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MRP4 (multi drug resistance protein 4) ist ein Transporter aus der ATP-binding-cassette Familie (ABCC4) und verfügt über ein sehr breites Substratspektrum. Dieses beinhaltet Xenobiotika u.a. Cephalosporine, Diuretika und Zytostatika sowie endogene Substanzen wie Gallensäuren, Steroide, Eicosanoide und auch Nukleotide, wie den second messenger zyklisches AMP (cAMP). MRP4 wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert u.a. in der Niere, in der Leber, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen. Über die Regulation von MRP4 ist weniger bekannt, daher war es das Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation von MRP4 näher zu betrachten. Zur Bearbeitung dieser Zielstellung wurde die Promoter-Region des ABCC4/MRP4-Gens in ein Luciferase-Reporter-System kloniert. Anschließend wurde in Zellversuchen mit HeLa und HepG2-Zellen der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Transkription von MRP4 untersucht. Zusätzlich wurde mittels Western Blot und quantitativer RealTime-PCR die Expression von MRP4 auf Protein- und mRNA-Ebene betrachtet. Keine bzw. nur geringe Effekte auf die Promoteraktivität wurden in den erwähnten Zelllinien u.a. nach Behandlung mit Glucocorticoiden, Zytokinen, cGMP, Nrf2-/AhR-Aktivatoren und unter dem Einfluss verschiedener Glucose-Konzentrationen beobachtet. Dagegen zeigte sich ein signifikanter Einfluss des zellulären cAMP-Spiegels. MRP4 vermittelt physiologisch einen Auswärtstransport von cAMP. Bei Inkubation mit dem membranpermeablen cAMP-Analogon Dibutyryl-cAMP zeigte sich eine signifikante Steigerung der Promoter-Aktivität von MRP4. Auch auf mRNA- und Protein-Ebene konnte eine signifikante Steigerung der Expression nach Behandlung mit cAMP detektiert werden. Durch Ko-Inkubation mit Inhibitoren der Proteinkinase A (PKA) und der Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (Erk1/2) konnte weiterhin gezeigt werden, dass dieser Effekt nicht über die PKA, dem häufigsten Effektor von cAMP, sondern über Erk1/2 vermittelt wird. Die Induktion von MRP4 durch cAMP, welches selbst Substrat des Transporters ist, könnte eine Art Feedback-Mechanismus darstellen und darauf hinweisen, dass MRP4 eine größere Rolle im zellulären cAMP-Stoffwechsel zukommt, als bisher angenommen. Der zelluläre Export stellt neben dem Abbau von cAMP durch Phosphodiesterasen einen alternativen Mechanismus der Signalregulation dar, der entweder nur als Ventilmechanismus bei hohen cAMP-Spiegeln oder Zelltyp- und Kompartiment-abhängig möglicherweise auch als hauptsächlicher Eliminationsweg dient. MRP4 könnte somit neben der Inhibition der Phosphodiesterasen einen weiteren Angriffspunkt zur Erhöhung zellulärer cAMP-Spiegel z.B. im Rahmen der Therapie von Erkrankungen wie der pulmonalen Hypertonie darstellen.
Eine Thrombose ist eine Gefäßerkrankung, bei der eine lokalisierte, intravasale Blutgerinnung zur Bildung eines Thrombus in einem Gefäß führt. Die Aktivierung der
Blutgerinnungskaskade und damit der Gerinnungsfaktoren führt zu einer Bildung sowie Quervernetzung von Fibrin und so zur Entstehung eines Thrombus. Dieser wird
physiologisch über die Fibrinolyse abgebaut. Die Serinprotease PAI-1 inhibiert diese und wirkt somit prothrombotisch. Jüngste Studien haben gezeigt, dass S1P als Schlüsselmolekül des Immunsystems und des Metabolismus auch das Gerinnungssystem beeinflusst und in einer wechselseitigen Beziehung mit dem Gerinnungsfaktor Thrombin und seinen PARs steht. Die S1P-Konzentration im Körper korreliert dabei eng mit dem BMI. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Wirkung des Signallipids S1P auf die PAI-1-Expression von Fettzellen und damit die Stellung der Adipozyten bei S1P-vermittelten thrombotischen Ereignissen in vitro. Weiterhin wurde
erstmalig die Wechselwirkung von Thrombin und S1P bei der Produktion von PAI-1 in Fettzellen untersucht. Hierfür wurden 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten differenziert
und mit S1P stimuliert. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Steigerung der PAI-1-mRNA. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls von anderen Arbeitsgruppen
bestätigt. Der S1P-Effekt ließ sich auch mittels Western Blot-Analyse auf Proteinebene darstellen. Dabei zeigte sich eine starke Steigerung der PAI-1-Expression und
Sekretion von 3T3-L1-Zellen. S1PR-2- und S1PR3-Inhibitoren senkten den S1Pvermittelten Anstieg, sodass S1P über eine S1PR-2- und, bisher in der Literatur noch
nicht beschrieben, auch über eine S1PR-3-Aktivierung einen prothrombotischen Einfluss ausübt. Weiterhin konnte nach Stimulation mit S1P erstmalig eine Expressionssteigerung von PAR-1 und damit eine Wechselwirkung zwischen dem Signalweg von Thrombin und S1P in Adipozyten beobachtet werden. Es wurde die
Hypothese aufgestellt, dass Thrombin über den PAR-1 die Aktivität der Enzyme des S1P-Metabolismus steigert und so über eine endogene S1P-Produktion zu einer zusätzlichen Steigerung von PAI-1 führt. Diese konnte bisher noch nicht bestätigt werden, da lediglich eine geringe, jedoch nicht signifikante Steigerung von PAI-1 nach Thrombin-Stimulation beobachtet werden konnte. Somit ist das Fettgewebe ein wichtiges Bindeglied zwischen dem inflammatorischen Lipid S1P sowie dem Enzym PAI-1 und damit als Gewebe ein bisher stark unterschätzter Einflussfaktor bei der Entstehung und Aufrechterhaltung thrombotischer Ereignisse.
