Das FollikulĂ€re Lymphom ist ein kleinzelliges, langsam wachsendes und indolentes Non-Hodgkin-Lymphom, welches eine geschlechtsunabhĂ€ngige Erkrankung des mittleren Alters darstellt [17, 46, 52, 59]. Die t(14;18)-Translokation kann als zusĂ€tzlicher Marker zur Diagnostik eines FL eingesetzt werden, da in bis zu 95% die Detektion dieser ChromosomenverĂ€nderung gelingt. Um ein solch hohes Resultat zu erzielen, reicht die Standard-PCR-Methode mit den Primern mbr und / oder mcr nicht aus. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue PCR-Methode entwickelt: die Multiplex-PCR. Durch eine Kombination von 12 bcl-2-Primern mit 6 JH-Primern ist die Multiplex-PCR im Stande, Bruchpunkte zwischen den Bereichen mbr und mcr auf dem Chromosom 18, sowie auf den einzelnen Verbindungselemente des Chromosoms 14 aufzudecken. FĂŒr die PCR-Analyse stehen 40 Patienten zur VerfĂŒgung, welche im Zeitraum zwischen Februar 1989 und November 2005 in der Klinik fĂŒr HĂ€matologie und Onkologie der Ernst-Moritz-Arndt-UniversitĂ€t Greifswald diagnostiziert bzw. therapiert wurden. Als Voraussetzungen werden ausreichende Materialien und vorhandene Daten aus der Standard-PCR angesehen. Die mittlere Beobachtungszeit betrĂ€gt 62,5 Monate. Der bcl-2-Nachweis mittels Immunhistochemie gelingt in 94%. Insgesamt lassen sich mit der Standard- und der neuen Multiplex-PCR lediglich bei 50% der Patienten eine Translokation nachweisen. Wobei die Standard-PCR mit dem mbr-Primer 18/40 und die Multiplex-PCR alleine 16 der 40 Erkrankten positiv detektiert. FĂŒnf positiv getestete Patienten mittels der Standard real-time PCR und 1 Patient der Multiplex-PCR weisen Ergebnisse im Normalpersonenbereich auf. Eine sichere Lymphomassoziation ist daher nicht gegeben. Damit lassen sich wahrscheinlich mit der Standard-PCR 13, mit der Multiplex-PCR 15 lymphomassoziierte Translokationen aufspĂŒren. Von den 16 Patienten mit t(14;18)-Translokation in der Multiplex-PCR sind 81% in der mbr und 19% in der icr auf Chromosom 18 lokalisiert. Durch die neue PCR-Methode können bei 69% der t(14;18)-Translokation Bruchpunkte in der JH6-Region, bei 12% bzw. 19% in den Bereichen JH4 und JH5 des Chromosoms 14 gefunden werden. Die PCR-Ergebnisse liegen im Mittel der europĂ€ischen Bearbeitungen. Die neu entwickelte Multiplex-PCR detektiert bei 3 Patienten eine Translokation im icr-Bereich, von denen 2 vermutlich durch ein FL bedingt sind. Eine Weiterentwicklung, sowie die Testung der Multiplex-PCR an weiteren Patientenproben sind erforderlich.
Die t(14;18)-Translokation ist eine zufĂ€llig und spontan auftretende Aberration, die bei Ver-wendung hoch sensitiver PCR-Methoden in ĂŒber 60 % aller gesunden Menschen detektiert werden kann. Diese Translokation wird darĂŒber hinaus als initiales Ereignis in der Pathogene-se des follikulĂ€ren Lymphoms angesehen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Assozia-tion zwischen dem Alter und der PrĂ€valenz und Frequenz zirkulierender t(14;18)-positiver Zellen bei gesunden Personen besteht. Dazu wurden ĂŒber 700 gesunde Menschen mit Hilfe der quantitativen real-time PCR auf die PrĂ€valenz und Frequenz t(14;18)-positiver B-Zellen untersucht. Im peripheren Blut von Kindern bis 9 Jahren konnten keine zirkulierenden t(14;18)-positive Zellen nachgewiesen werden. Ab dem zehnten Lebensjahr steigt die PrĂ€valenz bis zum vier-zigsten Lebensjahr signifikant auf 65 % an und weist eine starke Korrelation mit dem Alter auf. Die mediane PrĂ€valenz der zirkulierenden t(14;18)-positiven Zellen aller getesteter ge-sunder Personen betrug 46 % (327 von 715). Nur 4,3 % (31 von 715) der untersuchten Perso-nen hatten mehr als eine t(14;18)-positive Zelle pro 25000 PBMNC (> 40 / 106) und waren bis auf eine Ausnahme ĂŒber 40 Jahre alt. Untersucht wurden auĂerdem Tonsillen, Knochenmark, Lymphknoten und Milz von gesunden Probanden im Alter zwischen 0 bis 32 Jahren. In allen untersuchten lymphatischen Gewebsproben von Neugeborenen konnten keine t(14;18)-positive Zellen detektiert werden. Bei gesunden Personen im Alter zwischen 17 und 32 Jahren wurden t(14;18)-positive Zellen mit den höchsten Frequenzen in den Tonsillen und der Milz nachgewiesen und nur zwei Knochenmarksproben enthielten t(14;18)-positive Zellen. Diese Ergebnisse werden das VerstĂ€ndnis ĂŒber die Relevanz von t(14;18)-positiven Zellen in gesunden Menschen als ein Risiko-Marker im Bezug auf die Entwicklung zu einer Vorstufe zum Lymphom weiter verbessern.
