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Zerebrale kavernöse Malformationen sind Gefäßfehlbildungen des menschlichen zentralen Nervensystems, die mit einer Prävalenz von etwa 1:650 in der Bevölkerung auftreten und zu rezidivierenden Kopfschmerzen, Krampfanfällen und Gehirnblutungen führen können. Diese Läsionen treten sowohl sporadisch als auch als Konsequenz von erblichen Mutationen (familiäre Kavernomatose) mit unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität auf. Kausale Mutationen sind für die Gene CCM1 ( KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10) beschrieben. Die vorliegende Dissertationsarbeit mit dem Titel „Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Kandidatengens für kavernöse Gefäßmalformationen des zentralen Nervensystems“ hatte die Suche neuer CCM-assoziierter Gene und deren Beschreibung zur Aufgabe. Als Ausgangspunkt dienten fünf Indexpatienten aus der Kohorte Stahl et al. 2008, bei denen keine ursächliche Mutation in den bekannten CCM-Genen identifiziert werden konnte. Die Exomsequenzierung mittels SOLiD™ 5500XL ergab für die vier isolierten und den familiären Fall mehr als 210.000 Varianten. Nach Filterung und Priorisierung dieser Veränderungen wurden acht Kandidatengene definiert, von denen fünf mittels klassischer Sanger-Sequenzierung validiert werden konnten. Das vielversprechendste Kandidatengen, FAM222B (C17orf63), in dem 2012 keine Loss-of-function Mutationen bekannt waren und das für ein Protein unbekannter Struktur und Funktion kodiert, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Zunächst konnten durch einen Yeast Two-Hybrid Screen Interaktionspartner identifiziert werden, die sich in die bekannten CCM-Signalwege integrieren ließen. Funktionelle Studien mittels Morpholino- und TALEN-Technik im Zebrafischmodell und mit humanen Nabelschnurvenenendothelzellen zeigten jedoch keinen signifikanten Effekt von FAM222B auf die Angiogenese. Auch eine detaillierte Bewertung der Informationen, die erst Ende 2014 in der ExAC-Datenbank veröffentlicht wurden, spricht in Zusammenschau mit den experimentellen Daten eher dagegen, FAM222B als neues Kandidatengen für die Entstehung von CCMs einzustufen. Parallel zu den funktionellen Studien wurde die Kohorte von Stahl et al. 2008 kontinuierlich erweitert. Bei den molekulargenetischen Analysen fanden sich mehr kausale Mutationen im CCM3-Gen als bisher angenommen. Ferner konnte gezeigt werden, dass rund ein Drittel der Probanden vor Erreichen des Erwachsenenalters und ein Fünftel der Mutationsträger bereits vor dem 10. Lebensjahr erkranken.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind vaskuläre Fehlbildungen des zentralen Nervensystems, welche sich klinisch durch epileptische Anfälle, fokale neurologische Ausfälle und Kopfschmerzen äußern. Sie treten sowohl sporadisch als auch im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Krankheitsassoziierte Varianten wurden in drei Genen beschrieben: CCM1, CCM2 und CCM3. Patienten mit pathogenen Varianten im CCM3-Gen fallen häufig durch einen schwereren Phänotyp und ein früheres Manifestationsalter auf. Der genaue Verlauf der molekularen CCM-Pathogenese ist jedoch bisher nicht ausreichend verstanden. In dieser Arbeit wurde deshalb die Entwicklung eines humanen in vitro Modells in den Fokus gestellt. Im Gegensatz zu bisher publizierten Studien, die auf einer transienten Herunterregulation von CCM3 beruhen, wurden hier die Folgen eines Langzeit-CCM3-Verlustes untersucht. Unter Verwendung der Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems wurde ein Modell etabliert, welches die komplette Inaktivierung von CCM3 in kavernösen Endothelzellen von Trägern heterozygoter pathogener Keimbahnvarianten nachahmt.
