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The Immunomodulator 1-Methyltryptophan Drives Tryptophan Catabolism Toward the Kynurenic Acid Branch
(2020)
Background: Animal model studies revealed that the application of 1-methyltryptophan (1-MT), a tryptophan (TRP) analog, surprisingly increased plasma levels of the TRP metabolite, kynurenic acid (KYNA). Under inflammatory conditions, KYNA has been shown to mediate various immunomodulatory effects. Therefore, the present study aims to confirm and clarify the effects of 1-MT on TRP metabolism in mice as well as in humans.
Methods: Splenocytes from Balb/C or indoleamine 2,3-dioxygenase knockout (IDO1−/−) mice or whole human blood were stimulated with 1-MT for 6, 24, or 36 h. C57BL/6 mice received 1-MT in drinking water for 5 days. Cell-free supernatants and plasma were analyzed for TRP and its metabolites by tandem mass spectrometry (MS/MS).
Results: 1-MT treatment induced an increase in TRP and its metabolite, KYNA in Balb/C, IDO−/− mice, and in human blood. Concurrently, the intermediate metabolite kynurenine (KYN), as well as the KYN/TRP ratio, were reduced after 1-MT treatment. The effects of 1-MT on TRP metabolites were similar after the in vivo application of 1-MT to C57BL/6 mice.
Conclusions: The data indicate that 1-MT induced an increase of KYNA ex vivo and in vivo confirming previously described results. Furthermore, the results of IDO−/− mice indicate that this effect seems not to be mediated by IDO1. Due to the proven immunomodulatory properties of KYNA, a shift toward this branch of the kynurenine pathway (KP) may be one potential mode of action by 1-MT and should be considered for further applications.
Das Prostatakarzinom ist einer der häufigsten malignen Tumoren des Mannes, für dessen Behandlung verschiedene Therapieoptionen zu Verfügung stehen. Aufgrund steigender Inzidenzzahlen und Sterbefälle ist das Verständnis der Pathophysiologie und biochemischer Zusammenhänge dieser Erkrankung für die Entwicklung neuer Ansätze in Therapie und Prävention von entscheidender Bedeutung.
Der Einfluss von PC-1 (Isoform 1 des Tumorproteins D52) auf die Proliferation, Tumorprogression und Entwicklung eines kastrationsresistenten Karzinoms unter Androgen-ablativer Therapie ist bekannt, genauere Mechanismen sind jedoch bis heute nicht vollständig geklärt. Durch Pulldown-Experimente aus Vorarbeiten wurde die Arginase-1 als möglicher Interaktionspartner von PC-1 identifiziert. Dieses Enzym fördert durch Bildung von Polyaminvorläufern und immunsupprimierende Eigenschaften die Proliferation in verschiedenen Tumorgeweben und ist wie PC-1 auch im Prostatakarzinom überexprimiert.
Zur Charakterisierung des Enzyms Arginase-1 und dessen Rolle im Argininmetabolismus des Prostatakarzinoms wurden Expressionsprofile beider Arginase-Isoformen sowie weiterer Enzyme des Argininstoffwechsels (ASSY, OTC, OAT) in LNCaP-Zellen unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen nach 3, 7 und 11 Tagen bestimmt. Die Quantifizierung von mRNA und Proteinen zeigte verringerte Expressionen von Arginase-1, Arginase-2 und PC-1 unter Androgenablation sowie erhöhte Expressionen unter Einfluss des synthetischen Steroid-hormons R1881. Die Werte der Enzymaktivitätsbestimmung der Arginase bestätigten diese Ergebnisse. In stabil transfizierten LNCaP-PC-1-Zellen wurde gezeigt, dass allein die Überexpression von PC-1 zu leicht erhöhten Expressionen beider Arginase-Isoformen führt.