Die Sicherheit und Wirksamkeit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von Transportproteinen beeinflusst. Die zelluläre Lokalisation von Transportern hat hierbei wesentlichen Einfluss darauf, ob diese als funktionelle Aufnahme- oder Effluxtransporter fungieren. Für den menschlichen Darm ist die Lokalisation einiger Transporter noch unklar. Ein Beispiel hierfür ist der organic cation transporter (OCT1), welcher für die intestinale Aufnahme zahlreicher kationischer Arzneistoffe, wie beispielsweise Morphin verantwortlich gemacht wird. Bisher gibt es allerdings widersprüchliche Aussagen über die exakte Lokalisation dieses Transporters in der Zellmembran von Enterozyten. Folglich ist die tatsächliche Bedeutung dieses Proteins für die Absorption von Arzneistoffen bis heute ungeklärt.
Daher war das Ziel dieser Arbeit die Expression, Lokalisation und Funktion von OCT1 in Enterozyten anhand verschiedener labortechnischer Methoden näher zu charakterisieren.
Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde versucht die Lokalisation von OCT1 im Zellmodell zu bestimmen. Ebenfalls im Zellmodell erfolgte die Untersuchung des vektoriellen Transportes von Morphin mittels Transwellassay. Diese, sowie entsprechende Analysen vitalen intestinalen Gewebes in der Ussing-Kammer, wurden genutzt, um indirekt Rückschlüsse auf die Transporterlokalisation zu ziehen.
Trotz eindeutiger und der Hypothese entsprechender Expression und Funktion in MDCKII-OCT1/P-gp-Zellen, konnten im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Caco-2-Zellen generiert werden.
Caco-2-Zellen sollten als Zellmodell für Enterozyten, insbesondere hinsichtlich der Charakterisierung von OCT1, neu bewertet werden, da aktuellen Erkenntnissen entsprechend möglicherweise keine signifikante Expression von OCT1 in diesen Zellen vorliegt. Auch das genutzte OCT1-Modellsubstrat Morphin ist möglicherweise problematisch. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei den vorliegenden Daten aufgrund der geringen Versuchszahl nur um vorläufige Ergebnisse handeln kann, welche in zukünftigen Arbeiten verifiziert werden sollten.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die vorliegende Arbeit zwar keine neuen Erkenntnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Enterozyten erbringen konnte, jedoch die Bedeutung eines kritischen Umgangs mit etablierten Methoden und deren Ergebnissen unterstreicht.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung sowohl für die Blutstillung als auch für die Regulation von Entzündungsprozessen. Nach der Aktivierung setzen sie proinflammatorische Mediatoren wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) frei. Die spezifischen Mechanismen der S1P-Freisetzung aus Thrombozyten sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand eines vesikulären Transportassays bestätigt werden, dass ein ATP-abhängiges Transportsystem für S1P in Thrombozytenmembranen vorliegt. Der ATP-abhängige Transport von fluoreszenzmarkiertem S1P (F-S1P) in inside-out-Membranvesikel von humanen Thrombozyten wurde durch das organische Anion MK571, einen Inhibitor von ABC-Transportern der Multidrug Resistance Protein (MRP)-Subfamilie, gesenkt. Anhand von Transportversuchen mit inside-out-Membranvesikeln von MRP4 (ABCC4)-überexprimierenden Sf9-Insektenzellen und MRP5 (ABCC5)-überexprimierenden V79-Fibroblasten konnten MRP4 und MRP5 als S1P-Transporter identifiziert werden. Die Untersuchung von MRP4-defizienten Mäusen ergab signifikante Abnahmen der S1P-Spiegel im plättchenreichen Plasma dieser Tiere. Die S1P-Spiegel der MRP5-defizienten Männchen glichen dem WT, während die Weibchen nahezu eine Verdopplung des S1P-Gehalts im plättchenarmen Plasma im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Die Ergebnisse bei den genetisch veränderten Mäusen lassen vermuten, dass der Transporter MRP4 auch physiologisch an der S1P-Speicherung und -Freisetzung aus Thrombozyten beteiligt ist, während MRP5 die S1P-Plasmaspiegel eher unabhängig von den Thrombozyten zu beeinflussen scheint. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der MRP4-vermittelte Transport von F-S1P durch Fluvastatin mit einer IC50 von 52 µM und Rosuvastatin mit einer IC50 von 32 µM gehemmt wird. Darauf aufbauend konnte mittels Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden, dass die Vorinkubation mit Fluvastatin bzw. Rosuvastatin die endogene stimulierte S1P-Freisetzung aus humanen Thrombozyten ex vivo senkt. Diese inhibitorische Wirkung der Statine auf den Transport des proinflammatorischen S1P stellt einen neuen möglichen Mechanismus dar, mit dem die Statine pleiotrope entzündungshemmende Effekte ausüben können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass MRP4 als S1P-Transporter identifiziert wurde und Statine den MRP4-vermittelten Transport beeinträchtigen.
Das Blasenspasmolytikum Propiverin war aus der Literatur als Induktor von CYP- Enzymen in der Rattenleber bekannt. Die vorliegenden Daten gestatteten keine Aussagen zu den beeinflussten CYP-Subfamilien und zur Dosisabhängigkeit der Induktion. In dieser Studie wurde die Beeinflussung der mikrosomalen Ethylresorufin-0- Deethylase (EROD), Ethoxycumarin-0-Deethylase (ECOD), Pentylresorufin-0- Depentylase (PROD), Diazepam-N-Demethylase (DNDM), Dextromethorphan-0- Demethylase (DXDM), p-Nitrophenolhydroxylase (NPH) und Erythromycin-N- Demethylase (ERDM) in der Leber männlicher Ratten nach Behandlung mit 0,6-60 mg/kg Propiverin über 5 Tage im Vergleich mit den bekannten CYP- Induktoren Phenobarbital, ß-Naphthoflavon und Dexamethason untersucht. Es zeigte sich, dass Propiverin in einer Dosierung bis 2 mg/kg weder die untersuchten Monooxygenaseaktivitäten noch den Gesamt-CYP-Gehalt beeinflusst. Das Induktionsmuster nach der Behandlung mit Propiverin hatte mit einer herausragenden Induktion der PROD (33fach) sowie einer geringeren Erhöhung der EROD, ECOD, DNDM und ERDM den Charakter einer Phenobarbital-Typ-lnduktion. Die vermehrte CYP2B-Expression nach Gabe von 60 mg/kg Propiverin konnte mittels Western Blot nachgewiesen werden. Die DXDM als Maß für die CYP2D-Aktivität änderte sich durch Propiverin- behandlung im untersuchten Dosisbereich nicht. Zusätzlich zeigten Propiverin und Despropylpropiverin in vitro eine Hemmung der PROD (halbmaximale Hemmkonzentration IC50 ca. 0,5 µmol/l Propiverin); die EROD und ERDM blieben in vitro unbeeinflusst. Zur Induktion der untersuchten Enzyme kam es erst nach Gabe des Vielfachen der empfohlenen Menge für den therapeutischen Gebrauch.
