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Counting of microbial colonies is a common technique employed in research and diagnostics. To simplify this tedious and time-consuming process, automated systems have been proposed. This study aimed to elucidate the reliability of automated colony counting. We evaluated a commercially available instrument (UVP ColonyDoc-It Imaging Station) in regard to its accuracy and potential time savings. Suspensions of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, and Candida albicans (n = 20 each) were adjusted to achieve growth of approximately 1,000, 100, 10, and 1 colony per plate, respectively, after overnight incubation on different solid media. Compared with manual counting, each plate was automatically counted by the UVP ColonyDoc-It with and without visual adjustment on a computer display. For all bacterial species and concentrations automatically counted without visual correction, an overall mean difference from manual counts of 59.7%, a proportion of isolates with overestimation/underestimation of colony numbers of 29%/45%, respectively, and only a moderate relationship (R2 = 0.77) with the manual counting were shown. Applying visual correction, the overall mean difference from manual counts was 1.8%, the proportion of isolates with overestimation/underestimation of colony numbers amounted to 2%/42%, respectively, and a strong relationship (R2 = 0.99) with the manual counting was observed. The mean time needed for manual counting compared with automated counting without and with visual correction was 70 s, 30 s, and 104 s, respectively, for bacterial colonies through all concentrations tested. Generally, similar performance regarding accuracy and counting time was observed with C. albicans. In conclusion, fully automatic counting showed low accuracy, especially for plates with very high or very low colony numbers. After visual correction of the automatically generated results, the concordance with manual counts was high; however, there was no advantage in reading time.
IMPORTANCE Colony counting is a widely utilized technique in the field of microbiology. The accuracy and convenience of automated colony counters are essential for research and diagnostics. However, there is only sparse evidence on performance and usefulness of such instruments. This study examined the current state of reliability and practicality of the automated colony counting with an advanced modern system. For this, we thoroughly evaluated a commercially available instrument in terms of its accuracy and counting time required. Our findings indicate that fully automatic counting resulted in low accuracy, particularly for plates with very high or very low colony numbers. Visual correction of the automated results on a computer screen improved concordance with manual counts, but there was no benefit in counting time.
Antibiotic resistance is increasing worldwide making it necessary to search for alternative antimicrobials. Sodium bituminosulfonate is a long-known substance, whose antimicrobial inhibitory activity has recently been re-evaluated. However, to the best of our knowledge, the bactericidal mode of action of this substance has not been systematically characterized. The aim of this study was to investigate the in vitro bactericidal activity of sodium bituminosulfonate by determining the minimal bactericidal concentrations (MBC), as well as the rapidity of bactericidal effect by time-kill curves. Clinical isolates of methicillin-susceptible (MSSA, n = 20) and methicillin-resistant (mecA/mecC-MRSA, n = 20) Staphylococcus aureus were used to determine MBC by a broth microdilution method. Sodium bituminosulfonate (Ichthyol® light) was tested in double-dilution concentration steps ranging from 0.03 g/L to 256 g/L. For time-kill analysis, two reference and two clinical S. aureus strains were tested with different concentrations of sodium bituminosulfonate (1× minimal inhibitory concentration (MIC), 2× MIC, 4× MIC, 16× MIC and 256× MIC). For MSSA isolates, MBC50, MBC90 and the MBC range were 0.5 g/L, 1.0 g/L and 0.125–1.0 g/L; (MBC/MIC ratio)50, (MBC/MIC ratio)90 and the range of the MBC/MIC ratio were 4, 4 and 1–8, respectively. Among MRSA isolates, MBC50, MBC90 and the MBC range amounted to 0.5 g/L, 1.0 g/L and 0.06–1.0 g/L; (MBC/MIC ratio)50, (MBC/MIC ratio)90 and the range of the MBC/MIC ratio were 2, 4 and 1–8, respectively. Time-kill kinetics revealed a bactericidal effect after 30 min for sodium bituminosulfonate concentrations of 16× MIC and 256× MIC. The bactericidal activity against MSSA and MRSA was demonstrated for sodium bituminosulfonate. The killing was very rapid with the initial population reduced by 99.9% after only short incubation with concentrations of 16× MIC and higher.