In der vorliegenden Arbeit wurden 40 nicht vorbehandelte Patienten mit histologisch gesichertem follikulĂ€ren Lymphom Stadium III oder IV nach MCP-Chemotherapie oder MCP-Chemotherapie plus Rituximab auf das Erreichen einer molekularen Remission, Einfluss des Behandlungsarms auf eine molekulare Remission und deren möglicher prognostischer Bedeutung untersucht. Als Material standen Blut- und Knochenmarkproben zur VerfĂŒgung, die vor, wĂ€hrend und nach der Behandlung gewonnen wurden. Dabei wurde DNA aus mononukleĂ€ren Zellen mit Hilfe der real-time PCR auf molekulare Marker wie t(14;18)-Translokation bzw. spezifische rearrangierte CDR 3-Region getestet. Der Unterschied der initialen medianen Zahl zirkulierender Lymphomzellen im peripheren Blut zeigte sich als nicht statistisch signifikant. Einen Zusammenhang zwischen der initialen Zahl zirkulierender Lymphomzellen und dem klinischen Ansprechen konnten wir nicht nachweisen. Das klinische Gesamtansprechen (partielle und komplette Remissionen) lag in der R-MCP Gruppe der MRD-Studie bei 100% gegenĂŒber 71% in der MCP-Gruppe. Die Rate der kompletten Remissionen lag bei Patienten aus dem R-MCP-Therapiearm bei 75% und in dem MCP-Therapiearm bei 29%. Auch auf molekularer Ebene war die Chemoimmuntherapie der alleinigen Chemotherapie deutlich ĂŒberlegen. Im R-MCP-Therapiearm erreichten 83% (19/23) der Patienten eine molekulare Remission, im MCP-Arm erreichte kein Patient eine molekulare Remission. Bei 100% der Patienten im R-MCP-Therapiearm konnte eine Lymphomzellzahlreduktion von mindestens 2 log-Stufen nachgewiesen werden, im MCP-Therapiearm waren es 6 Patienten (40%). FĂŒr Patienten mit einer CLC-Reduktion â„ 2 log konnte noch kein medianes EFS festgelegt werden (noch nicht erreicht), gegenĂŒber einem EFS von 24 Monaten im Falle einer CLC-Reduktion < 2 log. Somit zeigte sich eine CLC-Reduktion um mindestens 2 log-Stufen als wichtigster prognostischer Parameter fĂŒr einen Erfolg der Therapie. Wir konnten zeigen, dass die Behandlung mit R-MCP zu einer wesentlich effektiveren Reduktion zirkulierender Lymphomzellen und damit zu einer wesentlich höheren Rate von molekularen Remissionen fĂŒhrte, als die Behandlung mit einer alleinigen MCP-Chemotherapie. Insgesamt betrachtet ist das wohl bedeutsamste Ergebnis der Stellenwert einer CLC-Reduktion um mindestens 2 log-Stufen. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit der prognostisch wichtige Stellenwert eines quantitativen MRD-Monitorings bestĂ€tigt werden.
