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Der (Pro)Renin Rezeptor ((P)RR, auch ATP6ap2) wurde 2002 als membranständiges Protein entdeckt. Seitdem treten neben dem Renin-Angiotensinogen-Angiotensin System (RAAS) immer mehr Signalwege zu Tage, die von der Funktion des (P)RR abhängen. Hierzu zählen neben dem kanonischen Wnt – pathway und dem nicht kanonischen Wnt-PCP (planar cell polarity) auch ein Einfluss auf vesikuläre ATPasen und Transkriptonsfaktoren (PLZF Erk1/2). Wegen frühzeitig letaler Verläufe unter vollständiger (P)RR Elimination in vivo bleibt mit einer moderaten Verminderung der Expression (Downregulation) ein Weg, um die Relevanz und Beteiligung des Rezeptors weiter zu untersuchen. In der tumorösen renalen Zelllinie As4.1 wurde hierzu durch die AG Peters eine selektive (P)RR Downregulation etabliert. Die hierunter erfolgte unselektive Analyse des gesamten Transkriptoms zeigte 28 relevante Änderungen der Transkriptkonzentrationen, dessen zugehörige Genprodukte sich funktionell in zwei Gruppen teilen lassen. Einerseits waren mehrere Zilien assoziierte Transkripte nach (P)RR Downregulation erhöht, andererseits waren Zellzyklus assoziierte Transkripte vorrangig vermindert. Hieraus ergaben sich als Zielstellungen für die Arbeit:
1.) eine erneute gezielte und statisisch belastbare Überprüfung der zuvor veränderten Transkriptkozentrationen unter (P)RR Downregulation, 2.) eine funktionelle Untersuchung des Zusammenhangs von (P)RR zur ziliären Expression und dem Zellzyklus, 3.) die Analyse möglicher vermittelnder Signalwege.
Durch molekularbiologische und funktionelle Untersuchungen, Flureszenszmikroskopie und FACS Analysen, wurden im Rahmen dieser Arbeit (ad 1) die Transkriptveränderungen bestätigt, (ad 2) eine relevant verminderte Proliferationsrate und ein Zellzyklusarrest, bei gleichzeitig erhöhter Expression des primären Ziliums unter (P)RR Downregulation nachgewiesen, sowie (ad 3) Transkriptmengen Steigerungen des kanonischen und Wnt-PCP gemessen.
Ohne Analyse der zugehörigen Proteinmengen lässt sich aus den Ergebnissen nur vorsichtig schlussfolgern, dass der (P)RR (ad 1) möglicherweise im Aufbau des primären Zilium und/oder in der Entstehung von Ziliopathien beteiligt ist, (ad 2) eine (P)RR Downregulierung den Zellzyklus protrahiert und die Expression des primären Ziliums verstärkt und (ad 3) die Wnt-Signalwege dies vermitteln könnten. Neben dem ausstehenden Nachweis auf Proteinebene wäre ein gezielter Vergleich von primärem Zilium (fast ubiquitär, Zellzyklus abhängige Expression) gegenüber den spezialisierten Zilien der symptomatischen Ziliopathien (Retinitis pigmentosa, Polyzystische Nierenerkrankung) interessant, wobei in der Einordnung der Ergebnisse die Sonderrolle der hier gewählten Zellkultur (As4.1, renale Tumorlinie) berücksichtigt werden muss.