Das gramnegative Bakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Melioidose. Die Virulenz von B. pseudomallei steht in engem Zusammenhang mit dessen Fähigkeit,intrazellulär überleben zu können. B. pseudomallei verfügt über eine Vielzahl von Sekretionssystemen, von denen das Typ-III-Sekretionssytem-3 (T3SS-3) und das Typ-VI-Sekretionssystem-1 (T6SS-1) eine wichtige Rolle für den intrazellulären Überlebenszyklus und die Virulenz des Erregers im Säuger spielen. Das Gen bsaU ist im Gencluster des T3SS-3 und das Gen BPSS1504 im Cluster des T6SS-1 lokalisiert. Beide gehören nicht zu den konservierten Genen dieser Sekretionssysteme und kodieren für hypothetische Proteine mit unbekannter Funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von bsaU und BPSS1504 im intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei und für die Virulenzeigenschaften dieses Erregers näher zu untersuchen, sowie Hinweise auf die Funktionen der durch bsaU und BPSS1504 kodierten Proteine zu gewinnen. Hierfür wurden markerlose Deletionsmutanten der Gene bsaU und BPSS1504 hergestellt und die Mutanten B. pseudomallei ΔBPSS1504 und B. pseudomallei ΔbsaU komplementiert. Die Mutante B. pseudomallei ΔBPSS1504 zeigte im Zellkulturmodel Defekte in der intrazellulären Replikation, eine reduzierte Zytotoxizität und war unfähig, die Bildung von vielkernigen Riesenzellen zu induzieren, während die Fähigkeit Aktinpolymerisationen zu induzieren scheinbar nicht von der BPSS1504-Deletion beeinträchtigt wurde. Die Charakterisierung von B. pseudomallei ΔBPSS1504 in vivo zeigte eine etwa 1000-fache Virulenzattenuierung nach intranasaler Infektion von BALB/c-Mäusen. Durch Komplementation von BPSS1504 konnte der Wildtyp-Phänotyp wieder hergestellt werden. Ähnliche Phänotypen wie die von B. pseudomallei ΔBPSS1504 wurden kürzlich auch von Mutanten des T6SS-1-Effektorproteins Hcp1, der T6SS-1-Strukturkomponenten TssA/B und der T6SS-1 Regulatoren VirA/G und BprC berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass B. pseudomallei ΔBPSS1504 eine normale Expression von Schlüsselgenen des T6SS-1 inklusive hcp1, vgrG, tssA und dessen Regulatoren virA/G, bprC und bsaN aufwies. Weiterhin wies eine normale Hcp1-Sekretion darauf hin, dass die Funktionalität des T6SS-1 nicht von der BPSS1504-Deletion von beeinträchtigt wurde. Diese Daten legen nahe, dass die beobachteten Phänotypen von B. pseudomallei ΔBPSS1504, im Gegensatz zu den Phänotypen bisher bekannter Mutanten des T6SS-1,unabhängig von Hcp1 sind. Des Weiteren blieb auch die Funktion des T3SS-3 von der BPSS1504-Deletion unbeeinträchtigt, da das T3SS-3-Effektorprotein BopE und das Translokatorprotein BipD von B. pseudomallei ΔBPSS1504 normal sekretiert wurden. Ähnlich wie bei B. pseudomallei ΔBPSS1504, jedoch weniger stark ausgeprägt,konnten auch bei B. pseudomallei ΔbsaU Einschränkungen in der intrazellulären Replikation, eine verringerte Zytotoxizität sowie eine verzögerte Induktion der Riesenzellbildung gefunden werden. Die reduzierte Zytotoxizität von B. pseudomallei ΔbsaU ging mit Defekten in der Aktivierung der apoptotischen Caspase-7 sowie der pyroptotischen Caspase-1 einher. B. pseudomallei ΔbsaU konnte, wie Mutanten der T3SS-3-Gene bsaZ,bsaQ und bipD nur verzögert aus dem Endolysosomen ausbrechen. Dieser Effekt konnte durch Komplementation des bsaU-Gens zumindest teilweise wieder aufgehoben werden, was zeigt, dass es sich hierbei nicht um polare Effekte auf andere Gene handelt.