Das ZellerkennungsmolekĂŒl Tenascin-R spielt eine wichtige Rolle fĂŒr die synaptische PlastizitĂ€t im zentralen Nervensystem und fĂŒr die Regulation des Verhaltens von SĂ€ugetieren. Viele der Erkenntnisse ĂŒber in vivo - Funktionen von Tenascin-R wurden durch Untersuchungen der durch Insertion eines Neomycin-Resistenzgens in das Tnr-Gen hergestellten Tenascin-R-Knockout-MĂ€use (Tnr-/-) erlangt. So weisen Tenascin-R-Knockout-MĂ€use im Vergleich zu Wildtyp-Maus (Tnr+/+) Tieren ein deutlich Ă€ngstlicheres Verhalten und starke Defizite in der Motorkoordination auf. In der vorliegenden Arbeit sollten mögliche molekulare Mechanismen, welche die groĂen Unterschiede zwischen dem Verhalten der Mutante und dem wildtypischer MĂ€use verursachen könnten, untersucht werden. Gene, deren Expression im Gehirn von Tenascin-R-Knockout-MĂ€usen im Vergleich zum Gehirn von Tnr+/+-MĂ€usen dysreguliert sind, sollten mit Hilfe von Expressionsprofilen identifiziert werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsprofilen der beiden Genotypen waren relativ gering. Dem am stĂ€rksten dysregulierten und daher eingehender untersuchten Transkript Gas5 fĂ€llt eine ungewöhnliche Funktion zu. Durch enzymatische Prozessierung entstehen aus dem PrimĂ€rtranskript von Gas5 neun kleine nucleolĂ€re RNAs (small nucleolar RNAs, snoRNAs). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der Expression von Gas5 auch die einer seiner snoRNAs, nĂ€mlich U44, in Tnr-/--MĂ€usen im Vergleich zu Tnr+/+-MĂ€usen in allen untersuchten Organen dramatisch verringert ist. Um einen in Betracht gezogenen dysregulationsauslösenden unspezifischen Effekt durch die zur Herstellung der TNR-/--Maus verwendeten Neomycinkassette auf die Expression von Gas5 auszuschlieĂen, wurde eine zweite Tenascin-R-Knockout-Mauslinie mit Hilfe einer Neomycinkassetten-unabhĂ€ngigen Methode hergestellt. Beide Dysregulationen konnten mit dieser Methode, bei der das mit loxP-Elementen flankierte erste kodierende Exon des Tenascin-RGens durch die separat exprimierte Cre-Rekombinase herausgeschnitten wurde, bestĂ€tigt werden. Erstaunlicherweise wurde diese Abnahme der Expression von Gas5 und U44 auch bei MĂ€usen beobachtet, die keine Cre-Rekombinase exprimierten, sondern die nur die loxP-Flankierung des ersten codierenden Exons von Tnr aufwiesen. Daher wurde fĂŒr die Dysregulation des Gas5- Transkriptes die Zerstörung eines regulatorischen Elementes, welches zur post-transkriptionalen Regulation von U44 und Gas5 fĂŒhrt, im Tnr-Gen postuliert. Nach heutigem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel dafĂŒr, dass das EinfĂŒgen von loxP-Sequenzen in ein Mausgen die Expression eines benachbarten Gens selektiv beeinflusst. Ferner wurde erstmals das Expressionsmuster der aus Gas5- PrimĂ€rtranskripten gebildeten snoRNAs in verschiedenen Organen analysiert. Dabei zeigte sich, dass in jedem Organ deutlich verschiedene Mengen der einzelnen snoRNAs vorliegen, aber auch, dass jede einzelne snoRNA von Organ zu Organ groĂe Expressionsunterschiede aufweist. Dies wirft die Frage auf, welche Bedeutung Gas5 und dessen snoRNAs, speziell U44, fĂŒr die Physiologie der Zellen des ZNS und somit letztlich fĂŒr das Verhalten der Maus haben. Zur KlĂ€rung, ob Gas5 fĂŒr die bei der Tenascin-R defizienten-Maus beobachteten VerhaltensauffĂ€lligkeiten verantwortlich sein könnte, wurden Untersuchungen durchgefĂŒhrt, welche zeigten, dass das basale Gas5-mRNAExpressionsniveau Unterschiede im Angstverhalten bzw. in der Stressantwort von C57Bl/6-MĂ€usen erklĂ€ren könnte. Die Verhaltensanalysen zeigten, dass die basale Expression der Gas5-mRNA im Hippocampus, aber nicht im restlichen Gehirn negativ mit stressanzeigenden Parametern des open field - und des elevated plus maze âTests korreliert. Mit der Leistung der MĂ€use im water maze-Test, einer rĂ€umlichen Lernaufgabe, korrelierte die Gas5-Expression hingegen nicht. Dies deutet darauf hin, dass der Gas5-Level fĂŒr die hippocampale Stress- und Angstantwort wichtig ist, allerdings nicht fĂŒr das rĂ€umliche GedĂ€chtnis. DarĂŒber hinaus ist die Expression von Gas5, aber nicht die seiner snoRNAs, 24 h nach einem, fĂŒr die Maus stark stressauslösenden, olfaktorischen Kontakt mit einer Ratte um bis zu 50 % erhöht. Die Tenascin-R-mRNA-Menge ist bei denselben MĂ€usen um 25 % vermindert. Diese Gas5-mRNA-Expressions-Ănderung wird hingegen nicht bei einem gemilderten Stressreiz, wie einer neuen Umgebung, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass geringe Stressoren wie eine neue Umgebung nicht ausreichen, um die Gas5-Expression zu stimulieren, starke Stressoren wie Rattenkontakt hingegen zu einem Anstieg der Gas5-Expression fĂŒhren. Gas5 scheint eine wichtige Funktion bei der Verarbeitung von Stress einzunehmen. Diese Verarbeitung könnte in der Tenascin-R defizienten-Maus derart gestört sein, dass eine normale Stressantwort nicht möglich ist und sich diese somit letztlich auch auf die motorischen FĂ€higkeiten der Tenascin-R defizieten Maus auswirkt.
