt werden, ob die Dynamik der HLA– DR Expression auf Monozyten auch bei größeren Patientenkollektiven eine Vorhersage für postoperative Komplikationen zulässt. Weiterhin ist fraglich ob mit der Microarray Technologie und der damit identifizierbaren Genexpression eine genaue Analyse der Abwehrlage des Patienten möglich ist. Der Vergleich der Komorbiditätsfaktoren Alter und BMI zeigte vermehrt Komplikationen und eine verminderte HLA– DR Expression in der Gruppe der übergewichtigen Patienten. Wir konnten in unserer Studie zeigen, dass Patienten mit einem erhöhten BMI ein höheres Risiko für postoperative Komplikationen haben. Insbesondere zeigte sich eine signifikant erhöhte Rate der schwereren Sepsis bei Patienten mit einem BMI >30. Die Nutzung des BMI zur Ergänzung bereits bestehender Risikostratifizierungssysteme scheint sinnvoll. Mit den unterschiedlichen Risikostratifizierungen konnten Patienten mit einer eingeschränkten postoperativen HLA- DR Expression identifiziert werden. Insbesondere bei Patienten, die mit der modifizierten Risikostratifizierung beurteilt wurden waren diese Unterschiede hochsignifikant.
Die postoperative Immundysfunktion ist ein bis heute noch nicht verstandenes Phänomen. Das Mausmodell der postoperativen Immundysfunktion (SID-Modell) leistet hierbei einen Beitrag zur Klärung der zugrunde liegenden Mechanismen. Diese Arbeit charakterisiert das SID-Modell und kombiniert es mit dem klinischen Modell des orthotopen Pankreaskarzinoms. Klinisch sichtbare und immunologisch nachweisbare Prozesse der postoperativen Immundysfunktion, wie sie am Menschen regelhaft beobachtet werden, sind auch im SID-Modell nachweisbar. Die Operation nach dem Modell der SID erzeugt einen postoperativen paralytischen Ileus, der bis zu einer Woche anhält. Begleitend zu dem paralytischen Ileus treten die charakteristischen Darmwandödeme und dilatierten Darmschlingen auf. Weiterhin kommt es zu einer Migration von neutrophilen Granulozyten in die Darmwand. Auch vom Aspekt des Traumas entspricht das Modell der SID einem großen chirurgischen Eingriff, was durch den Nachweis der erhöhten systemischen und lokalen HMGB1-Konzentrationen gezeigt wird. Die komplexen immunologischen Vorgänge im SID-Modell lassen sich anhand ausgewählter Zytokine und Stresshormone nachvollziehen und sind den immunologischen Prozessen nach großen chirurgischen Interventionen am Menschen sehr ähnlich. So führt das Modell der SID an mehreren Stellen zu einem ausgeprägten Eingriff in den Regelkreis der hypothalamo-hypophysär-adrenalen Achse und des Immunsystems. Der perioperative Stress aktiviert die hypothalamo-hypophysär-adrenale Achse, die wiederum durch Glukokortikoide die Konzentration pro-inflammatorischer Zytokine minimiert. Diese begünstigen ihrerseits die Freisetzung von Glukokortikoiden. Dem entgegen fördert das durch ein operatives Trauma freigesetzte HMGB1 die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine aus Immunzellen. Es steht somit nun ein Modell zur Verfügung, das das Phänomen der postoperativen Immundysfunktion der Grundlagenforschung zugänglich macht.
Zusätzlich zur erfolgreichen Charakterisierung zeigt sich ein interessanter klinischer Bezug zum orthotopen Pankreaskarzinom-Modell. Dabei löst das SID-Modell einen erheblichen negativen Einfluss auf das Überleben von Mäusen mit einem Pankreaskarziom aus. Das SID-Modell könnte eine häufig existierende Situation am Menschen, bei denen sich ein Karzinom oder Metastase chirurgisch nicht vollständig resezieren ließ, abbilden und der Entwicklung neuer Strategien, wie etwa einer perioperativen Immunmodulation, dienen.
Das Pankreaskarzinom ist die vierthäufigste Krebstodesursache in der Bundesrepublik Deutschland. Bisher stehen zur Therapie eines fortgeschrittenen Tumors nur wenige Optionen zur Verfügung, gleichzeitig gestaltet sich die Früherkennung des Pankreaskarzinoms als schwierig. Aufgrund der geringen 5-Jahres-Überlebensrate von 8 % sind neue Forschungsansätze zur Untersuchung von Ursachen, Präventions- und Therapieoptionen von großem Interesse. Die Forschung in der Zellkultur spiegelt die Abläufe im menschlichen Organismus nur unzureichend wider. Somit ist eine Durchführung von Tierversuchen häufig unvermeidlich. Trotzdem sollte es aus ethischen sowie auch kostentechnischen und bürokratischen Gründen angestrebt werden, die Anzahl der Tierversuche auf ein Minimum zu reduzieren. Als Bindeglied zwischen in vitro und in vivo Forschung kann das Chorioallantoismembran-Modell im bebrüteten Hühnerei als Möglichkeit zum Ersatz von Tierversuchen dienen. Die Chorioallantoismembran ist ein nicht innerviertes Gefäßsystem, welches analog der menschlichen Plazenta der Versorgung des avianen Embryos dient. Der aviane Embryo selbst fällt in der gesamten Bebrütungszeit nicht unter das Tierschutzgesetz.
Im Rahmen der Methodenetablierung erfolgte die Untersuchung verschiedener Trägersubstanzen und Hilfsmittel zur Kultivierung von Pankreaskarzinomzelllinien auf der Chorioallantoismembran. Zudem erfolgte die Untersuchung der Auswirkungen des Stresshormons Isoproteronol auf das Tumorwachstum der Pankreaskarzinomzelllinie Colo357 in Bezug auf Fläche, zentraler Tumorfläche, Volumen und Gefäßwachstum im Sinne einer Neoangiogenese nach einem Scoresystem. Die Auswertung erfolgte mittels Hämatoxylin-Eosin- und immunhistochemischer Färbungen sowie den Programmen Image J, GraphPad Prism und Excel.