Untersuchungen zum Mechanismus der oralen Absorption von Trospiumchlorid an gesunden Probanden
(2017)
In Deutschland leiden ca. 15 % der über 40-jährigen am Syndrom der überaktiven Blase (overactive bladder, OAB), welches durch plötzlich auftretenden, nicht aufhaltbaren Harndrang definiert wird. Trospiumchlorid (TC) ist ein kationischer, wasserlöslicher, antimuskarinerger Arzneistoff mit einer stark variablen Bioverfügbarkeit von ca. 10 %, der häufig zur Behandlung der OAB eingesetzt wird. Aufgrund seiner quartären Ammoniumstruktur überwindet er die Hirnschranke nicht und löst somit keine kognitiven Nebenwirkungen aus, was einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Anticholinergika darstellt. Zielsetzung dieser Arbeit war die Optimierung seines schlechten oralen Absorptionsverhaltens.
TC überwindet die Enterozytenmembran als Substrat des Efflux-Carriers P-glycoprotein (P-gp) und des Aufnahmetransporters organic cation transporter 1 (OCT1). Durch die geringe Expression von P-gp in den proximalen Dünndarmabschnitten und einer gleichmäßigen Expression von OCT1 im gesamten Darm vermuteten wir ein „Absorptionsfenster“ für TC in diesem proximalen Dünndarmareal.
In zwei nach ähnlichem Design durchgeführten kontrollierten, randomisierten, cross-over Studien der Phase I versuchten wir dieses vermutete „Absorptionsfenster“ mit der Simulation gastroretentiver Darreichungsformen für TC gezielt zu bedienen. Das TC sollte dabei mit Hilfe der Antrum-Motilität über einen längeren Zeitraum, in portionierten Mengen aus dem Magen in den Dünndarm befördert werden. In der offenen, vier-armigen GI-Studie (gastric infusion) benutzten wir dafür eine Magensonde über die 30 mg in Wasser gelöstes TC in einem Zeitraum von 6 h in den Magen infundiert wurden (GI). Im Vergleich dazu stand die orale Einnahme einer 30 mg schnell freisetzenden TC-Filmtablette (immediate release, IR). Die Applikationen erfolgten jeweils im nüchternen Zustand (fasted) und nach dem Verzehr einer standardisierten fettreichen Mahlzeit (FDA; fed).
In der NaHCO3-Studie (Natriumbikarbonat) simulierten wir unter Ausnutzung der verzögerten Magenentleerung nach Verzehr einer fettreichen Mahlzeit eine physiologische Form der gastroretentiven Darreichung von TC. Durch Zugabe einer NaHCO3-Kapsel zu TC (IR-TC + NaHCO3) als Brausesubstanz in Kontakt mit Magensäure, sollte TC gleichmäßig mit dem Mageninhalt vermischt werden, um interindividuelle Unterschiede in der TC-Bioverfügbarkeit zu verringern. Im Vergleich standen die intravenöse Gabe von TC (IV-TC) und die Komedikation eines NaHCO3-Placebos (IR-TC + NaHCO3-Placebo).
Die geplanten Ansätze zur Verbesserung des Absorptionsverhaltens von TC gelangen in beiden Studien leider nicht.
Mit Hilfe von pharmakokinetischem modelling der aus der GI-Studie gewonnenen Daten, postulierten wir mögliche Gründe. So fanden wir heraus, dass es im menschlichen Darm zwei „Absorptionsfenster“ für TC geben muss. Ein schmaleres mit geringerer Permeabilität im Jejunum und ein breiteres mit höherer Permeabilität im Caecum/Colon ascendens. Ursächlich hierfür könnten die lokale Häufigkeit und das Wechselspiel der in diesen Arealen vorkommenden Transportproteine P-gp und OCT1 sein. Der Versuch durch Gastroretention ein proximales „Absorptionsfenster“ zu bedienen erwies sich daher nach pharmakokinetischer Modellanalyse als Fehlkonzept. In zukünftigen Studien sollten weitere Darreichungsformen erprobt werden, die insbesondere auf eine Freisetzung des TCs im zweiten „Absorptionsfenster“ mit einer höheren Permeabilität für TC abzielen.