In humanen Endothelzellen führte die CRISPR/Cas9-vermittelte CCM3-Inaktivierung zu veränderten endothelialen Eigenschaften, welche die Morphologie, die Apoptoseinduktion, die Stabilität kapillarähnlicher Strukturen sowie die Sphäroidorganisation umfassen. Zudem kam es zu einer vermehrten Aktin-Stressfaserbildung. Auf molekularer Ebene war eine veränderte Expression von Genen zu beobachten, deren Produkte eine Rolle in der Regulation von Zellverbindungen, der Zellmembran oder der extrazellulären Matrix spielen. Insbesondere das unter Basalbedingungen stark in Endothelzellen exprimierte Fibronektin war signifikant herunterreguliert. Die Zugabe exogenen Fibronektins konnte die Zellmorphologie, die Sphäroidorganisation und die kortikale Anordnung des Aktin-Zytoskelettes normalisieren. Da auch nach CRISPR/Cas9-induzierter Inaktivierung von CCM1 und CCM2 diese Effekte beobachtet werden konnten, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Aufbau einer intakten fibronektinhaltigen endothelialen Matrix von der Funktionalität der CCM-Proteine abhängt. Künftige Studien werden die Modulation der gestörten endothelialen Apoptoseinduktion als neuen Ansatz zur Identifizierung medikamentöser Therapieoptionen adressieren.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind Gefäßfehlbildungen im Gehirn oder Rückenmark und können sich klinisch aufgrund einer erhöhten Blutungsbereitschaft mit Kopfschmerzen, Gefühls- und Sprachstörungen bis hin zu Krampfanfällen äußern. Sie treten sporadisch oder im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Kausale Sequenzveränderungen sind dabei in den drei Genen CCM1, CCM2 und CCM3 bekannt. Die Detektionsrate für pathogene Varianten ist mit bis zu 60 % für sporadische Fälle und mit weit über 90 % für familiäre Fälle sehr hoch. Während Genpanel-Analysen sehr verlässlich Einzelnukleotidveränderungen, kleine Insertions- und Deletionsvarianten sowie Kopienzahlveränderungen detektieren können, werden komplexe Strukturvarianten oder Veränderungen in nicht-kodierenden Regionen kaum erfasst. Diese rücken jedoch für die bisher genetisch unaufgeklärten Fälle immer mehr in den Fokus des Interesses. Diese Arbeit adressiert daher zum einen die Identifizierung neuer Strukturvarianten und deren funktionale Interpretation im Kontext der CCM-Erkrankung.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist der erstmalige Nachweis einer interchromosomalen Insertion bei einem CCM-Patienten gelungen. Die unbalancierte Insertion genomischen Materials von Chromosom 1 in die kodierende Region des CCM2-Gens konnte durch die Verbindung von bioinformatischen Auswertestrategien der Next Generation Sequencing-Genpanel-Daten, molekularzytogenetischen Analysen und einer molekularen Bruchpunktkartierung genau charakterisiert werden. Die Identifikation einer weiteren Strukturvariante, einer Deletion des Transkriptionsstarts von CCM1, verdeutlichte die Herausforderungen bei der Bewertung von Veränderungen in nicht-kodierenden Genbereichen. Für eine eindeutige Klassifikation der Variante wurden daher funktionale Analysen durchgeführt, die auf einer CRISPR/Cas9-vermittelten Nachbildung der Deletion in iPSCs und der anschließenden Differenzierung in Endothelzellen beruhte. Damit konnte gezeigt werden, dass die Deletion zu einem Verlust der CCM1 mRNA- und Proteinexpression führt. Zudem wurde in den differenzierten Endothelzellen eine für die CCM-Pathogenese charakteristische Deregulation von KLF2, THBS1, NOS3 und HEY2 beobachtet. Schließlich war es auf Basis dieser in vitro-Analysen möglich, die Variante entsprechend den ACMG-Richtlinien als wahrscheinlich pathogen zu bewerten und somit die molekulare CCM-Diagnose zu sichern.