Es konnte ein Wachstum der Zelllinien Colo357, BxPC-3, 6606PDA, Panc02 und PANC-1 erzielt werden. In den Versuchsreihen nach Stimulation der Pankreaskarzinomzelllinie Colo357 konnte bei der Beurteilung des Scores zur Betrachtung des Gefäßwachstums ein Unterschied zwischen den mit Katecholaminen behandelten und den unbehandelten Zelllinien ermittelt werden. Dieser war jedoch gerade nicht signifikant mit p=0,0766. Bei der Untersuchung der Tumorfläche zeigte sich lediglich ein geringer Unterschied zwischen den beiden Gruppen, der mit p=0,0900 nicht signifikant war. Hiernach erfolgte die Betrachtung der zentralen Tumorfläche. Hier konnte ein sehr signifikanter Unterschied mit p=0,0056 nachgewiesen werden. Diese Tendenz ließ sich in der Berechnung des Tumorvolumens bestätigen. Es zeigte sich ein hochsignifikant vermehrtes Tumorwachstum in der mit Isoproteronol behandelten Gruppe mit p=0,0001.
Das Chorioallantoismembran-Modell ist zur Anzüchtung von Pankreaskarzinomzelllinien geeignet und ermöglicht als Bindeglied zwischen in vitro und in vivo Forschung die Untersuchung verschiedener Parameter wie Tumorwachstum, Neoangiogenese und die Betrachtung der Auswirkungen von Pharmaka. Exemplarisch konnte der stimulierende Einfluss von Isoproterenol als Hormon chronischen Stresses auf das Tumorwachstum aus murinen Tierversuchen bestätigt werden. Somit kann dieses Modell zur Reduktion von Tierversuchen beitragen und ermöglicht trotzdem Einblicke, welche in der in vitro Forschung nicht zu erzielen sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro und in vivo die Rolle der Thrombozyten in der Sepsis untersucht. In vitro wurde humanes plättchenreiches Plasma und Vollblut mit LPS und TRAP-6 stimuliert und eine mögliche Aktivierung der Thrombozyten durchflusszytometrisch überprüft. Im PRP kam es zu einem leichten Anstieg von P-Selektin, einem Aktivierungsmarker und Adhäsionsmolekül auf Thrombozyten, nach Kostimulation von TRAP-6 und LPS im Vergleich zur TRAP-6 behandelten Gruppe. Im Vollblut zeigte sich nach LPS-Zugabe dagegen ein signifikanter Anstieg von Leukozyt-Thrombozyt-Aggregaten und eine Zunahme der P-Selektin-Expression auf den aggregatbildenden Thrombozyten. In vivo wurde als etabliertes Sepsismodell die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) durchgeführt. Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden einer 16 G CASP unterzogen und nach 20 h untersucht. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrollgruppe. Es wurde ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl im peripheren Blut septischer Tiere beobachtet. Um die Ursache für diese verminderte Plättchenanzahl zu finden, wurden zuerst immunhistochemische Färbungen von Leber, Lunge, Niere und Milz angefertigt um dort mögliche Thrombozytenanreicherungen zu entdecken. In diesen zeigte sich allerdings nur in der Leber eine deutliche Zunahme von Thrombozyten nach CASP. In Lunge, Niere und Milz war kein signifikanter Anstieg zu verzeichnen. Als zweiter möglicher Grund für die Thrombozytopenie wurde die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) als bekanntes Phänomen der Sepsis in Betracht gezogen. Zur Überprüfung wurde der Fibrinogengehalt im Plasma per ELISA bestimmt, da bei starker Gerinnung dessen Gehalt sinkt. Dabei zeigte sich allerdings eine Zunahme von Fibrinogen im Plasma bei den septischen Tieren im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Fibrinogen sank also nicht im Sinne einer Verbrauchskoagulopathie, wie es zu erwarten wäre, sondern stieg im Sinne eines Akute-Phase-Proteins. Weiterhin wurde der Einfluss des Chemokinrezeptors CCR4 in der Sepsis untersucht, da CCR4-/--Mäuse im Vergleich zu C57BL/6-Tieren nach CASP einen Überlebensvorteil haben. Zuerst wurde die Expression von CCR4 auf mRNA-Ebene in mononukleären Zellen des peripheren Blutes und CD4+-Zellen der Milz 20 h nach CASP gemessen. In beiden Zellpopulationen zeigte sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine signifikant verringerte Transkription von CCR4. Da auch Thrombozyten CCR4 exprimieren, wurde sowohl die Immunhistochemie, als auch der ELISA bei CCR4-/--Tieren nach CASP durchgeführt um mögliche Unterschiede zur Wildtyp-Maus festzustellen. In beidem war allerdings kein Unterschied zwischen C57BL/6- und CCR4-/--Tieren zu sehen. Da Thrombozyten in vitro durch LPS aktiviert wurden, vor allem im Zusammenspiel mit anderen Blutzellen und septische Tiere sowohl eine Thrombozytopenie als auch eine Plättchenakkumulation in der Leber zeigten, sind die Plättchen im Krankheitsverlauf der Sepsis von Bedeutung. Der Chemokinrezeptor CCR4 scheint im Zusammenhang mit Thrombozyten in der Sepsis von untergeordneter Bedeutung zu sein. In anderen Immunzellen, vor allem T-Helfer-Zellen, wird dessen Expression im Zellkern im Verlauf der Sepsis reguliert und könnte damit Einfluss auf den Krankheitsverlauf haben.