The coagulase-negative staphylococcal (CoNS) species Staphylococcus lugdunensis is unique in causing serious infections in humans that resemble those of Staphylococcus aureus rather than those of other CoNS species. The colonization and invasion of host tissue presupposes the presence of adherence factors, but only a few proteins mediating adhesion of S. lugdunensis to biotic surfaces are known yet. Here, we report on the functionality of the S. lugdunensis enolase (SlEno), which performs two distinct roles, first, as the metabolic enzyme of the glycolysis, and second, as an adherence factor to the extracellular matrix (ECM) of cells. Phylogenetic analyses of the SlEno confirmed their high conservation to enolases of other species and revealed a closer relationship to Staphylococcus epidermidis than to S. aureus. Using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry and Western blot experiments, we identified SlEno to be located in the cytoplasm as well as on the cell surface of S. lugdunensis. Recombinantly generated and surface-associated SlEno showed the usual enolase activity by catalyzing the conversion of 2-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate but, in addition, also displayed strong binding to immobilized laminin, fibronectin, fibrinogen, and collagen type IV in a dose-dependent manner. We also showed a strong binding of SlEno to plasminogen (Plg) and observed a tissue plasminogen activator (tPA)-dependent conversion of Plg to plasmin (Pln) whereby the Plg activation significantly increased in the presence of SlEno. This interaction might be dependent on lysines of the SlEno protein as binding to Plg was inhibited by ε-aminocaproic acid. Furthermore, the enhanced activation of the Plg/Pln system by SlEno enabled S. lugdunensis to migrate through a fibrin matrix. This migration was about 10-fold higher than without exogenously added SlEno. Finally, we observed a significantly higher clearance of S. lugdunensis by freshly prepared granulocytes and in the presence of anti-SlEno antibodies. In conclusion, these data demonstrate for the first time a moonlighting function of the S. lugdunensis enolase, which is an underrated virulence factor for colonization and invasion of tissues. Hence, SlEno might be a potential vaccine candidate to prevent severe infections caused by this pathogen.
Abstract
Multiple G‐tracts within the promoter region of the c‐myc oncogene may fold into various G‐quadruplexes with the recruitment of different tracts and guanosine residues for the G‐core assembly. Thermodynamic profiles for the folding of wild‐type and representative truncated as well as mutated sequences were extracted by comprehensive DSC experiments. The unique G‐quadruplex involving consecutive G‐tracts II–V with formation of two one‐nucleotide and one central two‐nucleotide propeller loop, previously proposed to be the biologically most relevant species, was found to be the most stable fold in terms of its Gibbs free energy of formation at ambient temperatures. Its stability derives from its short propeller loops but also from the favorable type of loop residues. Whereas quadruplex folds with long propeller loops are significantly disfavored, a snap‐back loop structure formed by incorporating a 3’‐terminal guanosine into the empty position of a tetrad seems highly competitive based on its thermodynamic stability. However, its destabilization by extending the 3’‐terminus questions the significance of such a species under in vivo conditions.
Drug alternatives to combat methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in human and animal healthcare are urgently needed. Recently, the recombinant bacteriophage endolysins, PRF-119 and its successor substance HY-133, have proven to be highly active against various S. aureus clonal lineages and to exhibit a very rapid bactericidal effect when standard methods for susceptibility testing are applied. Along with subsequent growth curve experiments, a re-growth phenomenon was observed in vitro necessitating its clarification for the assessment of the agent’s stability and activity as well as for methodological aspects of endolysin testing in general. Distinct in vitro parameters were comparatively examined applying also scanning electron microscopy, fluorescence assays and SDS-PAGE analysis. The shape and material of the culture vessels as well as the shaking conditions were identified as factors influencing the in vitro stability and activity of HY-133. The highest function maintenance was observed in plain centrifuge tubes. Based on this, the conditions and parameters of assays for testing the antimicrobial activities of phage endolysins were determined and adjusted. In particular, shear forces should be kept to a minimum. Our results form the basis for both future test standardization and re-growth-independent experiments as prerequisites for exact determination of the antimicrobial activities of engineered endolysins.