Zahlreiche Studien liefern Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen reaktiven Sauerstoffspezies und der Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen, wie der Hypertonie. Besonders NADPH-Oxidase-abhängige Sauerstoffradikale wurden als wichtige krankheitserzeugende Faktoren in der Entwicklung und Aufrechterhaltung kardiovaskulärer Erkrankungen, wie der arteriellen Hypertonie identifiziert und Substanzen erforscht, die zu experimentellen und therapeutischen Zwecken die NADPH-Oxidase-Aktivität hemmen. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch frühzeitige Behandlung spontan hypertensiver Ratten mit einer Substanz, die NADPH-Oxidase-hemmende Eigenschaften hat, eine langfristige Blutdrucksenkung und eine Verbesserung der endothelvermittelten Vasodilatation zu erreichen. Dazu wurde eine Gruppe von 8 SHR über das Trinkwasser mit dem NADPH-Oxidase-Hemmer Apocynin behandelt und mit Hilfe der Radiotelemetrie der systolische, diastolische Blutdruck sowie die Herzfrequenz registriert. Die Apocynin-behandelten SHR wurden mit einer Gruppe von 6 unbehandelten SHR-Kontrolltieren verglichen. Neben diesen Experimenten wurden Untersuchungen zur Endothelfunktion Apocynin-behandelter SHR an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien und zur vasodilatierenden Wirkung von Apocynin an Interlobar- und Koronararterien von F344 Ratten mit einem Small-Vessel-Myographen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass die Behandlung der SHR mit Apocynin bis zur 8. Lebenswoche keine langfristige Blutdrucksenkung zur Folge hatte. Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich der Blutdrücke ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied. Die Untersuchungen zur endothelvermittelten Vasodilatation mit Acetylcholin an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien Apocynin-behandelter und unbehandelter SHR zeigten, dass durch die Behandlung der SHR mit Apocynin keine Verbesserung der renalen und koronaren Endothelfunktion im Vergleich zu den Kontrollen resultierte. Die Experimente zur Klärung der Mechanismen, die die vasodilatierende Wirkung von Apocynin vermitteln ergaben, dass durch die Hemmung der NADPH-Oxidase-abhängigen Sauerstoffradikale, durch die Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium, durch Kalium und durch die Inhibition der Proteinkinase A und G die Apocynin-induzierte Vasodilatation nicht signifikant gehemmt wurde. Durch die Inkubation der Arteriensegmente mit dem Rho-Kinase-Hemmer Y-27632 wurde die Vasopressin-induzierte Vasokonstriktion signifikant abgeschwächt und die kumulative Zugabe von Apocynin zeigte keine zusätzliche Wirkung auf die Wandspannung. Diese Ergebnisse belegen, dass die renalen Interlobar- und Koronararterien von SHR und F344 Ratten auf Apocynin mit einem ausgeprägten Dilatationsverhalten reagierten, die Vasodilatation jedoch nicht über eine Hemmung der NADPH-Oxidase, vermutlich aber über eine Hemmung der Rho-Kinase vermittelt wird.
In vorrausgegangen Studien konnte gezeigt werden, dass neonatale Sympathektomie bei SHR eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorruft. Es zeigte sich bei renalen Widerstandsgefäßen sympathektomierter SHR eine gesteigerte Noradrenalin-Sensitivität und eine vermehrte Vasokonstriktion nach spezifischer L-Typ-Ca2+-Kanalaktivierung. Die Mechanismen der Noradrenalin-Supersensitivität nach neonataler Sympathektomie sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Ziel der durchgeführten Experimente war es, mögliche Veränderungen nach neonataler Sympathektomie in renalen und mesenterialen Widerstandsgefäßen zu charakterisieren und dabei auf eine Abhängigkeit vom Gefäßbett und Geschlecht zu untersuchen. Es wurden normotensive Wistar-Ratten verwendet, welche per Guanethidin-Injektionen und bilateralen Entfernung des Nebennierenmarks sympathisch denerviert worden und schein-sympathektomierte Kontrollen. Im Alter von 11-14 Wochen erfolgte die myographische Untersuchung der proximalen Widerstandsarterien von Niere und Mesenterium. Dafür wurden die distalen Interlobararterien der Niere und die 3. Generation von Aufzweigungen der Arteria mesenterica superior beider Geschlechter verwendet. Zusätzlich wurden diese Gefäße per real-time PCR auf die Expression verschiedener Gene untersucht. Die entnommenen isolierten Segmente der renalen und mesenterialen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihres Kontraktionsverhaltens myographisch untersucht. Dafür erstellten wir kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven unter Gabe von Noradrenalin. Es zeigte sich bei renalen und mesenterialen Arterien der sympathektomierten Tiere eine signifikante Linksverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve als Ausdruck einer gesteigerten Sensitivität der Gefäße auf Noradrenalin nach neonataler Sympathektomie. In einem zweiten myographischen Experiment untersuchten wir die Veränderungen der Gefäßantwort auf kumulative Stimulation mittels Noradrenalin unter L-Typ-Ca2+-Hemmung mittels Nifedipin. In diesem Experiment zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere eine Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurven. Dieser Effekt war an den mesenterialen Arterien nicht nachzuweisen. Im dritten Experiment untersuchten wir die Gefäße auf ihr Kontraktionsverhalten nach selektiver L-Typ-Ca2+-Aktivierung mittels S-(-)-BayK8644. Wir konnten dabei bei den renalen, aber nicht in den mesenterialen Arterien eine signifikante Vasokonstriktion bei den sympathektomierten Tieren nachweisen. Zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die zu dieser Noradrenalin-Supersensitivität führen, wurden im letzten Experiment Konzentrations-Wirkungs-Kurven für Noradrenalin unter ROCK-Inhibition mittels Y27632 erstellt. Es zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Gruppe eine signifikante Rechtsverschiebung der NA Konzentrations-Wirkungs-Kurven durch die Inhibition der ROCK. Dieser Effekt konnte für die mesenterialen Arterien nicht nachgewiesen werden. In den beschriebenen myographischen Experimenten ließen sich keine geschlechtsspezifische Unterschiede feststellen. Die renalen und mesenterialen Gefäße wurden anschließend noch in einer real-time PCR auf die Expression der ROCK-I, ROCK-II und der Cav1.2-Kanäle hin untersucht und auf die Haushaltsgene β-Actin und PBGD normiert. Es zeigte sich in der Gruppe der weiblichen sympathektomierten Tiere eine signifikant gesteigerte Expression der Cav1.2-Kanäle in den untersuchten Nierenarterien. In der Gruppe der männlich-sympathektomierten und den Mesenterialarterien beider Geschlechter zeigten sich keine Veränderungen in der Expression der ROCK oder der Cav1.2-Kanäle. Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass neonatale Sympathektomie bei normotensiven Ratten zu einer gesteigerten Noradrenalin-Sensitivität der glatten Muskelzellen von renalen und mesenterialen Widerstandsarterien führt. Diese Noradrenalin-Supersensitivität zeigt eine Abhängigkeit vom Gefäßbett. In den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere ließ sich eine gesteigerte Abhängigkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion von der ROCK und der Funktion der Cav1.2-Kanäle nachweisen. Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede nach neonataler Sympathektomie zeigten sich in der Expression der Cav1.2-Kanäle, welche in der Gruppe der weiblich sympathektomierten Tiere gesteigert waren.
The dentate gyrus (DG) of the hippocampus is one of the stem cell housing niches in the adult mammalian brain. Canonical Wingless-type (Wnt) signals provided by the microenvironment are one of the major niche factors that regulate the differentiation of adult neural stem cells (aNSCs) towards the neuronal lineage. Wnts are part of a complex and diverse set of signaling pathways with a wide range of possible interactions. It remains unknown whether different canonical and non-canonical Wnt signals act in a stage-specific manner to regulate distinctive steps of adult hippocampal neurogenesis. Using in vitro assays on adult hippocampal NSCs, we identified an attenuation of canonical Wnt/ß-Catenin signaling responsiveness in the course of neuronal differentiation, while non-canonical Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) signaling events progressively increased. Single-cell genetic manipulations were performed by using retroviral vectors to target dividing progenitor cells in the murine hippocampus. Retrovirus-mediated knockdown of ATP6AP2, a recently discovered core protein involved in both Wnt signaling pathways, revealed that the dual role of this adaptor protein is dependent on the signaling context that is present. We were able to confirm its dual role in neurogenic Wnt signaling in cultured adult hippocampal progenitors (AHPs) for both canonical Wnt signaling in proliferating AHPs and non-canonical Wnt signaling in differentiating AHPs. Specific knockdown of ATP6AP2 in neural progenitor cells in vivo resulted in a decreased induction of neuronal cell fate and severe morphological defects of newborn neurons, likely via altering both canonical and non-canonical Wnt signaling. Furthermore, in vivo knockdown of PCP core proteins CELSR1-3 and FZD3 mimicked the maturational defects of ATP6AP2-deficient neuroblasts but did not affect granule cell fate. In summary, the data presented here characterize a transition of Wnt signaling responsiveness from Wnt/ß-Catenin signaling to non-canonical Wnt/PCP signaling in the course of granule cell fate that was confirmed in a human pluripotent stem cell (hPSC)-based model of dentate granule neurogenesis. Our findings suggest that these pathways show stage-dependent activities and regulate distinct steps of adult dentate granule cell neurogenesis. Conclusively, we provide evidence for a stage-specific regulation of fate determination through the Wnt/ß-Catenin pathway and granule cell morphogenesis through the Wnt/PCP signaling pathway, including the FZD3-CELSR1-3 system. Additionally, the Wnt adaptor protein ATP6AP2 is involved in earlier and later stages of adult neurogenesis and its knockdown in vivo resembles all phenotypic features of both canonical and Wnt/PCP signaling mutants.