Mit Hilfe von Zellfraktionierung und Immunfluoreszenzfärbungen konnten die intrazellulären Lokalisationen der untersuchten Proteine bestimmt werden. Die Arginase-1 wurde sowohl im Zytoplasma als auch im Kern detektiert, während PC-1 und andere Enzyme des Arginin-stoffwechsels vorwiegend im Zellplasma nachgewiesen werden konnten. Eine Kolokalisation zwischen Arginase-1 und PC-1 würde dementsprechend nur im Zytoplasma der Zellen erwartet werden. Mit Hilfe von Kolokalisationsanalysen anhand von Immunfluoreszenz-aufnahmen und der Co-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion zwischen PC-1 und Arginase-1 verifiziert werden.
Diese Erkenntnisse zur Arginase-1 sowie weitere, notwendige Untersuchungen einer potenziellen, möglicherweise synergistischen Interaktion mit PC-1 im Zusammenhang mit Proliferation und Tumorprogression des Prostatakarzinoms könnten neue Therapieansätze ermöglichen.
Untersuchungen zur Wirkung von miRNAs stehen im Fokus der aktuellen Forschungen, besonders aufgrund ihrer wichtigen regulatorischen Funktion bei der Biosynthese von Proteinen. Durch die Korrelation mit der Karzinomentwicklung und den Tumorstadien rücken miRNAs als prognostische Biomarker in den Vordergrund.
Mit dieser Arbeit wurden der Einfluss der miR-4417 als pro- oder antionkogen wirkende miRNA auf das Prostatakarzinom und dessen Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese untersucht. Hierzu wurde die miR-4417 mittels Transfektion in 4 verschiedenen Prostatakarzinom- Zelllinien überexprimiert. Die Quantifizierung erfolgte unter Anwendung der sogenannten stem loop RT-qPCR. Die modulierten Proteommuster der Zelllinien wurden quantitativ und qualitativ verglichen. Dabei fanden gelbasierte und gelfreie Methoden unter Beachtung statistischer Kriterien Verwendung. Bei der Analyse der 2D-Gele wurden ca. 1600 Spots detektiert und quantifiziert. Zellspezifisch ergaben sich zwischen 40 und 60 differentielle Expressionen. Mithilfe der Massenspektrometrie wurden die Peptide nach tryptischem Verdau analysiert und die Proteine identifiziert. Die Verifizierungen von ausgewählten, differenziell exprimierten Proteinen wurden mittels Westernblot durchgeführt.
Die Expression des Androgenrezeptors war unter miR-4417 Einfluss in den beiden kastrationsresistenten Zelllinien gemindert, ebenso wie die Isoform 1 des Tumorproteins D52. Dies lässt eine antionkogene Wirkung der miR-4417 vermuten. Im Gegensatz dazu war die Expression von Peroxiredoxin 3 erhöht. Da dieses Protein zu einer Resistenz von Zellen gegen die H2O2 induzierte Apoptose führt und somit Krebszellen einen Überlebensvorteil verschafft, besteht in diesem Zusammenhang der Verdacht auf einen proonkogenen Effekt der miR-4417. Auch bei weiteren untersuchten Proteinen wie dem Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 oder dem Poly(U)-binding-splicing factor PUF60 ergaben sich zum Teil gegensätzliche Expressionen. In weiteren Untersuchungen könnte geklärt werden, ob die pro- oder antionkogenen Eigenschaften dieser miRNA überwiegen oder ob möglicherweise bestimmte Einflussfaktoren bestehen, die dazu führen. Eventuell existieren der miR-4417 vorgeschaltete Regulationsmechanismen, die dessen gewebespezifische Wirkung beeinflussen.
Insgesamt ist mithilfe dieser Arbeit deutlich geworden, dass die miR-4417 eine bedeutende regulatorische Rolle in Bezug auf die Progression des Prostatakarzinoms einnimmt und somit einen wichtigen Ansatzpunkt für die weitere Krebsforschung darstellten könnte. Eine miRNA getriggerte Krebstherapie könnte auf Basis umfangreicher Forschungsdaten als alternative Methode Anwendung finden.
Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung des Menschen. Die Generierung neuen Wissens über Prozesse der Zellregulation und Zellkommunikation kann unser Verständnis über zugrundeliegende Pathomechanismen dieser Erkrankung erweitern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Diese Phosphoproteom-Analyse beschreibt Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen in HL-1 Kardiomyozyten in Abhängigkeit verschiedener Rapid Atrial Pacing (RAP) Stimulationsprotokolle. Um den Einfluss von Regenerationsphasen, wie es sie z. B. auch beim paroxysmalen Vorhofflimmern gibt, auf den Phosphorylierungsstatus von Proteinen zu untersuchen, wurden die Zellen nicht nur kontinuierlich, sondern auch in Intervallen RAP-stimuliert. Insgesamt konnten in dieser Arbeit 9626 Phosphorylierungen in 3463 Proteinen identifiziert werden, von denen 295 Phosphorylierungen in 261 Proteinen signifikant verändert waren. Stark veränderte Phosphorylierungen konnten z. B. in den Proteinen DOCK7 und MARK2 für kontinuierlich stimulierte HL-1 Zellen und OBSCN und JPH2 für Intervall-stimulierte HL-1 Zellen gefunden werden. Neben spezifisch regulierten Proteinphosphorylierungen konnten auch solche beschrieben werden, deren Regulation für kontinuierliches bzw. Intervall-RAP identisch waren (Overlap). Vertreter dieser Gruppe waren z. B. Phosphorylierungen der Proteine KCNH2 und ABLIM3. Eine Vielzahl beobachteter Unterschiede bezüglich der Richtung und Stärke der Regulation von Proteinphosphorylierungen zwischen kontinuierlich und Intervall- stimulierten HL-1 Zellen ist dabei ein deutliches Indiz für einen bestehenden Einfluss der Regenerationsphasen auf die Modulation zellulärer Signalwege. Bei der Zuordnung veränderter Protein-Phosphorylierungen zu definierten Signalwegen zeigte sich das Netrin-Signaling als signifikantes Beispiel für Signalwege, die sowohl bei kontinuierlich als auch bei Intervall-stimulierten HL-1 Zellen einer Modulation unterliegen. Veränderungen in der Regulation der Proteinphosphorylierung bzw. der Proteinexpression konnten dabei vor allem in einem bestimmten Teil des Signalweges identifiziert werden, an dem die Proteine Netrin, DCC-Rezeptor, NCK, RAC und ABLIM beteiligt sind.
Background: Mitochondrial dynamics are important for glucose-stimulated insulin secretion in pancreatic beta cells. The mitochondrial elongation factor MiD51 has been proposed to act as an anchor that recruits Drp1 from the cytosol to the outer mitochondrial membrane. Whether MiD51 promotes mitochondrial fusion by inactivation of Drp1 is a controversial issue. Since both the underlying mechanism and the effects on mitochondrial function remain unknown, this study was conducted to investigate the role of MiD51 in beta cells.
Methods: Overexpression and downregulation of MiD51 in mouse insulinoma 6 (MIN6) and mouse islet cells was achieved using the pcDNA expression vector and specific siRNA, respectively. Expression of genes regulating mitochondrial dynamics and autophagy was analyzed by quantitative Real-Time PCR, glucose-stimulated insulin secretion by ELISA, and cellular oxygen consumption rate by optode sensor technology. Mitochondrial membrane potential and morphology were visualized after TMRE and MitoTracker Green staining, respectively. Immunofluorescence analyses were examined by confocal microscopy.
Results: MiD51 is expressed in insulin-positive mouse and human pancreatic islet and MIN6 cells. Overexpression of MiD51 resulted in mitochondrial fragmentation and cluster formation in MIN6 cells. Mitochondrial membrane potential, glucose-induced oxygen consumption rate and glucose-stimulated insulin secretion were reduced in MIN6 cells with high MiD51 expression. LC3 expression remained unchanged. Downregulation of MiD51 resulted in inhomogeneity of the mitochondrial network in MIN6 cells with hyperelongated and fragmented mitochondria. Mitochondrial membrane potential, maximal and glucose-induced oxygen consumption rate and insulin secretion were diminished in MIN6 cells with low MiD51 expression. Furthermore, reduced Mfn2 and Parkin expression was observed. Based on MiD51 overexpression and downregulation, changes in the mitochondrial network structure similar to those in MIN6 cells were also observed in mouse islet cells.