Aufgrund der schlechten Prognose des Pankreaskarzinoms ist die Etablierung sowohl neuer Diagnostika als auch Therapieansätze von hoher Wichtigkeit. Große Hoffnungen in der Therapie wurden in TRAIL gesetzt, da es selektiv in zahlreichen Tumorzellen Apoptose induziert, physiologische Zellen aber nicht wesentlich beeinflusst. Daher erschien TRAIL als ein vielversprechender Kandidat für eine künftige systemische nebenwirkungsarme Therapie des Pankreaskarzinoms und anderer Malignome. Das Vorliegen diverser Resistenzmechanismen in Tumorzellen schränkt die Aussicht auf einen zeitnahen Therapieeinsatz allerdings ein. Darüber hinaus sind anti-apoptotische und sogar tumorförderne Effekte von TRAIL entdeckt worden.
Ziel dieser Arbeit war es, die vielseitigen Effekte von TRAIL im Geschehen des Pankreasadenokarzinoms anhand eines Maus Knockout-Modells weiter zu ergründen. Dafür wurden murine Pankreasadenokarzinomzellen bezüglich deren Expression von TRAIL und TRAIL-Rezeptoren sowie der Sensibilität gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose durchflusszytometrisch untersucht. Anschließend erfolgte die orthotope Inokulation der genannten Tumorzellen in den Pankreaskopf und die Untersuchung der Tumoren bzw. des Immunsystems. Es wurden C57BL/6-Wildtypen mit dem TRAIL-defizienten Mausstamm 129/C57BL/6.TRAIL/Apo2L-/- verglichen. Die erhaltenen Resultate wurden durch Wildtypen, welche einer TRAIL-Behandlung unterzogen wurden, überprüft.
Die Arbeit konnte zeigen, dass die murine Tumorzelllinie 6606PDA den TRAIL- Rezeptor 2 auf der Oberfläche exprimiert. Dennoch stellt sich diese Linie gegenüber TRAIL in Konzentrationen bis 1000 ng/ml resistent dar bzw. zeigt eine im Vergleich zur unbehandelten Kultur verminderte Apoptoserate. Eine Änderung des Ausmaßes der oberflächlichen Rezeptorendichte kann unter dem Einfluss von TRAIL nicht beobachtet werden. Neben dem Rezeptor wurde auch TRAIL von der Zelllinie 6606PDA exprimiert.
Unter Anwendung einer Kleintier-MRT-gestützten Volumetrie zeigte sich in vivo eine von TRAIL abhängige Tumorprogression, wobei TRAIL mit der Entstehung größerer Tumoren und größerer bzw. tendenziell mehr Metastasen einherging. Diesbezüglich konnte ein ursächlicher Einfluss von TRAIL auf das Immunsystem tumortragender Tiere nachgewiesen werden. TRAIL-abhängig kommt es zu Änderungen im Anteil der Gesamtpopulation tumorinfiltrierender Lymphozyten im Tumor. Im Einzelnen stellen sich Treg und NK-Zellen in Tumoren TRAIL-/- Mäuse im Vergleich zu Wildtypen vermindert dar. Unter diesem Eindruck kommt es zu Veränderungen der Apoptoseraten von CD4+- und CD8+ T-Lymphozyten, welche im Tumor TRAIL-defizienter Individuen geringer ausgeprägt sind als im WT. Gleichzeitig konnten in den TRAIL-/-- Mäusen ebenfalls geringere Apoptoseraten in den Tumorzellen gemessen werden.
Die definitiven Mechanismen, die zu den beobachteten Unterschieden der Tumorprogression führen, bleiben weiter unklar. Die widersprüchlich erscheinenden Resultate kleinerer Tumoren mit zeitgleich weniger antitumoralen NK-Zellen bzw. dem anteilig geringeren Apoptosegrad der Tumorzellen deuten auf eine negative Bilanz von NK-Zellen hin.
Ein kausaler Zusammenhang zwischen den geringeren Anteilen von Treg und NK-Zellen in Tumoren von TRAIL-/- Tieren mit der besseren Prognose dieser Versuchsgruppe kann postuliert werden. Darüber hinaus könnte das Fehlen von TRAIL über die Behinderung tumorautokriner proliferationsfördernder Stimulationsvorgänge an der verminderten Tumorprogression beteiligt sein.
Das ausgeprägte Ausmaß des Unterschiedes der Überlebenskinetik könnte auf bisher unbekannte Mechanismen der Tumor-Immunosurveillance hindeuten.
In weiteren Studien müssen das Aktivitätsniveau beteiligter Immunzellen, die Bedeutung natürlicher Killerzellen an der Tumorabwehr und der Einfluss von TRAIL auf weitere Immunpopulationen weiter untersucht werden.
In Anbetracht der pleiotropen Wirkweise von TRAIL ergeben sich vielfältige Zielorte, um therapeutische Fortschritte im Rahmen des Pankreaskarzinoms zu erlangen. Dabei sollte die Entwicklung neuer Therapien solche einschließen, die zu einer Sensibilisierung der Tumorzellen gegenüber TRAIL führen. Hierdurch könnte TRAIL einen völlig neuen Stellenwert in der Therapie derzeit TRAIL-resistenter Malignome, insbesondere des Pankreaskarzinoms, erreichen. Auch deshalb muss der weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Signalkaskaden von TRAIL eine hohe Priorität zugewiesen werden.
Untersucht wird der Einfluss des CCR-4-Antagonisten AF399/420/18 025 auf das Pankreaskarzinom
im syngenen murinen orthotopic Pankreaskarzinommodell. Es konnte gezeigt werden, dass eine Verwendung des CCR-4-Antagonisten in unseren Pankreaskarzinommodell zu einem signifikant kleineren Tumorwachstum führt und einen positiven Einfluss auf das Überleben hat und es zu einer Reduktion der Tumor assoziierten Makrophagen-Dichte kommt.
Operative Eingriffe am Menschen können durch die entstehenden Gewebeverletzungen eine postoperative Immunsuppression hervorrufen. Dabei wirken Mediatoren auf den Nervus vagus als zentrale Komponente des sogenannten cholinergen antiinflammatorischen Reflexes, welcher für die Herabregulation des Immunsystems ursächlich ist.