Hand hygiene is a cornerstone of infection prevention. However, few data are available for school children on their knowledge of infectious diseases and their prevention. The aim of the study was to develop and apply a standardized questionnaire for children when visiting primary schools to survey their knowledge about infectious diseases, pathogen transmission and prevention measures. Enrolling thirteen German primary schools, 493 questionnaires for grade three primary school children were included for further analyses, comprising 257 (52.1%) girls and 236 (47.9%) boys with an age range of 8–11 years. Out of 489 children, 91.2% participants indicated that they knew about human-to-human transmissible diseases. Of these, 445 children responded in detail, most frequently mentioning respiratory and gastrointestinal diseases, followed by childhood diseases. Addressing putative hygiene awareness-influencing factors, it was worrisome that more than 40.0% of the children avoided visiting the sanitary facilities at school. Most of the children (82.9%) noted that they did not like to use the sanitary facilities at school because of their uncleanliness and the poor hygienic behavior of their classmates. In conclusion, basic infection awareness exists already in primary school age children. Ideas about the origin and prevention of infections are retrievable, however, this knowledge is not always accurate and adequately contextualized. Since the condition of sanitary facilities has a strong influence on usage behavior, the child’s perspective should be given more consideration in the design and maintenance of sanitary facilities.
Hand hygiene is a cornerstone of infection prevention. However, few data are available for school children on their knowledge of infectious diseases and their prevention. The aim of the study was to develop and apply a standardized questionnaire for children when visiting primary schools to survey their knowledge about infectious diseases, pathogen transmission and prevention measures. Enrolling thirteen German primary schools, 493 questionnaires for grade three primary school children were included for further analyses, comprising 257 (52.1%) girls and 236 (47.9%) boys with an age range of 8–11 years. Out of 489 children, 91.2% participants indicated that they knew about human-to-human transmissible diseases. Of these, 445 children responded in detail, most frequently mentioning respiratory and gastrointestinal diseases, followed by childhood diseases. Addressing putative hygiene awareness-influencing factors, it was worrisome that more than 40.0% of the children avoided visiting the sanitary facilities at school. Most of the children (82.9%) noted that they did not like to use the sanitary facilities at school because of their uncleanliness and the poor hygienic behavior of their classmates. In conclusion, basic infection awareness exists already in primary school age children. Ideas about the origin and prevention of infections are retrievable, however, this knowledge is not always accurate and adequately contextualized. Since the condition of sanitary facilities has a strong influence on usage behavior, the child’s perspective should be given more consideration in the design and maintenance of sanitary facilities.
Global and even national genome surveillance approaches do not provide the resolution necessary for rapid and accurate direct response by local public health authorities. Hence, a regional network of microbiological laboratories in collaboration with the health departments of all districts of the German federal state of Mecklenburg-Western Pomerania (M-V) was formed to investigate the regional molecular epidemiology of circulating SARS-CoV-2 lineages between 11/2020 and 03/2022. More than 4750 samples from all M-V counties were sequenced using Illumina and Nanopore technologies. Overall, 3493 (73.5%) sequences fulfilled quality criteria for time-resolved and/or spatially-resolved maximum likelihood phylogenic analyses and k-mean/ median clustering (KMC). We identified 116 different Pangolin virus lineages that can be assigned to 16 Nextstrain clades. The ten most frequently detected virus lineages belonged to B.1.1.7, AY.122, AY.43, BA.1, B.1.617.2, BA.1.1, AY.9.2, AY.4, P.1 and AY.126. Time-resolved phylogenetic analyses showed the occurrence of virus clades as determined worldwide, but with a substantial delay of one to two months. Further spatio-temporal phylogenetic analyses revealed a regional outbreak of a Gamma variant limited to western M-V counties. Finally, KMC elucidated a successive introduction of the various virus lineages into M-V, possibly triggered by vacation periods with increased (inter-) national travel activities. The COVID-19 pandemic in M-V was shaped by a combination of several SARS-CoV-2 introductions, lockdown measures, restrictive quarantine of patients and the lineage specific replication rate. Complementing global and national surveillance, regional surveillance adds value by providing a higher level of surveillance resolution tailored to local health authorities.