Der epitheliale Natriumkanal ist an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. In den Sammelrohrepithelzellen der Niere trägt er im Wesentlichen zur Na+- und Wasserreabsorption bei. In den glatten Gefäßmuskelzellen kann er als Mechanosensor die mechanischen Gefäßwandeigenschaften beeinflussen. Die Expression und Aktivität des ENaC werden durch das Mineralokortikoid Aldosteron moduliert. Eine Blockade der ENaC-Funktionalität ist über das Diuretikum Amilorid möglich. Inwieweit der ENaC zur Entwicklung renovaskulärer Veränderungen als Bestandteil der Pa-thogenese einer vom Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS)-abhängigen Hypertonieform beiträgt, ist Gegenstand dieser Arbeit. Mit Hilfe von in vitro- und in vivo-Experimenten an proximalen Widerstandsgefäßen haben wir die Funktion proximaler Widerstandsgefäße nach der Induktion einer experimentellen arteriellen Hypertonie untersucht. Dazu verwendeten wir ein transgeninduziertes Rattenmo-dell (Cyp1a1ren-2), das sich durch ein überaktives RAAS auszeichnet. Die Untersuchungen ergaben, dass sich die Compliance der Widerstandsarterien von trans-geninduzierten Ratten zu denen der normotensiven Kontrollen bzw. von Amilorid-behandelten transgenen Tieren nicht signifikant unterscheidet. Auch im Hinblick auf die α1-adrenerge Vasokonstriktion mit dem Rezeptoragonisten Phenylephrin ergaben sich in vitro und in vivo ähnliche Gefäßantworten zwischen den vergleichenden Gruppen. Im Rahmen der Acetylcholin-induzierten, endothelabhängigen Vasodilatation sahen wir bei Cyp1a1ren-2-Ratten nach Transgeninduktion und auch unter Amilorid-Einfluss keine signifikanten Veränderungen der Gefäßeigenschaften. Im Gegensatz dazu ließ sich eine Desensibilisierung auf Angiotensin II und ein reduzierter Gefäßwiderstand nach Transgeninduktion im Vergleich zur Kontrolle bzw. zu transgeninduzierten Cyp1a1ren-2-Tieren nach Amilorid-Gabe abbilden. Durch die Behandlung mit dem ENaC-Inhibitor Amilorid konnte bei transgeninduzierten Ratten der Blutdruck effizient gesenkt werden. Hierbei scheint die gesteigerte Elektrolytausscheidung über das renale Sammelrohr der entscheidene Faktor zu sein. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse, dass nicht ENaC-abhängige Veränderungen der Funktion von Widerstandsgefäßen, sondern ENaC-abhängige Prozesse der renalen Natrium-Reabsorption an der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie bei hypertensiven Cyp1a1ren-2-transgenen Ratten beteiligt sind.