Diese Arbeit untersucht die Veränderungen auf Ebene des Maus-Transkriptoms im Rahmen eines intakten N. vagus und im Rahmen einer Vagotomie jeweils nach operativem Trauma. Es wird dargestellt, welche Auswirkungen der Nervus vagus auf den Status der Genexpression hat und welche Gene für die postoperative Immunsuppression ursächlich sein können.
Die postoperative Sepsis als fatale Komplikation mit potentiell tödlichem Ausgang kam in der Vergangenheit in den USA bei 0,9% aller durchgeführten Operationen vor, mit steigender Tendenz. Die Mortalität der Sepsis oder schweren Sepsis lag in Deutschland bei ca. 50%. Die postoperative Immunsuppression als Risikofaktor für das Entwickeln einer Sepsis spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Da mit ansteigender Operationsdauer sowie Intensität einer Bauchoperation ein verschlechtertes Outcome in der Sepsis gezeigt werden konnte [88], wurde eine postoperative Immunsuppression postuliert. Um dieses Phänomen der Grundlagenforschung zugänglich zu machen, wurde ein Mausmodell entwickelt, dass nach Laparotomie eine Ileus-Dekompressionsoperation nachbildet.
Der Nervus Vagus als elementarer Bestandteil des Cholinergen Anti-inflammatorischen Signalwegs (CAP) wurde in der Vergangenheit ausführlich untersucht und sein Potential in diesem Zusammenhang aufgezeigt. Zur weiteren Charakterisierung der postoperativen Immunsuppression wurde die SID-Operation mit einer subdiaphragmalen Vagotomie kombiniert und erstmalig die hierdurch aufgetretenen Veränderungen auf Zellebene charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass die SID-Operation zu einem massiven Einstrom von Zellen des angeborenen Immunsystems in die Darmwand 24 Stunden nach Intervention führte, in vergleichbarem Ausmaß wie nach Induktion einer abdominellen Sepsis. Ebenfalls war eine Migration von B- und T-Lymphozyten in geringerem Ausmaß zu beobachten. In der späten Phase 5 Tage nach Intervention wurde eine erhöhte Zellzahl des adaptiven Immunsystems in der Darmwand nachgewiesen. Die SID-Operation führt somit zu einer prolongierten Immunantwort, welche sehr ausgeprägt die Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems einbindet. Die subdiaphragmale Vagotomie konnte diesen Effekt an Tag 5 deutlich reduzieren bis aufheben. Im Serum ebenso wie in der Milz zeigte sich nach SID-Operation eine mehrheitlich signifikante Reduzierung der Zellen des adaptiven Immunsystems, insbesondere verstärkt an Tag 5 nach Intervention. Dieser Effekt wurde durch die subdiaphragmale Vagotomie ebenfalls abgeschwächt bzw. komplett aufgehoben. In der Antwort des angeborenen Immunsystems zeigte sich der Einfluss des N. vagus differenzierter mit Akkumulation von Neutrophilen Granulozyten im Blut 5 Tage nach SID-Operation mit intaktem N. vagus, bei vagotomierten Tieren zum gleichen Zeitpunkt signifikant erhöhten Zahlen von Neutrophilen Granulozyten in der Milz.
In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die Operation der Surgically Induced Immune Dysfunction eine über 5 Tage anhaltende Leukozytenmigration in die Darmwand nach sich zieht. Als Reservoir dieser Migration an den Ort des Traumas dienen möglicherweise Serum
und Milz, da hier äquivalent reduzierte Level vor allem der Lymphozyten nachgewiesen wurden.
Somit konnte durch das SID-Modell gezeigt werden, dass neben der Senkung der HLA-DR- Antigene auf Leukozyten der schiere Verbrauch von Immunzellen sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems ein weiterer Mechanismus der postoperativen Immunsuppression zu sein scheint.
Die langanhaltende Zellmigration zum Ort des Traumas zeigt sich zumindest zum Teil vermittelt durch den Nervus vagus, da die Lymphozyteninfiltration der Darmwand an Tag 5 nach Vagotomie fast vollständig aufgehoben ist. Die Verminderung der Zellzahlen in Serum und Milz scheint ebenfalls vagal beeinflusst zu werden. Somit zeigt sich der Nervus vagus als möglicher pharmakologischer Angriffspunkt, indem durch spezifische, bereits verfügbare, Hemmstoffe des Nervus vagus die zelluläre Immunantwort möglicherweise gebremst und somit das Ausmaß einer postoperativen Immunsuppression abgeschwächt werden könnte.
Hintergrund: Das Pankreaskarzinom ist ein maligner Tumor, der durch ein invasives Wachstum und ein ausgeprägtes Metastasierungsverhalten charakterisiert ist. Hinzu kommen in den meisten Fällen die verzögerte Diagnosestellung durch die späte klinische Manifestation und die daraus resultierende hohe Mortalität. Durch die sich weiterentwickelnde Forschung konnte gezeigt werden, dass das Tumormikromilieu einen entscheidenden Einfluss auf die Wachstumseigenschaften des Pankreaskarzinoms hat. Insbesondere die Angiogenese, die durch die zahlreichen Wachstumsfaktoren, aber auch durch die von den Betaadrenorezeptoren ausgelöste Signalkaskade beeinflusst wird, trat in den Vordergrund der Forschung. Die Mikrogefäßdichte ist ein Maß für die Ausprägung der Angiogenese und wird teils durch VEGF, aber auch durch Betaadrenorezeptoren beeinflusst. In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass chronischer Stress die Konzentration von VEGF erhöht und damit einen positiven Einfluss auf die Angiogenese und das Tumorwachstum hat. Auch die Aktivierung der Betaadrenorezeptoren durch die Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin führt zu einer vermehrten Angiogenese, Migration und Proliferation der Karzinomzellen.