Zusammenfassung Das Simian Virus 40 (SV40) ist ein sehr potentes DNA Tumorvirus. Sein natĂŒrliches Infektionsreservoir sind Rhesus Affen (Maccaca mulatta) in Nord Indien. Seit seiner Entdeckung im Jahre 1960 in Nierenzellkulturen von Affen, die zur Gewinnung menschlicher Impfstoffe verwendet wurden, gibt es sehr widersprĂŒchliche Befunde bezĂŒglich einer möglichen Rolle des Virus bei der Entstehung verschiedener maligner menschlicher Tumoren. Mit sehr unterschiedlicher Frequenz - zuletzt in zwei amerikanischen Publikationen bei bis zu 40% der Patienten - konnten in einigen Studien bei Patienten mit malignen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) DNA Sequenzen des "Large T-Antigens" des SV40 mit Hilfe sensitiver PCR-Techniken nachgewiesen werden. Um festzustellen, ob SV40 DNA Sequenzen auch bei deutschen Patienten in malignen Lymphomzellen zu finden sind, und ob eine klonale Beziehung zwischen Virus und Tumorzelle besteht, untersuchten wir malignes Lymphomgewebe von 27 Patienten mit NHL und 6 Patienten mit Hodgkin Lymphomen, periphere mononukleĂ€re Zellen (PBMNC) mit quantitativ bestimmtem Lymphomzellgehalt von 47 Patienten mit NHL und 61 Kontrollen, 14 Lymphknoten ohne Lymphombefall und 46 PBMNC von gesunden Freiwilligen. FĂŒr den Nachweis von SV40-DNA-Sequenzen etablierten wir eine hoch-sensitive quantitative real-time PCR fĂŒr das SV40 "Large-T-Antigen" Gen, um den direkten qualitativen und quantitativen Nachweis von SV40 DNA-Kopien an Blut, Knochenmark und lymphatischem Gewebe von Patienten mit malignen Lymphomen und Kontrollpersonen zu ermöglichen. Um zu gewĂ€hrleisten, daĂ virale DNA von BK- und JC-Virus nicht zu falsch positiven PCR Ergebnissen fĂŒhren konnte, wurde fĂŒr die real-time PCR nach dem Taqman-Prinzip eine Fluoreszenzsonde ausgewĂ€hlt, die ausschlieĂlich mit SV40-DNA reagieren kann. In den peripheren Blutproben der NHL Patienten waren zirkulierende Lymphomzellen ĂŒber den Nachweis Lymphom-spezifischer Translokationen, wie z.B. der t(14;18) und t(11;14) Translokation, bzw. ĂŒber das klonale VDJ- Rearrangement des IgH-Locus quantitativ bestimmt worden. Um die Intaktheit und Amplifizierbarkeit der isolierten zellulĂ€ren DNA festzustellen, wurden die Proben auf EBV und K-ras getestet. Das K-ras Gen diente auĂerdem als Referenzgen, um den Gehalt zellulĂ€rer DNA, ausgedrĂŒckt in Genkopien zellulĂ€rer DNA (2 Genkopien K-ras/Zelle), im Einzeltest zu bestimmen. Durch den Vergleich der quantitativen Bestimmung der zirkulierenden Lymphomzellen und der SV40 Genomkopien wĂ€re es im positiven Fall möglich, die Frage nach einer direkten Assoziation von SV40 mit den Tumorzellen maligner Lymphome zu beantworten. Keine der 47 Lymphknotenproben enthielt SV40 DNA bei einer SensitivitĂ€t von 1-3 Kopien in 50.000 bis 100.000 Zellen. Auch konnten keine SV40 DNA Sequenzen in den DNA Proben, die von PBMNC von 47 NHL Patienten isoliert worden waren und zwischen 0,1% und >90% Lymphomzellen enthielten, nachgewiesen werden. Zum Vergleich waren 30/46 (65,2%) der Proben positiv fĂŒr EBV-DNA: sie enthielten zwischen 5 und 82.800 EBV Kopien pro 100.000 Zellen, ein Beweis fĂŒr die Möglichkeit, an den isolierten DNA-PrĂ€parationen virale DNA-Kopien zu quantifizieren. Diese Ergebnisse schlieĂen eine direkte klonale Assoziation des SV40 Virus mit malignen Lymphomzellen in allen untersuchten Proben aus. In Ăbereinstimmung mit neueren Daten aus Italien, Spanien, England, Frankreich und Kanada sprechen auch unsere Ergebnisse dafĂŒr, daĂ SV40 keine wesentliche Rolle bei der Ătiologie und Pathogenese maligner Lymphome spielt.