Effekte einer Überexpression von Angiotensin II Typ 2 Rezeptoren in der Nebenniere von Ratten
(2010)
Die Kontrolle der Aldosteronbiosynthese in der ZG der Nebenniere wird hauptsächlich über den AT1R vermittelt. Die Funktion des AT2R hingegen, der in geringerem Ausmaß ebenfalls in der ZG exprimiert wird, ist weitgehend ungeklärt. Zur Untersuchung der Rolle des AT2R bei der AT1R-vermittelten Aldosteronbiosynthese wurde ein transgenes Rattenmodell entwickelt, dass Maus-AT2R in der Nebenniere, im Herz, Gehirn, Skelettmuskel, in Gefäßen und Niere überexprimiert. Mittels nicht radioaktiver ISH konnte eine starke Überexpression von Maus-AT2R in der ZG nachgewiesen werden. Nach Stimulation des RAS mit exogen zugeführtem ANGII in einem 2-wöchigen Tierexperiment, konnte ein schnellerer und stärkerer Anstieg der PAK gemessen werden und somit ein inhibitorischer Effekt des AT2R auf die Aldosteronproduktion ausgeschlossen werden.
Erhöhte Plasma-Prorenin- und Plasma-Aldosteron-Konzentrationen werden mit der Entwicklung kardialer Endorganschäden in Verbindung gebracht. Beim transgenen Cyp1a1ren-2 Tiermodell sind durch Variation des auf enteralem Wege verabreichten Prorenin-Transgen-Induktors Indol-3-Carbinol (I3C) die Prorenin-Sekretion und in der Folge die Aldosteron-Sekretion sowie die Höhe des Blutdrucks titrierbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die Hypertonie bei Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten (TGR) mit einer kardialen Fibrose bzw. Inflammation einhergeht. TGR und transgen-freie Fischer-F344-Ratten (F344) erhielten für zwei bzw. zwölf Wochen I3C (0,167 bzw. 0,125 %). Die Plasma-Prorenin-, -Renin-, und -Aldosteron-Konzentrationen wurden bestimmt. Im linken Ventrikel wurde mittels real-time RT-PCR der mRNA-Gehalt kardialer Marker für Hypertrophie und Fibrose (Transforming growth factor-ß1 [TGF-ß1], Endothelin-1 [ET1], Kollagen Typ 3 [Col3]), oxidativen Stress (funktionelle Untereinheit der Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat-Oxidase [gp91phox]), und Inflammation (Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 [ICAM1]) bestimmt. Außerdem wurde das Ventrikelgewebe histologisch untersucht. I3C-Gabe führte bei TGR zu einer moderaten kardialen Hypertrophie ohne histologische Anzeichen einer Fibrose oder Inflammation. Zweiwöchige I3C-Gabe führte bei TGR zu einem Anstieg der Plasma-Prorenin- (70-fach), und -Aldosteron- Konzentration (4,6-fach) sowie des kardialen mRNA-Gehaltes von Col3 und gp91phox. Bei zwölfwöchiger I3C-Gabe war die Plasma-Prorenin-Konzentration bei TGR sogar ca. 260-fach und die Plasma-Aldosteron-Konzentration ca. 4-fach gegenüber dem Ausgangswert erhöht. Beide Parameter blieben bis zum Ende der zwölfwöchigen Behandlung erhöht. Die Plasma- Renin-Konzentration war hingegen nach vier Wochen I3C auf ca. 25% des Ausgangwertes erniedrigt und blieb bis Versuchsende auf diesem Niveau. Der kardiale mRNA-Gehalt von TGF-ß1, ET1, gp91phox und ICAM1 war nach zwölfwöchiger I3C-Gabe bei TGR erhöht, während zwölfwöchige I3C-Gabe bei F344 zu einer Abnahme des kardialen mRNA-Gehaltes von ET1 und gp91phox führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein Hyperaldosteronsimus und eine bis zu 260- fach erhöhte Plasma-Prorenin-Konzentration bei TGR in einem Modell der chronischen, nicht-malignen arteriellen Hypertonie keine fibrotischen und inflammatorischen Veränderungen am linken Ventrikel erzeugen.