Conclusion: We have demonstrated that MiD51 plays a pivotal role in regulating mitochondrial function and hence insulin secretion in MIN6 cells. We propose that this anchor protein of Drp1 is important to maintain a homogeneous mitochondrial network and to avoid morphologies such as hyperelongation and clustering which are inaccessible for degradation by autophagy. Assuming that insulin granule degradation frequently suppresses autophagy in beta cells, MiD51 could be a key element maintaining mitochondrial health.
Abstract
Aims
Treating patients with acute decompensated heart failure (ADHF) presenting with volume overload is a common task. However, optimal guidance of decongesting therapy and treatment targets are not well defined. The inferior vena cava (IVC) diameter and its collapsibility can be used to estimate right atrial pressure, which is a measure of right‐sided haemodynamic congestion. The CAVA‐ADHF‐DZHK10 trial is designed to test the hypothesis that ultrasound assessment of the IVC in addition to clinical assessment improves decongestion as compared with clinical assessment alone.
Methods and results
CAVA‐ADHF‐DZHK10 is a randomized, controlled, patient‐blinded, multicentre, parallel‐group trial randomly assigning 388 patients with ADHF to either decongesting therapy guided by ultrasound assessment of the IVC in addition to clinical assessment or clinical assessment alone. IVC ultrasound will be performed daily between baseline and hospital discharge in all patients. However, ultrasound results will only be reported to treating physicians in the intervention group. Treatment target is relief of congestion‐related signs and symptoms in both groups with the additional goal to reduce the IVC diameter ≤21 mm and increase IVC collapsibility >50% in the intervention group. The primary endpoint is change in N‐terminal pro‐brain natriuretic peptide from baseline to hospital discharge. Secondary endpoints evaluate feasibility, efficacy of decongestion on other scales, and the impact of the intervention on clinical endpoints.
Conclusions
CAVA‐ADHF‐DZHK10 will investigate whether IVC ultrasound supplementing clinical assessment improves decongestion in patients admitted for ADHF.
Die miRNAs sind an der Regulation der Genexpression und somit an der zellulären Proteinbiosynthese beteiligt. Die Expressionsmuster von miRNAs unterscheiden sich sowohl bei Entwicklung als auch bei verschiedenen Stadien von Tumoren, sodass sie zu interessanten Kandidaten als prognostische Biomarker werden können.
In der vorliegenden Arbeit stand die Überexpression der miR-3687 im Vordergrund. Ihre Rolle als pro- oder antionkogen agierende miRNA sollte untersucht werden. Mithilfe der Transfektion prostataspezifischer kastrationssensibler sowie kastrationsresistenter Zelllinien konnte eine Überexpression der miR-3687 in Prostatagewebe simuliert werden. Um den Erfolg der Zelltransfektion zu quantifizieren, wurde die stem – loop RT-qPCR etabliert.
Mittels Massenspektrometrie konnten die differentiell exprimierten Proteine analysiert werden. Zur Anwendung kamen 2 verschiedenen Verfahren, gelfrei sowie gelbasiert. Dabei ergaben sich deutliche zellspezifische Unterschiede. Im gelbasierten Ansatz wurden beispielsweise für PC-3 Zellen ca. 1685 Proteine, im gelfreien Ansatz bis zu 543 Proteine (bei min. 2 Peptide count) detektiert, die anhand statistischer Parameter ausgewählt wurden.
Über Western Blot Experimente erfolgte die Verifizierung interessanter Proteine. Hierbei konnte gezeigt werden, dass PC-3 Zellen miR-3687 reguliert die kleine Isoform des Androgenrezeptors exprimieren. Insbesondere das Protein Vimentin zeigte unter miR-3687 Einfluss in den beiden kastrationssensiblen Zelllinien eine Expressionsminderung. Da es sich bei diesem Protein um einen Marker für den epithelial mesenchymalen Übergang handelt, könnte die Überexpression der miR-3687 der Metastasierung von Krebszellen entgegenwirken und so einen neuen Therapieansatz darstellen.