Die Verbindung des CRISPR/Cas9-Systems mit iPSCs ist nicht nur für die Variantenbewertung von großem Nutzen, sondern bietet auch das Potential zum besseren Verständnis von Krankheitsmechanismen. Ein weiterer Fokus der vorliegenden Arbeit lag daher auf der Etablierung und Verwendung iPSC-basierter Zellkulturmodelle für die CCM-Modellierung. Zunächst ist es gelungen, mehrere iPSC-Linien mit einer kompletten CRISPR/Cas9-vermittelten CCM1-, CCM2- oder CCM3-Inaktivierung zu generieren. Diese wurden anschließend für die Differenzierung in hBMEC-ähnliche Zellen und innovative dreidimensionale vaskuläre Organoide verwendet. In diesen Systemen konnte beispielsweise eindrücklich eine tumorähnliche Proliferation CCM3-defizienter Endothelzellen nachvollzogen werden, die nur in Kontakt mit Wildtyp-Zellen auftrat. RNA-Sequenzierungen in einem CCM1-basierten Knockout-Modell konnten darüber hinaus die Rolle von CCM1 als Endothel-spezifisches Suppressorgen stärken. Die im Rahmen der Arbeit etablierten Systeme werden zukünftig für weitere Fragestellungen der CCM-Pathogenese wie der endothelialen Barrierestörung eingesetzt und stellen darüber hinaus sehr gut geeignete Plattformen für die effektive Entwicklung dringend benötigter therapeutischer Ansätze dar.
Nach der Identifizierung einer Frameshift-Mutation im FAM222B-Gen im Rahmen einer Exomstudie bei einem familiären Fall sollte in der vorliegenden Arbeit die Hypothese geprüft werden, ob das Gen FAM222B im mutierten Zustand zerebrale kavernöse Malformationen verursachen kann. Mittels SANGER-Sequenzierung des kodierenden Abschnitts sollte geklärt werden, ob bei weiteren für CCM1-3 mutationsnegativen Kavernompatienten kausale Mutationen in FAM222B vorliegen. 2013 waren in FAM222B zwar Missense- und synonyme Varianten bekannt, jedoch keine Loss-of-Function-Mutationen. Als Ergebnis der hier durchgeführten Sequenzierung wurden sowohl im kodierenden als auch im nicht-kodierenden Bereich zwar seltene oder nicht beschriebene Varianten identifiziert. Der Abgleich mit Referenzdatenbanken und die bioinformatische Bewertung ließen deren Einfluss jedoch unwahrscheinlich erscheinen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die quantitative Untersuchung des FAM222B-Gens zum Nachweis von größeren Deletionen. Auch hier konnten jedoch keine größeren Allelverluste nachgewiesen werden. Letztlich konnte bei keinem der 27 mutationsnegativen Indexpatienten eine sicher kausale Mutation in FAM222B identifiziert werden. Die gefundenen Genvarianten sind nicht als ursächlich für die Ausbildung von zerebralen Kavernomen zu werten. In Zusammenschau des Datenbankabgleiches mit aktuellen Vergleichskohorten, der bioinformatischen Bewertung, der quantitativen Analyse und der parallel durchgeführten in vivo Studie gibt es keine sichere molekulargenetische Evidenz für FAM222B als neues Kandidatengen für zerebrale kavernöse Malformationen.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind Fehlbildungen im neurovaskulären System, welche aufgrund von Krampfanfällen und hämorrhagischen Schlaganfällen zu einer stark eingeschränkten Lebensqualität führen können. Die Prävalenz von symptomatischen, autosomal-dominant erblichen CCMs auf Basis einer pathogenen Keimbahnvariante in einem der drei Gene CCM1, CCM2 oder CCM3 wird auf 1:5400 bis 1:6200 geschätzt. Durch Genpanelanalysen können sowohl Punktmutationen als auch kleine Indels und Kopienzahlveränderungen in einem parallelen Ansatz nachgewiesen werden.