Das Glioblastoma multiforme zählt bis heute trotz multimodaler Therapieansätze zu den prognostisch ungünstigsten malignen Neoplasien des Menschen. Ein mittleres Überleben von etwa 15 Monaten unter der derzeitigen Standardtherapie konnte trotz intensiver Forschung bislang nicht wesentlich gesteigert werden. Die hohe Proliferationsrate und das ausgeprägte infiltrative Wachstum sowie die fehlende Radio- und Chemosensitivität dieser Tumorentität limitieren bis dato die therapeutischen Optionen. Vor diesem Hintergrund ist die Etablierung alternativer Therapieansätze eine vordringliche Forschungsaufgabe. In Glioblastomen konnte eine erhöhte Expression von Komponenten der Endothelin-Achse sowie der Cystein-Protease Cathepsin B nachgewiesen werden. In anderen malignen Neoplasien wie dem Kolon-, Mamma- oder Prostatakarzinom vermochte die Hemmung dieser Hormone/Enzyme die proliferative und migratorische Aktivität der Tumorzellen zu vermindern, wobei gewebespezifische Differenzen sowie Ambivalenzen der Inhibitionsresultate zu beobachten waren. In dieser Dissertation sollte unter in vitro-Bedingungen das Expressionsverhalten der Glioblastomzelllinien LN 18 und U 87 MG hinsichtlich obig genannter Systeme sowie der Einfluss einer dualen Blockade der Endothelin-Rezeptoren A und B durch Bosentan bzw. der selektiven Inhibition von Cathepsin B durch CA-074 Me auf die zelluläre Proliferation und Migration untersucht werden. Mittels quantitativer RT-PCR konnte in beiden Zelllinien – verglichen mit gesundem Hirngewebe – eine erhöhte mRNA-Expression sowohl der Endothelin-Achse als auch von Cathepsin B nachgewiesen werden. Die Western-Blot- und ELISA-Untersuchungen bestätigten eine erhöhte Expression von Endothelin-1, dem ETAR und dem ETBR sowie von Cathepsin B in beiden Zelltypen. Im Weiteren wurde der Einfluss der Inhibitoren Bosentan und CA-074 Me auf die Proliferation der beiden Zelllinien im Resazurin- und Kristallviolett-Assay sowie auf die Migration im xCelligenceTM-System und im Wundheilungs-Assay untersucht. Ein signifikanter Einfluss von Bosentan konnte in den durchgeführten Experimenten in beiden Zelllinien weder für die Proliferation noch die Migration nachgewiesen werden. Für CA-074 Me zeigte sich jedoch in einer Konzentration von 10 µM ein hemmender Einfluss auf die Zellviabilität sowie die Migration der Zelllinien LN 18 und U 87 MG. Längere Inkubationszeiten und höhere Konzentrationen der verwendeten Inhibitoren, wie in der Fachliteratur beschrieben, sollten in weiterführenden Analysen in die Experimente eingeschlossen werden. Die ebenfalls in die Untersuchungen eingeschlossenen Zytostatika Doxorubicin, Teniposid und Vincristin bewirkten eine signifikante Reduktion der Zellviabilität beider Glioblastomzelllinien, während Carmustin, Lomustin und Temozolomid kaum Einfluss auf diese Zellen nahmen. Weder Bosentan noch CA 074 Me führten dabei zu einer signifikanten Modulation der Zytostatika-Wirkungen. Alle untersuchten Zytostatika verursachten zudem eine verminderte Migration der Glioblastomzellen in vitro, jedoch war das Ausmaß dieser Migrationshemmung sehr unterschiedlich. Auch hier konnte kein Einfluss von Bosentan oder CA 074 Me auf die durch die Zytostatika verursachte Hemmung der Zellmigration beobachtet werden. Die Komplexität und Multifunktionalität beider Hormon-/Enzymsysteme innerhalb verschiedener Zellkompartimente und Gewebetypen machen weitere Untersuchungen in vitro und in vivo notwendig, um das Potenzial beider Systeme für einen gezielten Einsatz in der Tumortherapie bzw. der Behandlung des Glioblastoms vollends zu klären. Zudem muss berücksichtigt werden, dass bei Verwendung pharmakologischer Hemmstoffe unspezifische bzw. pleiotrope Effekte nicht gänzlich ausgeschlossen werden können, weshalb weiterführende Analysen mit gezielter, genetischer Ausschaltung der Zielgene, beispielsweise mittels siRNA oder CRISPR/Cas9-Technologie, sinnvoll erscheinen.
Zusammenfassung In der basalen Populationsstudie SHIP-0 (Study of Health in Pomerania) zeigten sich Assoziationen zwischen dem Zustand parodontaler Gewebsschädigung und dem Magnesiumserumspiegel. Außerdem ließen sich in SHIP-0 bei Einnahme magnesiumhaltiger Medikamente auch positive Wirkungen auf den Zahnhalteapparat erkennen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, diese Tendenzen im Rahmen der 5-Jahres-Folgestudie SHIP-1 zu verifizieren. Zu diesem Zwecke wurden die an SHIP-1 teilnehmenden Probanden zur Beziehung ihres basalen Magnesium/Kalzium-Verhältnisses zur Progression ihres parodontalen Zustands untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Bei einem hohen Magnesiumserumspiegel findet eine Verlangsamung der parodontalen Gewebedestruktion statt. 2. Es bestehen deutliche Dosis-Wirkungsbeziehungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses im Serum zum parodontalen Status. 3. Der Magnesium-Effekt tritt unabhängig von vorhandenen zusätzlichen Risikofaktoren auf. Dies betrifft vor allem Bildung, Diabetes, Rauchen und das Alter. 4. Die Kombination aus weiblichem Geschlecht und Diabetes ist die wichtigste Ursache für ein geringes Magnesium/Kalzium-Verhältnis. 5. Ein hohes Gesundheitsbewusstsein, gekennzeichnet durch eine hohe Bildung und Nichtrauchen, ist mit einem hohen Magnesium/Kalzium-Status assoziiert. 6. Es nahmen von 4290 Probanden der SHIP-0 nur noch 3300 an SHIP-1 teil, deren Risikofaktorenverteilung sich verändert hat. Das follow-up ist daher nicht mehr bevölkerungs-repräsentativ, da besonders risikobelastete Patienten fernblieben. Diese Arbeit gibt damit einen Ausblick auf die möglichen Wirkungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses und dessen Einfluss auf den Zahnhalteapparat. Ob sich durch Magnesiumeinnahme ein positiver Effekt auf die parodontale Situation erreichen lässt, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden.