Ziele: Es sollte zunächst eine Methode gefunden und etabliert werden, mit der unter standardisierten Bedingungen die Mikrogefäßdichte, als Maß für die Angiogenese, in vivo am murinen orthotopen syngenen Pankreaskarzinom gemessen werden konnte. Nach Etablierung der Methode sollte untersucht werden, inwieweit chronischer Stress das Tumorwachstum (in dieser Arbeit beispielhaft bestehend aus der Mikrogefäßdichte und dem Tumorvolumen) positiv beeinflusst.
Methoden: Es erfolgte eine orthotope syngene Implantation von Pankreaskarzinomzellen der murinen Zelllinie 6606-PDA in den Pankreaskopf von immunkompetenten C57BL/6N Mäusen. Ein Stressmodell zur Applikation von chronisch akustischem Stress und Engestress wurde eingesetzt. Zur Messung der Mikrogefäßdichte (MVD - microvessel density) am murinen orthotopen syngenen Pankreaskarzinom konnte ein in vivo Modell entwickelt werden. Hierzu wurde die Intravitalmikroskopie am lebenden Versuchstier mit einem nach extrakorporal gelagerten Pankreas mit Karzinom verwendet. Des Weiteren wurde das Tumorvolumen mit einem Kleintier-MRT und der Vermessung der sogenannten Interessenregionen (ROIs („Region of Interest“)), sowie mit Hilfe einer elektronischen Schieblehre bestimmt.
Ergebnisse: Unter dem Einfluss von chronischem Stress nahmen in der vierwöchigen Versuchsgruppe sowohl die MVD als auch das Tumorvolumen signifikant zu. Es zeigte sich eine Zunahme der MVD von 152,4±24,83cm-1 in der Kontrollgruppe auf 186,1±11,27cm-1 in der Stressgruppe (p=0,03). Das Tumorvolumen vergrößerte sich von 140,3±25,53mm³ in der Kontrollgruppe auf 207,0±57,0mm³ in der Stressgruppe (p=0,03).
In der sechswöchigen Versuchsgruppe zeigte sich ein Anstieg der MVD von 211,8±38,17cm-1 in der Kontrollgruppe unter chronischen Stressbedingungen auf 228,1±18,04cm-1 in der Stressgruppe (p=0,42). Das Tumorvolumen vergrößerte sich von 285,0±51,6mm³ in der Kontrollgruppe auf 336,6±60,17mm³ unter chronischen Stressbedingungen in der Stressgruppe (p=0,31). Beide Unterschiede waren jedoch nicht signifikant.
Thesen: Anhand dieser Daten ist der positive Einfluss chronischen Stresses auf die Angiogenese, in dieser Arbeit gemessen in Form der Mikrogefäßdichte, und somit auch auf das Tumorwachstum, gemessen als Tumorvolumen, höchstwahrscheinlich anzunehmen.
In der Vergangenheit konnte bereits gezeigt werden, dass die Versuchstiere unter Stressbedingungen nicht nur größere Pankreaskarzinome ausbildeten, sondern sich auch die Konzentration von VEGF deutlich erhöhte. Insgesamt sind weitere Untersuchungen notwendig, um das Interaktionspotential von Stresshormonen mit anderen Wachstumsfaktoren, Signalkaskaden und zellulären Komponenten näher zu verstehen. Dieses Verständnis könnte dann in weiteren Forschungsschritten dazu dienen, das Wachstumsverhalten des Pankreaskarzinoms gezielt zu beeinflussen oder gar im bestmöglichen Fall zu stoppen. Diese Therapieansätze könnten dann, bei deutlich geringerem Nebenwirkungspotential, einen Vorteil für das Patientenüberleben haben.
Ausblick: Die Intravitalmikroskopie ist eine gute Methode zur in vivo Untersuchung von Geweben und Gefäßen. Das Versuchstier kann unter kontrollierten Bedingungen überwacht werden, so dass eine standardisierte Untersuchung möglich ist. Mit speziellen Kontrastmitteln und Filtern ist das Tumormikromilieu am lebenden Versuchstier gut untersuchbar. Auch in Zukunft eröffnet die Intravitalmikroskopie hervorragende Möglichkeiten zur in vivo Betrachtung und Beurteilung der Angiogenese swoie der Zell-Zell-Interaktionen, um das Verständnis des Tumormikro- und -makromilieus zu vergrößern.
Das Pankreaskarzinom ist eine Erkrankung, welche durch ein aggressives Wachstum und Metastasierungsverhalten, eine späte klinische Manifestation und eine hohe Mortalität der Patienten gekennzeichnet ist. In den letzten Jahren rückte der Einfluss des Tumormikromilieus auf die Wachstumseigenschaften des Pankreaskarzinoms zunehmend in den Fokus der Forschung. Hierbei scheinen nicht nur die zellulären Bestandteile eine Rolle zu spielen, sondern auch Wachstumsfaktoren, die zu einer Modulation von Wachstums- und Metastasierungsbedingungen beitragen. Die lokale und systemische Bedeutung von TGF-beta 1 als Wachstumsfaktor für das Pankreaskarzinom scheint dabei ambivalent zu sein. In Abhängigkeit von der Tumorentität, seiner Konzentration und der Verteilung über einen bestimmten Zeitraum scheint er teilweise gegensätzliche Funktionen zu übernehmen. Zu evaluieren galt es, ob Stresshormone einen Einfluss auf die TGF-beta 1 Sekretion im Pankreaskarzinom ausüben. In vitro konnten wir in Versuchen mit Stresshormonen zeigen, dass die murine Pankreaszelllinie 6606-PDA sowohl unter dem α-Agonisten Norepinephrin, als auch unter dem beta-Agonisten Isoproterenol mit einer Steigerung der TGF-beta 1 Sekretion in einem zeit- und konzentrationsabhängigen Kotext reagiert. Dieser Effekt wurde nicht durch eine signifikant gesteigerte Proliferation verursacht. In vivo konnte dieser Effekt ebenfalls nachgewiesen werden, dahingehend, dass TGF-beta auch in den Tumoren der chronisch gestressten Versuchstiere, sowohl intrazellulär, als auch zytosolisch, erhöht war. Im Gegensatz hierzu waren die TGF-beta 1 Serumkonzentrationen der Versuchstiere unter Stressbedingungen tendenziell erniedrigt. In der Vergangenheit konnte bereits gezeigt werden, dass Mäuse unter Stressbedingungen größere Pankreastumore ausbilden. Ob die Größe der Tumoren unter Stressbedingungen mit der lokal gesteigerten TGF-β Sekretion direkt korreliert, sollte in zukünftigen Arbeiten untersucht werden. Desweiteren sollte in weiteren Arbeiten eine genaue Unterscheidung bezüglich der Steigerung der einzelnen Isoformen bzw. deren inaktiven Vorstufen unter Stressbedingungen getroffen werden. Insgesamt sind weitere Untersuchungen notwendig um das Interaktionspotential von Stresshormonen mit anderen Wachstumsfaktoren, Signalkaskaden und zelluläre Komponenten in Bezug auf die TGF-beta bzw- TGF-beta 1 Sekretion Pankreaskarzinoms näher zu verstehen. Bei Kenntnis der zugrundeliegenden molekularbiologioschen Vorgänge und Interaktionen innerhalb des Tumomikromilieus und deren Auswirkungen auf die Tumorbiologie des Pankreaskarzinoms ließe sich dessen Wachstumsverhalten gezielt beeinflussen. Somit wäre eine gezielte Therapie des Pankreaskarzinoms möglich, welche das Patientenüberleben verbessern könnte.