Zur weiteren Aufklärung der molekularen Pathogenese hereditärer Kavernome und zur Suche nach potenziellen Therapieansätzen wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Patienten-spezifisches in vitro Zellmodell der Kavernomatose etabliert. Hierzu wurden zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (Blood Outgrowth Endothelial Cells, BOECs) aus dem Blut eines CCM-Patienten mit krankheitsverursachender heterozygoter CCM1-Keimbahnveränderung isoliert. Im Sinne der Knudson´schen Zweischrittinaktivierung zur Entstehung von Kavernomen wurde das zweite CCM1-Allel in Zellkulturen mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie ausgeschaltet. In klonal expandierten Zellkolonien konnte das Vorliegen einer Compound-Heterozygotie für die CCM1-Keimbahnvariante und eine zweite CRISPR/Cas9-induzierte loss-of-function Variante bestätigt werden.
Durch die zweite Mutation zeigten sich morphologische Veränderungen, die Störung endothelialer Zell-Zell-Verbindungen und eine vermehrte Aktin-Stressfaserbildung sowie eine deutliche Hochregulation des Transkriptionsfaktors KLF2. Zudem führte die komplette Inaktivierung des CCM1-Gens zu einer Akkumulation des von-Willebrand-Faktors (vWF). Die in der vorgelegten Arbeit erstmals beschriebene starke Anreicherung des vWF konnte in immortalisierten humanen Endothelzellen und zudem im Kavernomgewebe von Trägern pathogener CCM1-, CCM2- oder CCM3-Veränderungen bestätigt werden. Es ist daher denkbar, dass der erhöhte vWF-Spiegel im Endothel des kavernösen Gefäßkonvoluts zum lokalen hämostatischen Ungleichgewicht beiträgt.
Im Patienten-spezifischen BOEC-Modell konnte zudem erstmals in einem nicht-viralen und Plasmid-freien Ribonukleoprotein-basierten CRISPR/Cas9-Ansatz eine Mutationskorrektur der vorliegenden CCM1-Keimbahnveränderung erreicht werden. Die Ergebnisse der weiteren Kultivierungen und Amplikon-Tiefensequenzierungen zeigten jedoch sehr eindrücklich, dass der klonogene Überlebensvorteil von verbleibenden CCM1-inaktivierten BOECs zu einem deutlichen Überwachsen der korrigierten BOECs im Zellgemisch führt und eine CRISPR/Cas9-vermittelte Mutationskorrektur damit für CCM-Patient*innen keine
realistische Therapieoption darstellt. Diese Ergebnisse fließen in neue Ansätze der Therapieentwicklung ein, welche vor allem den klonalen Überlebensvorteil und die Apoptoseresistenz CCM-defizienter Zellen adressieren.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind autosomal-dominant vererbbare zerebrovaskuläre Fehlbildungen, die mit unvollständiger Penetranz zu Kopfschmerzen, Krampfanfällen und hämorrhagischen Schlaganfällen führen können. Bisher wurden drei Gene mit CCM assoziiert: CCM1 (KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10). Trotz stringenter Einschlusskriterien bleiben etwa 40 % der nicht-familiären CCM-Fälle in der molekulargenetischen Standarddiagnostik mutations-negativ.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels Hochdurchsatzsequenzierung die bisher wenig untersuchten, nicht-kodierenden Bereiche der drei Gene auf das Vorliegen putativ pathogener Varianten hin zu untersuchen. Zur Anreicherung der Zielregionen wurde hierfür ein Long-Range-PCR-Ansatz (LR-PCR) etabliert. Dessen Praktikabilität und Zuverlässigkeit wurde durch die Sequenzierung mehrerer mutations-positiver Kontrollproben bestätigt. Mit diesem Ansatz wurden 20 mutations-negative Probanden auf der MiSeq®-Plattform reanalysiert. Dabei konnten 36 bisher nicht beschriebene oder seltene Varianten in heterozygotem Zustand detektiert werden. Nach einer mehrstufigen Filterstrategie wurden 14 dieser Sequenzveränderungen als putativ pathogen priorisiert, die bei zehn Probanden auftraten.