Die Segmentierung des Influenza-A-Virusgenoms und die damit verbundene Möglichkeit des Reassortments sind von großer Bedeutung für die Adaptation an einen neuen Wirt und die Entstehung von Pandemien. So wurden verschiedene Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts durch ein humanes Virus ausgelöst, das mindestens das Hämagglutinin (HA) eines aviären Influenza-A-Virus übernommen hatte. Mit Hilfe der Reversen Genetik ist es möglich, den Austausch von Segmenten zwischen verschiedenen Influenza-Viren detailliert zu untersuchen. Es können Erkenntnisse zur Art und Häufigkeit von Reassortments gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der Entstehung potentiell pandemischer Viren führen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die revers-genetische Methode der target-primed plasmid amplification erfolgreich zur Generierung des vollständigen Plasmidsatzes des c-DNA-Genoms des humanen Influenza-A-Virus A/Denver/57 (H1N1) angewendet. Die Funktionsfähigkeit des klonierten Plasmidsatzes konnte durch Kotransfektionsexperimente gezeigt werden. In einem nächsten Schritt wurde eine PCR etabliert, welche die simultane Amplifikation der cDNA der NS-, M-, NA- und NP-Segmente eines beliebigen Influenza-A-Virus ermöglicht und damit die zeitaufwendige Klonierung der Influenza-Gene deutlich beschleunigt. Dafür wurde ein Primerpaar entwickelt, das an die konservierten Termini der Gensegmente bindet, aber am 3-Ende um die Gen-spezifischen Nukleotide verkürzt ist. Mit den entwickelten Primern kann außerdem das komplette Neuraminidase-Gen unabhängig vom Subtyp amplifiziert werden. In einer Reassortmentstudie konnte die etablierte PCR zur effektiven Genotypisierung eingesetzt werden. Gegenstand der Reassortmentstudie war die Frage, ob sich ältere und jüngere aviäre Stämme in ihrer Fähigkeit, ihr HA an einen humanen Stamm abzugeben, unterscheiden. Außerdem sollte untersucht werden, welche Segmente mit dem aviären HA kosegregieren. Dafür wurden Doppelinfektionsversuche mit jeweils einem der beiden aviären Influenza-Viren A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (DkUkr63) bzw. A/Mallard/Germany/Wv64-67/05 (H3N2) (MallGer05) und dem humanen Influenza-Virus A/Hongkong/1/68 (H3N2) (Hk68) durchgeführt. Das Einführen einer Elastase-abhängigen HA-Schnittstelle in das humane Virus Hk68 ermöglichte eine effektive Selektion von Reassortanten mit aviärem HA. Unter den jeweils 21 untersuchten Plaqueisolaten gab es 16 (DkUkr63) bzw. 18 (MallGer05) Reassortanten, die mindestens das aviäre HA erworben hatten. Geringe Häufigkeiten des Auftretens bestimmter Reassortanten lieferte Hinweise bezüglich Beschränkungen im Reassortment. Bei der Genotypisierung der Plaqueisolate wurden für DkUkr63 sieben und für MallGer05 vierzehn verschiedene Reassortantenspezies gefunden. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch der Segmente von DkUkr63 gegenüber denen von MallGer05 stärker eingeschränkt ist. Bemerkenswert war die häufige Kosegregation des NA mit HA beider Vogelviren. Die Wachstumskinetik auf humanen A549-Zellen zeigte darüber hinaus auch eine gute Replikation für alle HA/NA-Reassortanten. Beide Viren geben also ihr HA wie auch ihr NA leicht an einen humanen Stamm ab. Andererseits war die geringe Häufigkeiten von PB2- im Vergleich zu PB1-Reassortanten auffällig. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch des PB2-Segments im Vergleich zu PB1 stärker eingeschränkt ist. Eine der am besten replizierenden Reassortanten wies mit PB1, HA und NA von DkUkr63 die gleiche Genkonstellation auf wie das Pandemievirus der Asiatischen Grippe von 1957. Die Auswertung der Plaque-Morphologie ergab, dass die Plaque-Größe der Reassortanten von der Herkunft des NA abhängig ist. Verglichen mit dem eingeschränkten Wachstum des aviären Elternvirus DkUkr63 zeigten die meisten seiner Reassortanten ein besseres Wachstum auf humanen A549-Zellen. Das jüngere aviäre Elternvirus MallGer05 erreicht fast den Endtiter des humanen Hk68 und auch die meisten Reassortanten zeigten mit Hk68 vergleichbare Endtiter. Es wurden aber für beide Vogelviren auch einige Reassortanten gefunden, deren Replikation deutlich vermindert war, was auf eine geringe Kompatibilität der jeweiligen Segmente hindeutet. Sowohl für den älteren als auch für den jüngeren aviären Elternstamm wurden unter den gewählten Selektionsbedingungen verschiedene HA-Reassortanten mit guter Replikationsfähigkeit gefunden. Dementsprechend könnten auch unter natürlichen Bedingungen sogar niedrig pathogene aviäre Influenza-A-Viren mit geringer Adaptation an einen humanen Wirt bei Koinfektionen mit humanen Viren zur Bildung von neuen, potentiell pandemischen Viren beitragen.