Die Nieren spielen in der Regulation des Blutdrucks eine sehr wichtige Rolle, da sie den Wasser- und Elektrolythaushalt kontrollieren und Schwankungen des Blutdrucks langfristig normalisieren können. Bei der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie wird häufig eine Funktionsstörung der Nieren beobachtet, insbesondere eine Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands. Die entsprechenden pathophysiologischen Prozesse sind noch nicht vollständig geklärt. Die Enzyme Rho-Kinase (ROCK) und NADPH-Oxidase (NOX) sind an vielen physiologischen Steuerungsprozessen des Organismus beteiligt, vor allem auch an der Regulation des Gefäßtonus. Sie wurden in mehreren experimentellen und klinischen Studien mit der Entstehung einer arteriellen Hypertonie in Verbindung gebracht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, inwiefern ROCK und NOX in der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie auf die Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands Einfluss nehmen. Die Untersuchungen wurden am Tiermodell der Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten durchgeführt, das es ermöglicht, durch Beigabe des Stoffes Indol-3-Carbinol zum Futter, eine AngII-abhängige Hypertonie zu induzieren. Die Tiere wurden in Gruppen mit unterschiedlich langer Induktionsphase und Induktionsdosis aufgeteilt, wodurch verschiedene Phasen der Hypertonieentwicklung beobachtet werden konnten. Anschließend wurden mit Nierengefäßen und Aortengewebe der Versuchstiere mehrere Experimente zur Aktivität der ROCK und NOX und deren Einfluss auf die Gefäßkontraktilität durchgeführt.
In den Nierengefäßen der induzierten Tiere konnte mittels PCR eine erhöhte Gen-Expression der NOX-Isoformen Nox1 und Nox2 nachgewiesen werden. Die Lucigenin verstärkte Chemilumineszenz ergab zudem Hinweise auf eine vermehrte NOX abhängige Superoxidbildung in den Nierengefäßen der hypertonen Tiere. Die Gen-Expression der ROCK-Isoformen war nach Induktion eines Bluthochdrucks nicht signifikant unterschiedlich. Auch die Aktivität der ROCK, die durch Western-Blot Versuche ermittelt wurde, zeigte keine Unterschiede. Zusätzlich wurde in einem Drahtmyographen die Gefäßantwort auf Phenylephrin ohne und mit Zugabe des ROCK-Inhibitors Y-27632 sowie ohne und mit Zugabe des Superoxid Radikalfängers Tiron gemessen. Auch wurde in einem Experiment die Gefäßantwort auf H2O2 untersucht. Diese Experimente ließen den Schluss zu, dass die ROCK bei den induzierten Tieren eine zunehmende Bedeutung in der Phenylephrin-induzierten Gefäßkontraktion renaler Widerstandsgefäße hatte, wohingegen radikale Sauerstoffspezies keinen veränderten Einfluss nach Induktion der Hypertonie zeigten. Im Rahmen dieser Arbeit war es zudem möglich, diese Untersuchungen zur Gefäßkontraktilität auch an humanen renalen Gefäßen durchzuführen, die nach Tumor bedingter Explantation aus einer Niere gewonnen wurden. Hierbei zeigte sich durch die ROCK-Hemmung auch eine signifikante Verringerung der Agonist-induzierten Kontraktion menschlicher Nierengefäße. Dies mag auf eine Übertragbarkeit der tierexperimentellen Ergebnisse auf die Vorgänge in der menschlichen Niere hinweisen.
Zusammenfassend haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROCK und NOX in unterschiedlicher Form einen Einfluss auf den renalen Gefäßwiderstand in der frühen Hypertonieentwicklung Cyp1a1ren-2 transgener Ratten haben. Dabei können auch Wechselwirkungen zwischen den Enzymen eine Rolle spielen, da mehrere andere Studien eine gegenseitige Aktivierung der ROCK und NOX beobachteten. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung der ROCK und NOX und ihrer Hemmstoffe mit dem Ziel der Entwicklung potenzieller neuer Medikamente, um die Therapie der Hypertonie weiter verbessern zu können.