Untersuchungen zum familiären Auftreten konnten eine Kausalität der Varianten nicht untermauern. Auch Transkriptanalysen bei fünf der zehn Probanden mit priorisierten Varianten führten nicht zum Nachweis einer funktionellen Relevanz. Für die verbleibenden fünf Fälle lagen RNA-Proben nicht vor und weitere Analysen müssten sich anschließen, um eine Kausa-lität detektierter Varianten zu bewerten.
Zusammenfassend konnte die Verlässlichkeit des bisher in der CCM-Analytik nicht beschriebenen Ansatzes einer Hochdurchsatzsequenzierung nach LR-PCR-Anreicherung zur Detektion von Sequenzvarianten in kodierenden und nicht-kodierenden Genbereichen von CCM1, CCM2 und CCM3 belegt werden. Sichere tief-intronische Spleißmutationen ließen sich in einer Zusammenschau der bioinformatischen Bewertungen und der durchgeführten experimentellen Untersuchungen jedoch nicht nachweisen. Der klinische Nutzen einer standardmäßigen Analyse der großen intronischen Bereiche der drei Gene scheint daher begrenzt. Für die mutationsnegativen Probanden müssen damit weitere genetische und nicht-genetische Ursachen in Erwägung gezogen werden.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind Gefäßfehlbildungen des zentralen Nervensystems. Diese können durch Blutungen zu rezidivierenden Kopfschmerzen, epileptischen Anfällen oder hämorrhagischen Schlaganfällen führen. CCMs treten sowohl sporadisch als auch familiär mit autosomal-dominantem Erbgang auf. Die Prävalenz für symptomatisch erbliche Kavernome liegt bei 1:5400 bis 1:6200. Es wurden pathogene Sequenzveränderungen in den Genen CCM1, CCM2 und CCM3 mit der familiären Kavernomatose assoziiert. MicroRNAs (miRNA) sind kurze, nichtkodierende RNAs, die die Expression von vielen Zielgenen regulieren können. Bisher ist wenig über die posttranskriptionale Regulation der CCM3-Expression durch miRNAs bekannt.
Durch in silico Analysen wurde die Regulation von CCM3 durch die miRNAs miR- 103a-3p, miR-30a-5p und let-7f-2-3p vorhergesagt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die Bindung dieser miRNAs an die 3'-UTR von CCM3 bestätigt werden. Die Transfektion von miR-103a-3p, miR-30a-5p- und let-7f-2-3p-Analoga in humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVECs) führte zudem zu einer signifikanten oder tendenziellen Herunterregulation der CCM3-Expression auf mRNA-Ebene. Auf Protein-Ebene wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. In vitro-Untersuchungen zur Wirkung der miRNA-Analoga auf die angiogenetischen Eigenschaften von Endothelzellen zeigten besonders nach miR-30a-5p-Transfektion einen proangiogenen Effekt auf HUVECs. Daher wurde die Wirkung dieser miRNA nachfolgend durch Transfektion eines miR-30a-5p-Inhibitors weiter untersucht. Diese führte zu einer Erhöhung der CCM3-Proteinmenge, nicht jedoch zu einer gesteigerten Expression auf mRNA-Ebene. In Übereinstimmung mit der Annahme einer proangiogenen Wirkung dieser miRNA zeigten sich negative Auswirkungen auf die angiogenetischen Eigenschaften von HUVECs nach Transfektion des miR-30a- 5p-Inhibitors. Zusammenfassend ergeben sich Hinweise, dass CCM3 von miR-103a- 3p, miR-30a-5p und let-7f-2-3p reguliert wird und dass besonders miR-30a-5p proangiogene Eigenschaften aufweist. Die Rolle der ausgewählten miRNAs bei der Pathogenese der CCMs ist jedoch nicht abschließend geklärt, wobei die Regulation von CCM3 durch ein großes, größtenteils noch unbekanntes Netzwerk von miRNAs anzunehmen ist.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind maulbeerartige Gefäßfehlbildungen, die sich klinisch in Form von rezidivierenden, migräneartigen Kopfschmerzen, epileptischen Anfällen oder hämorrhagischen Schlaganfällen äußern können. CCMs treten sowohl sporadisch als auch in einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Die Prävalenz der symptomatischen erblichen Kavernome liegt bei 1:5400 bis 1:6200. Somit zählen sie zu den seltenen Erkrankungen. Pathogene Varianten in den Genen CCM1, CCM2 und CCM3 sind mit der Entstehung der Malformationen assoziiert. Speziell Träger einer pathogenen CCM3-Variante zeigen meist ein frühes Manifestationsalter und einen schwerwiegenderen klinischen Krankheitsverlauf.