Die immunologische Dysfunktion nach operativem Trauma und der Einfluss des N. vagus im Mausmodell
(2024)
Trotz aller medizinischen Fortschritte der letzten Jahrzehnte ist der Einfluss operativer Trauen auf die Immunhomöostase noch weitgehend unklar. Im Falle septischer Komplikationen sind postoperative Patienten meist mit einer noch höheren Mortalität assoziiert als septische Patienten ohne ein vorhergehendes operatives Trauma. Einen Grund dafür stellt die postoperative Immundysfunktion dar, welche von Länge und Ausmaß der Operation abhängt. Die pathophysiologischen Hintergründe sind noch unbekannt und erscheinen traumaspezifisch. Um diese einer näheren Betrachtung unterziehen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe das Tiermodell der Surgically induced Immune Dysfunction (SID) etabliert. Dafür wird zur Simulation eines abdominalchirurgischen Eingriffs der Dünndarm nach einer medianen Laparotomie dreimal antegrad ausgestrichen. Einen möglichen Baustein zum Verständnis dieser Immundysfunktion stellt die Entdeckung des cholinergen antiinflammatorischen Signalweges (CAIP) dar. Über diesen ist das Zentralnervensystem via den Nervus vagus in der Lage, immunmodulatorisch einzuwirken. Ziel der Arbeit war es, aufgrund dessen unter anderem den systemischen Einfluss des CAIP auf die postoperative Immundysfunktion zuuntersuchen. Dafür wurden einige Versuchstiere sechs Tage vor SID einer Vagotomie unterzogen. Die Analysen erfolgten nach sechs Stunden und drei Tagen.
Zusammenfassend konnte sechs Stunden nach SID eine Akut-Phase-Reaktion beobachtet werden, die durch eine Neutrophilie, Lymphopenie, erhöhte IL-6-Konzentrationen und komplett aktivierte T-Lymphozyten gekennzeichnet war. Gleichzeitig zeigten sich aber auch eine erhöhte IDO-Aktivität und eine reduzierte LPS-Stimulierbarkeit von Blut- und Milzzellen. Diese gedämpfte Immunreaktion auf den in-vitro second hit schlug bemerkenswerterweise nach drei Tagen in eine Hyperreagibilität und damit in einen hyperinflammatorischen Phänotyp um. Gleichzeitig reduzierte sich die Anzahl von Teff- und B-Lymphozyten, während zeitgleich eine relative Treg-Expansion mit gesteigerter CTLA-4-Expression nachweisbar war. Diese Steigerung immunsuppressiver Mechanismen und dergleichzeitige Verlust an Effektorzellen könnte im Falle eines nachfolgenden second hit zu der beobachteten gesteigerten Mortalität postoperativer Patienten beitragen. Wurde vor der SID eine Vagotomie durchgeführt, fiel die Inflammation sechs Stunden später noch intensiver aus: Die Neutrophilie war stärker ausgeprägt und die Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen im Plasma war erhöht. Die reduzierte LPS-Stimulierbarkeit von Blut- und Immunzellen wurde im Wesentlichen aufgehoben. Nach drei Tagen verstärkte eine Vagotomie die bereits nach SID beobachtete Hyperreagibilität auf den LPS-Stimulus noch weiter.
Somit lassen diese Ergebnisse auf einen wichtigen immunsuppressiv wirkenden vagalen Einfluss auf die postoperative Immundysfunktion schließen und zeigen einen vielschichtigen zeitlichen Verlauf von Anti- und Hyperinflammation nach operativem Trauma auf. Eine nähere Erforschung dieses multiphasischen Verlaufs kann Implikationen für die klinische Praxis, insbesondere im Bezug auf Re-Operationen geben. Auch eröffnet es die spannende Frage, ob das Immunsystem auf einen postoperativen septischen Fokus in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zur Operation unterschiedlich reagiert. Nicht zuletzt wird durch die Ergebnisse auch ein wichtiges Schlaglicht auf die Bedeutung von traumareduzierenden Operationsverfahren wie der minimal-invasiven laparoskopischen Chirurgie für das postoperative Outcome geworfen.