Das Glioblastom ist ein WHO Grad 4-Tumor und einer der häufigsten und zugleich agressivsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Trotz multimodaler Therapie, die eine neurochirurgische Resektion sowie eine adjuvante Radiochemotherapie und als neuen Therapieansatz eine Kombination aus Temozolomid und tumor treating fields umfasst, ist die Prognose weiterhin schlecht, sodass der Suche nach neuen therapeutischen Zielstrukturen eine maßgebliche Bedeutung zukommt. Für verschiedene Tumorentitiäten konnte gezeigt werden, dass die Überexpression einzelner onkogener Kinasen die Tumorprogression vorantreibt, wobei bei Glioblastomen gezeigt werden konnte, dass die Serin-Threonin-Kinase Pim1 eine wichtige Rolle in der Pathogenese einnimmt.
In den Fokus rücken zunehmend auch stammzellähnliche Tumorzellen, die eine Subpopulation innerhalb von Glioblastomen darstellen und das aggressive biologische Verhalten sowie die Resistenz gegenüber der Standardtherapie und eine hohe Rezidivrate vermitteln können.
In dieser Arbeit sollte dementsprechend basierend auf den bisherigen Erkenntnissen zu Pim1 sowie zur Bedeutung von Tumorstammzellen im malignen Geschehen der Einfluss der Serin-Threonin-Kinase Pim1 auf das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen näher untersucht werden.
Durch den Vergleich von adhärent wachsenden Tumorzellen der Glioblastomzelllinie LN-18 mit stammzellähnlichen LN-18 Neurosphären konnte eine erhöhte relative mRNA-Expression von Pim1 und EGFR sowie der potentiellen Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Musashi-1 nachgewiesen werden. Die relative Proteinexpression von Pim1 sowie der Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Sox2 war in den Neurosphären im Vergleich zu den adhärent wachsenden LN-18 Zellen ebenfalls gesteigert. Diese Daten konnten durch die Immunfluoreszenz-Färbungen bestätigt werden.
Ein effizienter siRNA-vermittelter knockdown von Pim1 auf Proteinebene konnte in dieser Arbeit nicht erzielt werden, sodass keine Aussagen zu einer Regulation von Stammzell- und Differenzierungsmarker nach zielgerichteter genetischer Abschaltung von Pim1 getroffen werden konnten. Hier sind weiterführend Optimierungen notwendig oder der Einsatz spezieller CRISPR-Cas9-Verfahren zur genetischen Ausschaltung sinnvoll.
Die pharmakologische Inhibition von Pim1 mit LY294002 und TCS Pim1-1 führte zu einer signifikanten Reduktion der Neurosphärenformation sowie der Zellviabilität bei LN-18 Zellen, wodurch die in Vorarbeiten an adhärenten Glioblastomzellen gewonnenen Daten um Untersuchungen an stammzellartigen Glioblastomzellen erweitert wurden.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit erhobenen Daten nahe, dass Pim1 das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen beeinflusst, indem Pim1 Einfluss auf die Expression von Stammzellmarkern nimmt und seine Inhibition die Aufrechterhaltung einer Glioblastomstammzellpopulation beeinträchtigt, indem die Neurosphärenformation und die Viabilität der Zellen stark reduziert werden. Somit stellt Pim1 eine geeignete Zielstruktur für eine zielgerichtete Therapieoption beim Glioblastom dar, beispielsweise in Kombination mit der klassischen Radiochemotherapie. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit eine selektive Pim1-Inhibition tatsächlich Einfluss auf die Prognose von Patienten mit Glioblastom nimmt.
Untersuchungen zum Einfluss des Endothelinsystemes auf die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie
(2012)
Das Zytostatikum Doxorubicin besitzt nach wie vor einen hohen Stellenwert in der Therapie maligner Erkrankungen. Die schwerste und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkung, die bei der Therapie mit Doxorubicin auftreten kann, ist eine Kardiomyopathie. Die Prävention dieser Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie könnte eine effektivere Gestaltung der zytostatischen Therapie ermöglichen, allerdings sind dafür detaillierte Kenntnisse über den Pathomechanismus der Entstehung dieser Herzschädigung unabdingbar. Basierend auf der kardioprotektiven Wirkung des dualen Endothelinrezeptorantagonisten (ETA) Bosentan gegenüber einer Doxorubicin-Kardiotoxizität im Mausmodell, war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit, die Wirkung von Bosentan vergleichend zu einer selektiven Endothelinrezeptor-A- bzw. -B-Blockade mittels Sitaxentan bzw. BQ-788 zu analysieren und zugrunde liegende Mechanismen der Kardioprotektion aufzuklären. Dazu wurde das Konduktanzkatheter-System zur Messung und Auswertung hämodynamischer Parameter von C57/BL6-Mäusen am Institut für Pharmakologie etabliert, mit Literaturdaten verglichen und mittels Magnetresonanztomographie verifiziert. Nach Herausarbeitung der zur Induktion einer Herzschädigung geeigneten Doxorubicin-Dosis von 20 mg/kg KG, wurde im folgenden Tierversuch der Einfluss einer Endothelinrezeptor-Blockade durch die ETAs Bosentan, Sitaxentan und BQ-788 auf hämodynamische Parameter vergleichend analysiert. Dabei konnte bei allen ETAs ein kardioprotektiver Effekt gegenüber der Doxorubicin-Kardiotoxizität nachgewiesen werden. Sitaxentan als hochselektiver Endothelinrezeptors-A-Blocker zeigte eine nur geringfügig schlechtere Wirkung auf die Hämodynamik der Versuchstiere. Interessanterweise konnte auch der Endothelinrezeptors-B-Antagonist BQ-788 die Herzfunktion der Doxorubicin-behandelten Mäuse in ähnlichem Ausmaß wie Bosentan und Sitaxentan