Adenovirus-assoziierte Infektionen führen in immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten zu signifikanter Morbidität und Mortalität. Bisher gibt es keine effektive antivirale Chemotherapie. Die inhibitorische Aktivität von 20 strukturmodifizierten Nukleosidanaloga gegenüber ADV 7 und ADV 19 auf zellulärer Ebene wurde mittels Fluoreszenzfokusreduktionsassay untersucht. Starke selektive Hemmer der ADV-Replikation waren die Substanzen 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA), 2',3'-Didesoxycyitidin (ddC), 3'-Azido-2'-desoxyadenosin (N3AdR), 3'-Fluor-2'-desoxythymidin (FTdR) und 3'-Fluor-2'-desoxyguanosin. Gegenüber ADV 7 waren die Substanzen FTdR (IC50 6,1 µM), NsAdR (IC50 4,75 µM), ddC (IC50 3,1 µM) ddA (IC50 2,8 µM) und gegenüber ADV 19 die Substanzen FTdR (IC50 1,3 µM), FGdR (IC50 1,0 µM) und ddC (IC50 5,5 µM) die effektivsten antiviralen Substanzen. Die antivirale Wirkung der Nukleosidtriphosphatanaloga auf die ADV-Polymeraseaktivität auf molekularer Ebene wurde mittels ADV-Polymeraseassay untersucht. Die Synthese der ADV-Polymerase erfolgte unter Nutzung eines rekombinanten Ad pol Baculovirus Systems. Spodoptera frugiperda Zellen wurden mit rekombinantem Acpol 14 A infiziert um ausreichende Mengen ADV-Polymerase zu weiteren in-vitro-Untersuchungen zu erhalten. Sechs Nukleosidtriphosphat-Analoga wurden evaluiert. Die ermittelten Konzentrationen zur Hemmung der ADV DNA-Polymeraseaktivität um 50 % (IC50) lagen im Bereich von 0,63 bis 2,96 µM. Wirksamste Substanzen waren FTdR, FGdR und ddC.
Für die Bekämpfung bakterieller Infektionen ist das angeborene Immunsystem von essenzieller Bedeutung. Im Rahmen dieser Promotion wurden murine angeborene Immunmechanismen bei systemischer Infektion mit Burkholderia pseudomallei, dem gram-negativen Erreger der Melioidose, sowie pulmonaler Infektion mit dem gram-positiven Erreger Staphylococcus aureus bei genetisch heterogenen BALB/c- und C57BL/6-Mäusen untersucht. Für in vitro-Untersuchungen wurde zunächst im ersten Teil eine Methode zur serumfreien Kultivierung von primären Makrophagen aus murinen Knochenmarkstammzellen unter Verwendung des lipoproteinreduzierten Serumsupplements Panexin® etabliert. Derart kultivierte Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen wiesen wichtige Effektor-funktionen wie die Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose und bakterizide Aktivität auf. Außerdem gelang es, die in der Literatur unter FCS-Bedingungen beschriebenen polarisierten Makrophagen-Phänotypen auch unter serumfreien Bedingungen funktionell nachzuweisen. So wiesen C57BL/6-Makrophagen im Vergleich zu BALB/c-Makrophagen ein deutlich höheres bakterizides Potenzial gegenüber B. pseudomallei auf und produzierten größere Mengen des zytotoxischen Stickoxids, unterschieden sich jedoch nicht in ihrer Fähigkeit, E. coli zu eliminieren. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mithilfe dieses standardisierten Zellkultursystems gezeigt werden, dass Caspase-1 bereits in der Frühphase der B. pseudomallei-Infektion IFNγ-unabhängig für die bakterizide Potenz der Makrophagen erforderlich ist, die Caspase-1-Aktivität andererseits im gleichen Zeitraum jedoch eine Zunahme des zytotoxischen Erregereffektes verursacht. Durch die gestörte intrazelluläre Erregerelimination unmittelbar nach Infektion kam es im weiteren zeitlichen Verlauf zur Zunahme des erregerabhängigen Zelltodes, für den in der Literatur allerdings ursächlich auch das Fehlen verzögerter Caspase-1-abhängiger protektiver Effekte diskutiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Caspase-1 eine essenzielle Bedeutung für die in vivo-Resistenz und Generierung der inflammatorischen Zytokinantwort hat, welche zur Überwindung der akuten Infektion beiträgt. Während die Caspase-1-Expression bei unterschiedlich empfänglichen BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen nach Infektion vergleichbar war, könnte die gesteigerte IL-1β-Produktion bei resistenteren C57BL/6-Makrophagen darauf hinweisen, dass unterschiedliche Aktivitäten des Enzyms in Mausstämmen mit unterschiedlichen genotypischen Eigenschaften den Verlauf der murinen Melioidose beeinflussen. Im letzten Teil dieser Dissertation wurde erstmals am Beispiel von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen ein vergleichendes S. aureus-Pneumoniemodell entwickelt, bei dem BALB/c-Mäuse neben einer höheren Empfänglichkeit auch eine verminderte Fähigkeit aufwiesen, den Erreger aus der Lunge zu eliminieren. Während neutrophile Granulozyten für das Überleben erforderlich waren und die Organkeimzahlen signifikant zu reduzieren vermochten, steigerten Makrophagen die Mortalität, ohne jedoch Einfluss auf die Bakterienelimination zu haben. Für diese Mortalitätszunahme könnte eine überschießende Zytokinantwort mit der Folge eines Zytokinschocks verantwortlich sein. Schließlich wurde gezeigt, dass das bakterielle sae-Regulon, welches die Expression verschiedener bakterieller Proteine steuert, sowohl für die Virulenz, als auch für die intrapulmonale Persistenz des Erregers in diesem Infektionsmodell von entscheidender Bedeutung ist. Die zu beobachtenden Unterschiede in Mortalität und Organkeimzahlen belegen zugleich, dass das etablierte Mausmodell eine für die Untersuchung bakterieller Virulenzfaktoren ausreichende Sensitivität aufweist.
Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von zwei putativen Virulenzgenen von Burkholderia pseudomallei. Es wurde ein klassischer LysR-Typ Transkriptionsregulator (BPSL0117) mittels Tn5 Mutagenese als wichtiger Virulenzfaktor gefunden und mit verschiedenen in vitro, in vivo und weiterer molekularer Methoden wie gelfreie Proteomics untersucht. Daneben wurde ein hypothetisches Protein (BPSS1528 = bapA) mit unbekannter Funktion aus einen Typ-III-Sekretionssystem gezielt deletiert und funktionell beschrieben. Diese Mutante wies letztlich keine eingeschränkte Virulenz im Vergleich zum Wildtypstamm aus.
The pUS3, a serine/threonine protein kinase that is conserved in Alphaherpesvirinae may play an important in phosphorylation and regulation of the activities of viral and cellular proteins. It has also been proposed that pUS3 affects virulence. Whereas many studies of the pUS3 functions of HSV-1 and PrV, a closely related homolog of BHV-1 have supported these assumptions, the role of BHV-1pUS3 is not yet fully understood so far. The aims of this study therefore were to investigate the functions of BHV-1pUS3 for virus replication in cultured cells, effect on apoptosis and identification of protein interactions with cellular proteins and addressed the function of the aminoterminal region by generating a short isoform of BHV-1pUS3 which corresponds in size to the natural short isoforms of PrVpUS3 and HSV-1pUS3. Results of the study are briefly summarized here: -BHV-1pUS3 is, although not essential, beneficial for infectious replication of BHV-1 in-vitro. It also supports direct cell-to-cell spread of BHV-1/Aus12 and prevents the formation of electron dense aggregates with embedded capsids in nuclei of BHV-1 infected cells, a phenotype that may affect nuclear egress of BHV-1 nucleocapsids. -The protein, independent from other BHV-1 encoded functions, located mainly to the nuclei of cells. -In contrast to functions of pUS3 in PrV and HSV-1, the protein of BHV-1 has no anti-apoptotic activity. -Biologically active BHV-1pUS3 physically interacts with the cellular SET protein and overexpression of SET, independent from the expression of the protein, inhibits productive BHV-1 replication in a dose dependent manner. -The aminoterminal 101 amino acids of the protein are dispensable for all in-vitro functions tested whereas kinase activity is required.
Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are common opportunistic pathogens, but also ubiquitous human and animal commensals. Infection-associated CoNS from healthcare environments are typically characterized by pronounced antimicrobial resistance (AMR) including both methicillin- and multidrug-resistant isolates. Less is known about AMR patterns of CoNS colonizing the general population. Here we report on AMR in commensal CoNS recovered from 117 non-hospitalized volunteers in a region of Germany with a high livestock density. Among the 69 individuals colonized with CoNS, 29 had reported contacts to either companion or farm animals. CoNS were selectively cultivated from nasal swabs, followed by species definition by 16S rDNA sequencing and routine antibiotic susceptibility testing. Isolates displaying phenotypic AMR were further tested by PCR for presence of selected AMR genes. A total of 127 CoNS were isolated and Staphylococcus epidermidis (75%) was the most common CoNS species identified. Nine isolates (7%) were methicillin-resistant (MR) and carried the mecA gene, with seven individuals (10%) being colonized with at least one MR-CoNS isolate. While resistance against gentamicin, phenicols and spectinomycin was rare, high resistance rates were found against tetracycline (39%), erythromycin (33%) and fusidic acid (24%). In the majority of isolates, phenotypic resistance could be associated with corresponding AMR gene detection. Multidrug-resistance (MDR) was observed in 23% (29/127) of the isolates, with 33% (23/69) of the individuals being colonized with MDR-CoNS. The combined data suggest that MR- and MDR-CoNS are present in the community, with previous animal contact not significantly influencing the risk of becoming colonized with such isolates.
Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der ‘Melioidose’, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen Südostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation fähig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr maßgeblich an der Erkennung intrazellulärer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als ‘Inflammasom’ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1β und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie für die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens ‘Pyroptose’ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der Mortalitätsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegenüber B. pseudomallei näher untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abhängige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen während der Frühphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu späteren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen ließen ebenfalls eine verstärkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer Signalmoleküle in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen Phänotyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verhältnismäßig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. Darüber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsvermögen, ein geringeres Maß an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei für die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion für die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des ‘inner rod proteins’ BsaK vollständig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss ausübte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1β konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellulären Keimzahl in ΔBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. Demgegenüber führte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels Überexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle Fähigkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in Abhängigkeit von der Funktionalität der BopE-eigenen GEF-Domäne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ΔBsaK-infizierte BALB/c Mäuse im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte Mortalitätsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl für die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen für die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.
Untersuchungen zur Assoziation von Enterovirus und Adenovirus Infektionen mit Typ- 1- Diabetes
(2006)
Typ 1-Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, die zur Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen durch zytotoxische T-Lymphozyten führt. Es wird postuliert, dass der Prozeß durch verschiedene genetische Marker und Millieu-Cofaktoren beeinflusst wird. Es gibt Hinweise, dass Virusinfektionen einen T1D triggern können. Es wurden molekularbiologische Methoden zur molekularen Identifikation und Charakterisierung von Enterovirus RNA bzw. Adenovirus DNA etabliert. Es wurden signifikant erhöhte EV-RNA-Sequenzen in Autoantikörper-positiven Kindern und in Kindern mit neu diagnostizierten T1D nachgewiesen. Die Charakterisierung der Enterovirus-Amplicons zeigte eine hohe Homologie mit den Coxsackieviren B2, B4, B6 sowie mit ECHO 6. Für Adenovirus wurden keine Hinweise für eine Assoziation mit T1D gefunden. Die Daten stützen die Hypothese, dass verschiedene Enteroviren ätiologisch bedeutsam als Trigger und/oder Akzellerationsfaktor im Prozeß der T1D-Entwicklung sein können. Im Unterschied zu anderen Studien basieren diese Untersuchungen erstmalig auf einer normalen Schulkindpopulation ohne Verwandschaft ersten Grades zu T1D-Patienten. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit Konzepte für die Präventation und/oder Behandlung von Enterovirusinfektionen zu entwickeln.