Die disseminierte intravasale Gerinnung (DIG) ist eine häufige Komplikation einer schweren Sepsis mit nach wie vor oftmals letalen Folgen. Sie stellt eine anfänglich hyperkoagulatorische Gerinnungsstörung im Mikrogefäßsystem dar, welche, geprägt durch den exzessiven Verbrauch von Gerinnungsfaktoren, zu einer systemischen Blutungsneigung im Organismus führt. Deren Therapie wiederum ist aufgrund der simultanen Gefahr von Thrombosierung und Blutung äußerst komplex. Es sind zahlreiche selbstverstärkende Interaktionen zwischen Inflammation und Gerinnung bekannt, weshalb Untersuchungen zur medikamentösen Intervention im Gerinnungssystem sowohl unter prophylaktischen wie auch therapeutischen Aspekten besonders interessant und notwendig erscheinen. Insbesondere der Faktor Xa-Hemmer Rivaroxaban und der Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel werden in der modernen Medizin zunehmend angewandt und von einer großen Anzahl an Patienten täglich zur Verhütung thrombembolischer Ereignisse eingenommen. Vor diesem Hintergrund haben wir unter Anwendung dieser beiden Wirkstoffe untersucht, ob die jeweils selektive Blockade des plasmatischen bzw. zellulären Schenkels des Gerinnungssystems einen möglichen präventiven Effekt auf die septische Koagulopathie, respektive die Sepsis-getriggerte DIG, ausüben kann. Um die qualitative Wirksamkeit der Medikamente in vivo unter wissenschaftlichen Kautelen zu prüfen, wurde zunächst die iatrogen ausgelöste Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) als bereits etabliertes Modell der schweren Sepsis angewendet und anhand der vier Kriterien der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase (ISTH) auf die Entwicklung einer DIG überprüft. 20 Stunden nach Sepsisinduktion trat bei den Versuchsmäusen eine signifikante Thrombozytopenie ein, verbunden mit einem D-Dimer-Anstieg sowie einem rotationsthrombelastometrisch gemessenen, systemisch-hypokoagulatorischen Zustand. Ein, entgegen den ISTH-Vorgaben, detektierbarer Fibrinogenanstieg ist mit hoher Wahrscheinlichkeit einer starken Akut-Phase-Reaktion in der murinen Sepsis geschuldet. Zum weiteren Verständnis der Gerinnungssituation in der CASP wurden Rolle und Funktionalität der Thrombozyten und deren Regeneration durch das Hormon Thrombopoietin näher beleuchtet. Mittels eines Aktivierungsassays konnten wir konstatieren, dass murine Thrombozyten in der Sepsis generell schwächer auf agonistische Reize reagierten, sich das Zellalter jedoch nicht auf deren Reagibilität auswirkte. Die prophylaktische Gabe von Rivaroxaban und Clopidogrel führte in den septischen Mäusen zu einer weniger starken Thrombozytopenie und zu geringeren Thrombozytenagglomeraten in den Lebern. Unter Clopidogrelprophylaxe zeigten sich auch weitere signifikant mildernde Effekte auf den D-Dimer-Spiegel und den Fibrinogenanstieg. Jedoch konnten der globale hypokoagulatorische Gerinnungszustand, ebenso wie die Serumaminotransferasen als Marker des Leberversagens unter beiden Medikamenten nicht auf signifikante Weise verändert werden. Allerdings manifestierte sich insbesondere unter Thrombozytenaggregationshemmung eine deutlich abgeschwächte proinflammatorische Reaktion in der CASP. Zusammenfassend ergab sich in der CASP bei Blockade des Faktors Xa ein geringer prophylaktischer Effekt durch Rivaroxaban, wohingegen sich die Thrombozytenaggregationshemmung unter Clopidogrel mit einer signifikant gedämpften septischen Inflammation und Koagulopathie und einem deutlich günstigerem Gesamtbild äußerte.
Die obere gastrointestinale Blutung ist trotz aller Verbesserungen des Blutungsmanagements in den letzten Jahren noch immer mit einer hohen Mortalität verbunden. Dabei stellt vor allem das Auftreten von Rezidivblutungen nach endoskopischer Blutstillung, einen wesentlichen Risikofaktor dar. Die transarterielle Katheterembolisation (TAE) gilt dabei bei unkontrollierbaren Ulkusblutungen bereits als etabliertes therapeutisches Verfahren und verdrängt zunehmend die Blutungschirurgie, welche mit hohen Morbiditäts- und Letalitätsraten verbunden ist. Um das Outcome jedoch weiter zu verbessern, ist zusätzlich zur Verwendung weniger invasiver Verfahren, wie der TAE, die Vermeidung von Rezidivblutungen erforderlich. Ein neues Konzept besteht deshalb in der prophylaktischen TAE der Arteria gastroduodenalis nach entsprechender endoskopischer Blutstillung bei Hochrisikopatienten mit einem blutenden Ulcus duodeni. Ziel dieser Arbeit war es nun zum ersten Mal die Effizienz und Machbarkeit dieses Konzeptes zu analysieren. Sämtliche Patienten, welche im Auswertungszeitraum (2008 – 2012) aufgrund eines blutenden Ulcus duodeni am HELIOS Klinikum Erfurt therapiert wurden, sind in diese retrospektive Arbeit eingeschlossen worden. Dabei wurden Patienten mit einem niedrigen Rezidivblutungsrisiko konservativ behandelt, während Patienten mit einem hohen Rezidivblutungsrisiko eine prophylaktische TAE nach endoskopischer Blutstillung erhielten. Der technische Erfolg der prophylaktischen TAE lag dabei bei 98% und der klinische Erfolg bei 87%. Bei Patienten mit TAE bei unkontrollierbarer Blutung konnte in 100% ein technischer Erfolg und in 93% ein klinischer Erfolg ohne weiteren Blutungshinweis erzielt werden. Majorkomplikationen traten dabei bei der prophylaktischen TAE nur in 4% der Fälle auf. Die mit der Ulkusblutung assoziierte Letalität lag dabei insgesamt bei 4,3%. Ein chirurgisches Vorgehen aufgrund einer Blutung war nur noch in einem einzelnen Fall (0,9%) notwendig. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Konzept einer prophylaktischen TAE bei Hochrisikopatienten sicher und effizient durchführbar ist. Durch ein derartiges Vorgehen lassen sich Rezidivblutungen verhindern und das Outcome deutlich verbessern. Die Blutungschirurgie hingegen gerät dabei immer mehr in den Hintergrund und muss nur noch in Ausnahmefällen durchgeführt werden.