verbessern, was auf der zusätzlichen Endothelin-A1-Rezeptorblockade beruhen könnte. In einem weiteren Schritt konnte der Doxorubicin- und Doxorubicinolgehalt verschiedener Organe der Maus mittels HPLC bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass der kardioprotektive Effekt der ETAs nicht auf einer verringerten Akkumulation von Doxorubicin oder Doxorubicinol im Myokard beruht, da deren kardiale Spiegel unter ETA-Co-Medikation keine signifikanten unterschiede zeigten. Lediglich BQ-788 beeinflusste den Doxorubicin- und Doxorubicinol-Gehalt in manchen Organen etwas stärker, was die geringfügig schlechtere Hämodynamik erklären könnte. Um der kardioprotektiven Wirkung der ETAs zugrunde liegende molekulare Prozesse aufzuklären, wurden ausgewählte Gene und Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Lokalisation im Myokard bzw. in Kardiomyozyten untersucht. Für das mitochondriale Protein ANT1, welches sowohl physiologische als auch pathophysiologische Effekte vermittelt, konnte auf Proteinebene eine verringerte Expression nach Doxorubicingabe ermittelt werden, während die ETAs die ANT-Expression wieder normalisierten bzw. erhöhten, was in der Literatur als kardioprotektiv beschrieben wird. Die ebenfalls kardioprotektiv wirksamen Kinasen Pim-1 und AKT1 zeigten eine gegensätzliche Regulation unter Doxorubicin. Der kardiale Gehalt an phosphorylierten AKT1 (pAKT1) wurde durch Doxorubicin signifikant vermindert und durch Bosentan sowie BQ-788 wieder auf das Kontrollniveau angehoben, was bei Sitaxentan nicht zu verzeichnen war. Demnach könnte AKT1 in die kardioprotektive Wirkung von Bosentan und BQ-788 involviert sein. Pim-1 L (44 kDa-Isoform) wurde durch Doxorubicin im murinen Myokard signifikant hoch reguliert, was durch Co-Medikation mit ETAs nahezu vollständig revertiert wurde und durch den Transkriptionsfaktor STAT3 vermittelt sein könnte. Auch die Lokalisation von Pim-1 unterlag in einem in vitro Kardiomyozyten-Modell (H9c2) einer Regulation durch Doxorubicin mit nukleärer Akkumulation der Kinase, was durch die ETAs in unterschiedlichem Ausmaß moduliert wurde. Die Pim-1-Regulation unter Doxorubicin-Gabe könnte dabei einen Schutzmechanismus der Zellen gegen die kardiotoxische Wirkung des Zytostatikums darstellen, welcher unter Co-Medikation mit ETAs nicht mehr nötig war, da diese die kardiale Pumpfunktion wieder herstellten. Zusätzliche in vitro Untersuchungen zur Viabilität von H9c2-Kardiomyozyten unter Doxorubicin, ETAs und Hemmung von AKT1 und Pim-1 bestätigten die in vivo Ergebnisse im Mausmodell jedoch nicht. Die vorliegende Arbeit bietet interessante Ansätze zur pharmakologischen Prävention der Doxorubicin-induzierten Kardiotoxizität. In einem in vivo murinen Kardiomyopathie-Modell konnte der therapeutische Nutzen von ETAs zur Prophylaxe einer Herzschädigung unter Doxorubicin deutlich herausgestellt sowie mögliche zugrunde liegende Mechanismen aufgeklärt werden. Damit bietet diese Arbeit vielversprechende Ansätze für weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von ETAs als Kardioprotektiva.
Die Sepsis und der septische Schock stellen die häufigste Todesursache auf chirurgischen Intensivstationen dar. Viele Studien haben gezeigt, dass die Barriere-funktion in sekretorischen Organen, wie z. B. Leber, Gehirn und Darm, durch das septische Krankheitsbild beeinflusst wird. Wichtige Determinanten dieser Organbarrieren sind die Effluxtransporter multidrug resistance protein 1 (kodiert durch Mdr1) und das multidrug resistance-associated protein 2 (Mrp2). Sie haben großen Einfluss auf die Absorption und Verteilung sowie Ausscheidung von potentiell toxischen Xenobiotika, unter anderem auch Arzneimittel. Unser Ziel war es, mit der vorliegenden Arbeit einerseits die Expression, anderseits die Funktion der Membran-Transporter Mdr1 und Mrp2 in verschiedenen Organen mit und ohne Sepsis zu untersuchen. Des Weiteren sollte geklärt werden, inwieweit Talinolol als probe drug neben dem bereits gut charakterisierten Transport über Mdr1 auch ein Substrat für Mrp2 ist. Hierzu wurden jeweils 12 männliche Lew.1W-Ratten des Wildtyps und 12 des Mrp2-defizienten Stamms mit Talinolol vorbehandelt. Je sechs Tieren beider Rattenstämme wurde ein Röhrchen in die Darmwand implantiert (colon ascendens stent peritonitis – CASP), die Kontrolltiere wurden scheinoperiert. Nach drei Tagen wurde die Mdr1b- und Mrp2-mRNA-Expression über die real time reverse transcription- Polymerasekettenreaktion im Jejunum, Ileum, Leber, Niere, Gehirn und Hoden analysiert. Weiterhin bestimmten wir sowohl aus den oben genannten Organen als auch aus dem Blut sowie dem gesammelten Urin und Stuhl die Talinololkonzentrationen mittels high pressure liquid chromatography (HPLC) und Fluoreszenzdetektion. Septische Ratten des Wildtyps zeigten gegenüber ihrer Kontrolle eine nominal gesunkene jejunale Mdr1b-mRNA-Expression mit einer gleichzeitig um 20% verminderten Talinololausscheidung über den Stuhl als möglichen Ausdruck der gestörte Absorptionsbarriere des Darms. Weiterhin waren die Mdr1b-mRNA-Level in der Leber erhöht, jedoch ließ sich die zu erwartende Reduzierung der intrahepatische Talinololkonzentration nicht bestätigen. Die Konzentrationen von Talinolol im Gehirn sanken während der Sepsis auf fast ein Drittel der Kontrollgruppe bei unveränderter Mdr1-Expression. Mrp2 scheint hingegen keinen Einfluss auf die Talinololkinetik während der Sepsis zu haben.