Hinweise auf einen antionkogenen Effekt ergeben die verminderte Expression des Androgenrezeptors in den kastrationsresistenten Zelllinien, die signifikant verminderte Expression des Tumorproteins D52-IF1 sowie die verminderte Expression des Proteins β3-Tubulin in allen Zelllinien.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Vielzahl an Proteinen durch miR-3687 reguliert werden. Bei weiterer Untersuchung der miR-3687 könnte geklärt werden, ob dessen Überexpression allgemein im Gewebe oder nur in ausgewählten Zelllinien antionkogene Wirkungen aufweist und damit tumorsupprimierend wirkt, sodass sich daraus eine spezifische Therapie, beispielsweise nur für das kastrationsresistente Stadium des Prostatakarzinoms, ergeben könnte.
The failure of insulin-producingβ-cells is the underlying cause of hyperglycemia in diabetes mellitus.β-cell decay has been linked to hypoxia, chronic inflammation,and oxidative stress. Thioredoxin (Trx) proteins are major actors in redox signaling and essential for signal transduction and the cellular stress response. We haveanalyzed the cytosolic, mitochondrial, and extracellular Trx system proteins in hypoxic and cytokine-induced stress usingβ-cell culture, isolated pancreatic islets, andpancreatic islet transplantation modelling low oxygen supply.Protein levels of cytosolic Trx1 and Trx reductase (TrxR) 1 significantly decreased, while mitochondrial Trx2 and TrxR2 increased upon hypoxia and reox-ygenation. Interestingly, Trx1 was secreted byβ-cells during hypoxia. Moreover, murine and human pancreatic islet grafts released Trx1 upon glucose stimulation.Survival of transplanted islets was substantially impaired by the TrxR inhibitor auranofin.Since a release was prominent upon hypoxia, putative paracrine effects of Trx1 onβ-cells were examined. In fact, exogenously added recombinant hTrx1 mitigatedapoptosis and preserved glucose sensitivity in pancreatic islets subjected to hypoxia and inflammatory stimuli, dependent on its redox activity. Human subjects werestudied, demonstrating a transient increase in extracellular Trx1 in serum after glucose challenge. This increase correlated with better pancreatic islet function.Moreover, hTrx1 inhibited the migration of primary murine macrophages.In conclusion, our study offers evidence for paracrine functions of extracellular Trx1 that improve the survival and function of pancreaticβ-cells.
Endogenous redox systems not only counteract oxidative damage induced by high levels of hydroxyl radicals (OH·) under pathological conditions, but also shape redox signaling as a key player in the regulation of physiological processes. Second messengers like hydrogen peroxide and nitric oxide, as well as redox enzymes of the Thioredoxin (Trx) family, including Trxs, glutaredoxins (Grxs), and peroxiredoxins (Prxs) modulate reversible, oxidative modifications of proteins. Thereby redox regulation is part of various cellular processes such as the immune response and Trx proteins have been linked in different disorders including inflammatory diseases. Here, we have analyzed the protein distribution of representative oxidoreductases of the Trx fold protein family—Trx1, Grx1, Grx2, and Prx2—in a murine model of allergic asthma bronchiale, as well as their potential therapeutic impact on type-2 driven airway inflammation. Ovalbumin (OVA) sensitization and challenge using the type-2 prone Balb/c mouse strain resulted in increased levels of all investigated proteins in distinct cellular patterns. While concomitant treatment with Grx1 and Prx2 did not show any therapeutic impact on the outcome of the disease, Grx2 or Trx1 treatment before and during the OVA challenge phase displayed pronounced protective effects on the manifestation of allergic airway inflammation. Eosinophil numbers and the type-2 cytokine IL-5 were significantly reduced while lung function parameters profoundly improved. The number of macrophages in the bronchoalveolar lavage (BAL) did not change significantly, however, the release of nitric oxide that was linked to airway inflammation was successfully prevented by enzymatically active Grx2 ex vivo. The Grx2 Cys-X-X-Ser mutant that facilitates de-/glutathionylation, but does not catalyze dithiol/disulfide exchange lost the ability to protect from airway hyper reactivity and to decrease NO release by macrophages, however, it reduced the number of infiltrating immune cells and IL-5 release. Altogether, this study demonstrates that specific redox proteins and particular enzyme activities protect against inflammatory damage. During OVA-induced allergic airway inflammation, administration of Grx2 exerts beneficial and thus potentially therapeutic effects.