Der „cholinerge antiinflammatorische Signalweg“ beschreibt einen vagalen, neuroimmunologischen Reflexmechanismus, der einen hemmenden Einfluss auf Immunzellen des Retikuloendothelialen Systems in lokalen und generalisierten Entzündungsgeschehen ausübt. Vermittelt wird dieser Reflexmechanismus über den α7-Subtyp des nikotinischen Acetylcholinrezeptors auf Makrophagen. Die in der Leber lokalisierten Kupffer-Zellen repräsentieren ca. 80 – 90% der Gewebsmakrophagen des Körpers. Während die neuroimmunologische Regulation von Peritoneal- und Alveolarmakrophagen sowie Monozyten durch den N. vagus gut dokumentiert ist, ist die Rolle der Kupffer-Zellen im „cholinergen antiinflammatorischen Signalweg“ noch unbekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurde der parasympathische Einfluss auf die residente Makrophagenpopulation der Leber, die Kupffer-Zellen, untersucht. Nikotin als Agonist am α7nAChR zeigte in vitro im LPS-Modell keine Alteration der Zytokinantwort von Kupffer-Zellen aus nativen C57Bl/6-Mäusen. Hingegen führte die subdiaphragmale Vagotomie zu einer Reduktion der in vitro TNF-α-Antwort von Kupffer-Zellen nach Stimulation mit LPS.
Die Daten dieser Arbeit erweitern den Wissensstand über die neuroimmunologische Interaktion zwischen Parasympathikus und den residenten Makrophagenpopulationen des Körpers. In Analogie zur sympathischen Regulation des Immunsystems, das abhängig vom angesprochenen Rezeptortyp sowohl pro- als auch antiinflammatorisch wirken kann, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu murinen Kupffer-Zellen darauf hin, dass auch der Parasympathikus, neben seinen bekannten antiinflammatorischen Eigenschaften, kompartimentalisiert ebenfalls proinflammatorisch wirken könnte.
Diese Arbeit befasste sich mit dem Einfluss der tumorassoziierten Makrophagen (TAM) auf die 6606-PDA-Pankreaskarzinomzellen in vivo und in vitro. Bei der Betrachtung der Interaktion zwischen Tumorzellen und Makrophagen in vitro zeigte sich, dass die Pankreaskarzinomzellen ein Milieu erzeugten, in dem sich M1-Makrophagen zu M2-Makrophagen differenzierten. Des Weiteren wurde anhand des Vitalitätsassays nachgewiesen, dass M2-Makrophagen einen stimulierenden Effekt auf die Tumorzellproliferation hatten, während M1-Makrophagen die Tumorzellproliferation hemmten. Im Mausmodell wurde der Einfluss der Makrophagen untersucht. Hierbei wurde die Infiltration von Makrophagen in das Pankreaskarzinom nachgewiesen. Durch medikamentöse Makrophagen-Reduktion wurde signifikant die Rekrutierung von Makrophagen in die Pankreaskarzinome der Versuchstiere verringert. Unter Reduktion der TAM kam es zu einem signifikant verminderten Tumorwachstum und zu einer deutlich verringerten Tumorangiogenese. Für das Tumorwachstum sind MMP (Matrix Metallo Proteinasen) wichtige Voraussetzung. Der Gehalt von MMP-9 und MMP-12, welche von Makrophagen produziert werden können, ergaben keinen signifikanten Unterschied in beiden Versuchsgruppen. Hier muss die Fähigkeit der Tumorzellen, diese Enzyme selbst zu produzieren, als mögliche Ursache für die ähnlich hohe Expression trotz Reduktion der TAM-Infiltration diskutiert werden. Die Bestimmung von VEGF in den Tumoren und in den Seren der Versuchstiere ergab einen Anstieg dieses Wachstumsfaktors in der Gruppe mit Makrophagen-Reduktion. Der höhere VEGF-Gehalt in den Tumoren mit verminderter Makrophagen-Infiltration kann als Ausdruck der Tumorhypoxie und der fehlenden Mikrovaskularisation sowie als Versuch der Makrophagen-Rekrutierung interpretiert werden. Die Betrachtung der Interleukin-Expression unter Makrophagen-Reduktion zeigte, dass MCP-1 im Serum der Versuchsgruppe mit TAM-Reduktion signifikant erhöht war. Ebenfalls wurde in den Tumoren selbst ein hoher Gehalt an MCP-1 nachgewiesen. MCP-1 ist ein sehr potenter Mediator der Makrophagen-Migration. Seine Expression könnte als Folge der verminderten Makrophagen-Population ebenfalls kompensato-risch erhöht gewesen sein. Mit dem Nachweis von IL-4 und IL-10 im Tumorgewebe, auch unabhängig von der Infiltration durch Makrophagen, konnte die Präsenz zweier wichtiger Induktoren der alternativen Makrophagen-Aktivierung bewiesen werden. Dies stützt die Hypothese, dass die Differenzierung der M2-Makrophagen im Tumorgewebe selbst stattfindet. Das Pankreaskarzinom ist eine maligne Erkrankung, für deren Therapie nach wie vor nur begrenzte Maßnahmen zur Verfügung stehen. Ein präziseres Verständnis der Pa-thogenese ist daher von großer Wichtigkeit. Durch nähere Betrachtungen des Tumor-mikromilieus und der Wechselwirkungen zwischen Immunsystem und Tumorzellen könnte es möglich sein, neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von Patien-ten mit einem Pankreaskarzinom zu generieren. Insbesondere könnte die Hemmung der M2-Makrophagendifferenzierung sowie die Induktion von M1-Makrophagen im Tumor für die Therapie des Pankreaskarzinoms ein vielversprechender Ansatz sein.