Kardioprotektive Wirkung von Antagonisten am Mineralokortikoidrezeptor nach akutem Myokardinfarkt
(2013)
Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Dieser entsteht überwiegend durch artherosklerotische oder entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße, welche zu einem thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung, der sogenannten Ischämie, führen. Um die entstehende Herzmuskelschädigung möglichst klein zu halten, ist die schnelle Wiedereröffnung des Koronargefäßes notwendig. Heute ist bekannt, dass diese gewünschte Reperfusion aber auch irreversible Herzschäden verursachen kann. Mit dem Verfahren der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Intervalle der Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes kann die Infarktgröße deutlich gesenkt werden. Für den klinischen Einsatz ist dieses Verfahren jedoch technisch zu aufwändig, sodass der Wunsch nach pharmakologischen Interventionen, die ein hohes Potenzial zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bieten, steigt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und in den klinischen Alltag einzubringen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten) Eplerenon und Canrenoat sowie der Charakterisierung wichtiger Elemente der Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der isolierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung bekannter Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung untersucht. Des Weiteren wurde ein in situ Mausmodell etabliert, um die Infarktgrößen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren wurden CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse verwendet. Die CD73-/--Mäuse können durch die fehlende 5-Ektonukleotidase (CD73) kein endogenes Adenosin bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen der Adenosin-A2b-Rezeptor deletiert, welcher bei der Reperfusion eine Schlüsselrolle spielt. In einem in situ Kaninchenmodell haben weitere Untersuchungen des Canrenoats stattgefunden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eplerenon während der Reperfusion die Infarktgröße nach einem Myokardinfarkt signifikant reduziert und dass dieser Schutzmechanismus von PKC, PI3-Kinase und den weiteren Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. Weiterhin konnte sowohl bei der Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen als auch im in situ Mausmodell, in den CD73-/--Mäusen, die Beteiligung des Adenosins bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz nachgewiesen werden. Mit Hilfe des in situ Mausmodells konnte gezeigt werden, dass Canrenoat ebenfalls eine Myokard schützende Wirkung zeigt. Dabei wurde die maximale Reduktion der Infarktgröße mit einer Konzentration von 1 mg/kg erreicht, wenn das Canrenoat 5 min vor Beginn der Reperfusion injiziert wurde. Anhand der Untersuchungen an den CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Adenosin und der Adenosin-A2b-Rezeptor für den durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz essenziell sind. Canrenoat hat sich im in situ Kaninchenmodell ebenfalls als kardioprotektiv erwiesen und zeigte keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter. In dem Modell der isolierten Rattenherzen konnte die kardioprotektive Wirkung des Canreonats erneut bestätigt werden und der Schutzmechanismus war von den Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig. Die beiden MR-Antagonisten haben die Fähigkeit, die negative Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu senken. Die Untersuchungen zeigten, dass erst mit einer höheren Aldosteron-Konzentration die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten aufgehoben und die Phosphorylierung der Akt- und ERK 1/2-Kinase reduziert werden konnte. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse liefern neue Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes.
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind zur häufigsten Todesursache in der BRD geworden. Wir untersuchten anhand eines funktionell bedeutsamen Polymorphismus der endothelialen NO-Synthase, inwiefern ein Zusammenhang zwischen einer genetischen Variante zu diesen Erkrankungen besteht. In einer großen populationsbasierten Querschnittsstudie in Nord- und Ostvorpommern stellten wir keine signifikante Assoziation des eNOS Glu298Asp-Polymorphismus zu kardiovasculären Erkrankungen wie arterielle Hypertonie oder Myokardinfarkt fest.
Hämatopoetische Stammzellen und zahlreiche reife periphere Blutzellen exprimieren Effluxtransporter vom ABC-Typ, darunter auch die Vertreter MRP4 und MRP5. Weiterhin sind Nukleosidtransporter wie hENT1 in vielen Blutzellen nachgewiesen worden. Über die Regulation dieser an der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen beteiligten Transporter im Verlauf der hämatopoetischen Differenzierung ist bisher nur wenig bekannt. Um diesen Prozess genauer zu studieren, wurden zunächst CD34-postive Blutzellvorläufer aus Nabelschnurblut und reife Monozyten und Granulozyten aus peripherem Blut isoliert und hinsichtlich ihrer Transporterexpression charakterisiert. Anschließend wurden die leukämischen Modellzelllinien HL-60, U-937 und M-07e in vitro zur myelomonozytären beziehungsweise megakaryozytären Differenzierung angeregt und die Expression, Lokalisation und Funktion von MRP4, MRP5 und hENT1 während dieses Vorgangs per Real-Time PCR, Western Blot, Immunfluoreszenzmikroskopie und Zytotoxizitäts-Assay untersucht. Der Erfolg der Differenzierung wurde durchflusszytometrisch mittels spezifischer Oberflächenmarker überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass MRP4, MRP5 und hENT1 in CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut sowie in reifen Monozyten und Granulozyten exprimiert sind. In den Progenitorzellen konnte eine signifikant höhere MRP4-Expression als in den reifen Blutzellen gefunden werden. Dementsprechend ging auch die modellhafte myelomonozytäre Differenzierung der Zelllinien HL-60 und U-937 mit einer signifikanten Reduktion der MRP4-Expression einher. Im Zuge der megakaryozytären Ausreifung der Zelllinie M-07e hingegen konnte ein signifikanter Anstieg der MRP4-Expression beobachtet werden. Die hENT1-Expression war nach Induktion von Differenzierung signifikant vermindert. Weiterhin konnte nach Induktion von Differenzierung eine signifikante Veränderung der Sensitivität gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin beobachtet werden. MRP5 blieb unter Differenzierungsbedingungen im Wesentlichen unverändert. Die Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass insbesondere MRP4 im Zuge der hämatopoetischen Differenzierung spezifisch reguliert wird. Der beobachtete Anstieg während der Megakaryopoese unterstützt die Vorstellung einer Beteiligung von MRP4 bei der Thrombozytenfunktion. Weiterhin scheint sich die Expression von MRP4 und hENT1 im Zuge der myelomonozytären Differenzierung zu verringern, was sich auch in Resistenzveränderungen gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin niederschlägt. Diese Effekte sollten bei der Entwicklung von neuen Therapieschemata zur Behandlung einer AML berücksichtigt werden, falls eine Applikation von Differenzierungsagenzien in Kombination mit konventionellen Zytostatika vorgesehen ist.
Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine große Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolekülen wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zelluläre Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner möglichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellulären Signaling. MRP4 ist abhängig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen können die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vorübergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminosäuren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier könnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. Änderungen in diesen Proteinen könnten eine Ursache für Störungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung möglicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Dafür wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminosäuren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgeführt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als mögliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte außerdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten möglichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Präzipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antikörpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpräzipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-präzipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 für die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Dafür wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur für die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, während die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabhängig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 verändert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leukämie-Zelllinie M07e als Modell für Thrombozyten-Vorläuferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschließenden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die Überexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch für SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs für die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Dafür wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 hauptsächlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Außerdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv für die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu möglichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren mögliche physiologische und pathophysiologische Rolle für die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugänglich, neue Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knock-down“ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen Veränderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
Die Pflanze Pittosporum angustifolium („GymbiGymbi“) wird von der indigenen Bevölkerung Australiens für verschiedene medizinische Indikationen verwendet. Anwendungsbeobachtungen und erste zellbiologische Untersuchungen geben Hinweise auf den potentiellen Nutzen dieser Pflanze für die Therapie maligner Neoplasien. Ziele dieser Arbeit: Erkenntnisse zu den zellbiologischen Interaktionen zwischen Pittosporum angustifolium und der Tumorzelllinie (U-5637). Material: vier alkoholische, ein wässriger und ein mit Amylase behandelter Extrakt, außerdem sieben isolierte Reinsubstanzen. Methoden: Neutralrottest, Durchflusszytometrie. Wichtige Ergebnisse: Neutralrottest: IC50-Werte zwischen 10 µg/ml (Hydrolysat des Aq.EtOH-Extraktes ) und 66 µg/ml (Amylase-Extrakt). Substanz 4 mit IC50 : 4 µg/ml, Substanz 6 mit IC501 µg/ml. Durchflusszytometrie: Keine Zellphasenarretierung durch die Extrakte. Als Wirkmechanismus zeigten sich sowohl Apoptose- als auch Nekroseinduktion sowohl durch die Extrakte als auch durch Substanz 4 [12 µg/ml] und Substanz 6 [1 µg/ml].
Transportproteine spielen für viele Arzneistoffe eine bedeutende Rolle bei der Absorption, Verteilung und Elimination und können folglich auch maßgeblich über die Anflutung eines Wirkstoffs am Ort der Wirkung und / oder Nebenwirkung(en) entscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, die Affinität von Tigecyclin zu hepatischen Aufnahme- und Effluxtransportern zu bestimmen. Aus pharmakokinetischen Studien war bekannt, dass das Glycylcyclin hauptsächlich hepatisch ausgeschieden wird, wobei die zugrundeliegenden molekularen Transportmechanismen unbekannt waren, d.h. wie Tigecyclin von den Hepatozyten aufgenommen wird und wieder in die Galle bzw. in das Blut abgegeben wird. Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz (logP-Wert: 0,8; pKs-Wert: 0,25/ 8,76) sprechen gegen eine rein passive Diffusion über biologische Membranen.
Um den hepatozellulären Aufnahmetransport aufzuklären, wurden Kompetitionsversuche und direkte Aufnahmeversuch mit Hilfe von stabil transfizierten HEK293-Zellmodellen, die Transportproteine der SLC- und SLCO-Familie stabil überexprimieren, durchgeführt. Unter Verwendung von inside-out-Vesikeln wurde der Effluxtransport von Tigecyclin über MRP2- und MRP3-Transporter untersucht. Um sicher zu gehen, dass die Zellmodelle funktionstüchtig sind, wurde deren Funktionalität vor jedem Versuch mittels bekannter Standardsubstrate und Standardinhibitoren bestätigt. Die direkten Aufnahmeversuche wurden mittels LC-MS/MS analysiert.
Tigecyclin zeigte im verwendeten Konzentrationsbereich und den angewendeten Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung auf die Versuchszellen. Mit den Kompetitionsassays konnte nachgewiesen werden, dass Tigecyclin einen hemmenden Einfluss auf den Transport von bekannten OATP1B3- und OATP2B1-Referenzsubstraten hat, jedoch keine Beeinflussung von OATP1B1 und NTCP zeigte. Des Weiteren konnte in direkten Aufnahmeversuchen gezeigt werden, dass Tigecyclin ein Substrat des ubiquitär exprimierten Transporters OATP2B1 ist. Ein signifikanter Nachweis, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP1B1-, OATP1B3- und NTCP-Transportern ist, gelang jedoch nicht.
Im Bezug auf Effluxtransporter konnte eine Kompetition von Tigecyclin mit dem MRP2- und MRP3-vermittelten Transport in inside-out-Vesikeln nachgewiesen werden. Ein direkter Transport von Tigecyclin über die Vesikel ließ sich jedoch nicht beweisen. Aufgrund methodischer Schwierigkeiten und der sehr begrenzten Bearbeitungszeit, konnten die Versuche nicht oft genug durchgeführt und keine entsprechend belastbaren Daten generiert werden.
Zusammenfassend kann aus den durchgeführten Untersuchungen abgeleitet werden, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP2B1 ist und OATP2B1 somit möglicherweise für die hepatische Aufnahme des Arzneistoffes verantwortlich ist. Ob noch andere Transporter eine Rolle spielen, bleibt weiterhin unbekannt. Auch die konkrete Transportkinetik mit der Affinität (Km) und der Transportkapazität (vmax), bleibt nach diesen Versuchen noch unklar. Des Weiteren legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass bei gleichzeitiger Tigecyclin-Gabe ein gewisses Risiko für unerwünschte pharmakokinetische Interaktionen mit Substraten der Transporter OATP1B3, OATP2B1, MRP2 und MRP3 besteht.
Als Fazit kann gesagt werden, dass mit dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Arzneimitteltransports und der Transporteigenschaften von Tigecyclin in den Hepatozyten geleistet werden konnte. Zusätzlich konnten weitere Erkenntnisse zur Kompetition gewonnen werden. In wie weit die in vitro Resultate auf in vivo Mechanismen übertragbar sind, ist unklar und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.