Durch in der Greifswalder Arbeitsgruppe durchgeführte Transkriptomanalysen von CCM3-/- CI-huVECs konnten die im Vergleich zu den CCM3+/+ Zellen neben FN1 (Fibronektin-1-Gen) am stärksten herunterregulierten Gene FBLN5 und POSTN identifiziert werden. Sie kodieren für Proteine der EZM. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der matrizellulären Proteine FBLN5 und POSTN erstmals im Rahmen der CCM3-Pathogenese untersucht. Weder die akute Herunterregulation von FBLN5 noch die von POSTN hatte einen Einfluss auf die Wachstumsmorphologie oder die Organisation des Aktinzytoskeletts. In Bezug auf die Angiogenese führten die akuten Herunterregulationen von FBLN5 und POSTN zu einer verminderten Ausbildung gefäßähnlicher Strukturen. Im nächsten Schritt wurde eine mögliche Rettung des Phänotyps der CCM3-/- Endothelzellen durch die Hinzugabe der rekombinanten Proteine FBLN5 und POSTN untersucht. Die Addition von rFBLN5 veränderte die Morphologie der Endothelzellen maßgeblich und führte zu einer gezielten Reorganisation des Aktinzytoskeletts. Die Supplementierung von rPOSTN wirkte im Zeitverlauf stabilitätssteigernd auf die gefäßähnlichen Strukturen und hatte einen rettenden Einfluss auf die angiogenetischen Eigenschaften der CCM3-/- Endothelzellen. In Zusammenschau mit den von Schwefel et al. (2020) publizierten Daten über Fibronektin ist davon auszugehen, dass Bestandteile der EZM eine modulatorische Rolle in der Entstehung von CCMs einnehmen. Allerdings bleibt bisher ungeklärt welche Mechanismen hierbei von Bedeutung sind.
Ziel der Arbeit war die Vervollständigung der molekulargenetischen Untersuchungen der indirekten und direkten genomischen Diagnostik bei Familien mit Hämophilie B und das Erfassen der Daten. Aus den Daten sollte eine Darstellung der Informativität und Sicherheit der klinischen, indirekten und direkten Diagnostik bei der Konduktorinnen- und pränatalen Diagnostik erfolgen. Allel- und Heterozygotenfrequenzen, evtl. vorhandene Kopplungsungleichgewichte und Rekombinationsereignisse polymorpher Restriktionsorte sollten für die deutsche Population ermittelt werden. In diesem Rahmen sollten auch Möglichkeiten und Grenzen der Heteroduplexmethode als kostengünstige Methode zum Mutationsscreening bzw. zum Nachweis bekannter Mutationen aufgezeigt werden. In ausgewählten Familien sollte der Mutationsursprung bestimmt und eventuell vorhandene Foundereffekte nachgewiesen werden. Für die Untersuchung standen 359 Probanden (hämostaseologisch bzw. klinisch voruntersuchte Indexpatienten mit HB sowie deren Familienangehörige) zur Verfügung.