Despite their very close structural similarity, CxxC/S-type (class I) glutaredoxins (Grxs) actas oxidoreductases, while CGFS-type (class II) Grxs act as FeS cluster transferases. Here weshow that the key determinant of Grx function is a distinct loop structure adjacent to theactive site. Engineering of a CxxC/S-type Grx with a CGFS-type loop switched its functionfrom oxidoreductase to FeS transferase. Engineering of a CGFS-type Grx with a CxxC/S-typeloop abolished FeS transferase activity and activated the oxidative half reaction of the oxi-doreductase. The reductive half-reaction, requiring the interaction with a second GSHmolecule, was enabled by switching additional residues in the active site. We explain howsubtle structural differences, mostly depending on the structure of one particular loop, act inconcert to determine Grx function.
Zusammenfassung:
Zielstellung dieser Arbeit war es, den Einfluss von „lone atrial fibrillation“ auf die extrazelluläre und intrazelluläre Signaltransduktion des TGF-beta1-Signalweges zu untersuchen. Dazu wurde das Modell des „acute rapid pacing“ unter Verwendung muriner HL-1-Zellen genutzt. Weiterhin wurde die Einflussnahme von Irbesartan auf die festgestellten Veränderungen geprüft.
„Acute rapid pacing“ führte zu einer erhöhten mRNA-Expression profibrotischer Faktoren wie CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Marker für kardiale Schädigung wie MSTN und FSTL3 zeigten ebenfalls eine Erhöhung des mRNA-Gehaltes nach „acute rapid pacing“. Kardial protektive Faktoren wie FSTL1 fanden sich im mRNA-Gehalt dagegen erniedrigt. Auf Proteinebene zeigte sich eine Mehrexpression des Stressmarkers GSK. Die Verwendung von Irbesartan beim „acute rapid pacing“ führte zu einer Reduktion der elevierten mRNA-Gehalte der profibrotischen Faktoren CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Gleichfalls sank durch Irbesartan der erhöhte mRNA-Gehalt der kardialen Schädigungsmarker MSTN und FSTL3. Auf den mRNA-Gehalt des kardioprotektiven FSTL1 hatte Irbesartan keinen bedeutenden Einfluss. Auf Proteinebene konnte eine Minderexpression des Stressmarkers GSK festgestellt werden, wenn „rapidly paced“ Zellen mit Irbesartan inkubiert worden waren. Für andere untersuchte, mutmaßliche Modifikatoren wie Endoglin und FSTL5 lassen sich keine relevanten Aussagen ableiten.
In Bezug auf den weiteren Signalweg sprechen die Ergebnisse der mRNA-Werte von ALK1 (Acvrl1), ALK2 (Acvr1) und ALK5 (Tgfbr1) nach „acute rapid pacing“ für eine Aktivierung des Phospho-Smad-1/-5/-8-Schenkels. Die Ergebnisse der Proteinexpression von Phospho-Smad-1/-5/-8 und phospho-Smad-2 nach „acute rapid pacing“ bzw. Inkubation mit TGF-beta1 stützen diese These.
Tgfbr2-mRNA konnte in HL-1-Zellen wiederholt nicht nachgewiesen werden, wurde jedoch in Kardiozyten von Mus musculus detektiert. Dies spricht für relevante Unterschiede im kanonischen TGF-beta-Signalweg zwischen HL-1-Zellen und nativem Mausgewebe.
Die untersuchten Zielgene des TGF-beta-Signalwegs – ID1, ID2 und ID3 – zeigten in Bezug auf ihre mRNA nach „acute rapid pacing“ ein differenziertes Verhalten mit Anstieg von ID1 und Absenkung von ID2 und ID3, was zum Prozess eines Remodelings passt. Irbesartan führte in Bezug auf die mRNA der genannten Zielgene nach „acute rapid pacing“ zu keiner signifikanten Änderung.