Das sympathische Nervensystem ist an der Regulation des Herz-Kreislaufsystems beteiligt und beeinflusst die Struktur und Funktion von Widerstandsgefäßen. Die Arbeit untersucht chronische Effekte der sympathischen Innervation auf die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und deren Regulation des Gefäßtonus anhand des Modells der neonatalen Sympathektomie. Untersucht wurde Gewebe von 11-14 Wochen alten Wistar-Ratten. Es erfolgten pharmakologische und physiologische Untersuchungen isolierter mesenterialer und intrarenaler Widerstandsarteriensegmente sowie aortaler Gefäßsegmente mit Hilfe der Small-Vessel-Draht-Myographie sowie Untersuchungen zur vaskulären NADPH-Oxidase-mRNA-Expression und NADPH-Oxidaseaktivität mittels real-time-RT-PCR und Lucigenin-verstärkter Chemilumineszenz. Zur Beurteilung von Geschlechtsdi-morphismen hinsichtlich der untersuchten Prozesse wurden Tiere beider Geschlechter in die Studie einbezogen. Die Kalium-induzierte Vasokonstriktion zeigt sich durch chronische Sympathektomie bei mesenterialen Gefäßsegmenten erniedrigt, was auf geringeren Gehalt an kontraktilem Gewebe infolge der Sympathektomie hindeutet. Weitere Untersuchungen zeigten neben einer Noradrenalin-Supersensitivität renaler Gefäßsegmente chronisch sympathektomierter männlicher Tiere, an der sowohl Alpha1- wie auch Alpha2-Adrenorezeptor-vermittelte Prozesse beteiligt sind, auch eine Noradrenalin-Supersensitivität renaler Gefäßsegmente weiblicher Tiere und mesenterialer Gefäßsegmente, die unter anderem Alpha1-Adrenorezeptor, nicht aber Alpha2-Adrenorezeptor getragen ist. Die endothelvermittelte und endothelunabhängige Vasodilatation wurden unter Applikation von Acetylcholin und Nitroprussidnatrium untersucht und zeigte sich durch chronische Sympathektomie unbeeinflusst. Weitere Small-Vessel-Myographie-Experimente erfolgten zur Beurteilung der Bedeutung von ROS für die Modulation Agonist-induzierter Vasokonstriktion und -dilatation von Widerstandsarterien chronisch sympathektomierter Wistar-Ratten. Der Einsatz des Radikalfängers Tiron lässt jedoch keine allgemeingültigen Aussagen zur ROS-abhängigen Modulation der Gefäßfunktion zu. Lediglich bei renalen Gefäßsegmenten männlicher und mesenterialen Gefäßsegmenten weiblicher sympathektomierter Tiere schwächte sich nach Tirongabe bei erstgenannter Gruppe die maximale Kontraktionsantwort, bei zweitgenannter Gruppe die endothelunabhängige Vasodilatation leicht ab. Experimente zu Veränderungen des Gefäßtonus durch H2O2 zeigten sowohl eine direkte durch H2O2 ausgelöste Kontraktion, als auch die Verstärkung prokontraktiler Mechanismen durch H2O2, wobei die Empfindlichkeit der Gefäße gegenüber H2O2 nicht durch chronische Sympathektomie beeinflusst wurde. Die Untersuchungen zum Einfluss chronischer Sympathektomie auf die NADPH-Oxidaseaktivität zeigten weder an renalen, mesenterialen, noch aortalen Gefäßsegmenten unter Inhibierung anderer ROS-produzierender Systeme mit Rotenon, Allopurinol und L-NAME, Veränderungen in der NADPH-Oxidaseaktivität durch chronische Sympathektomie. Auch hatte chronische Denervierung keinen eindeutigen Einfluss auf die NADPH-Oxidase-Expression, lediglich der NOX2-mRNA-Gehalt intrarenaler Arteriensegmente weiblicher sympathektomierter Tiere war niedriger als der scheinbehandelter Kontrollen. Die differenzierte Betrachtung der Ergebnisse lässt zwischen beiden Geschlechtern bezüglich der Gefäßfunktion keine globalen Aussagen zu. Vergrößert, gegenüber der weiblichen Versuchsgruppe, war die Kalium-induzierte Vasokonstriktion mesenterialer Gefäßsegmente scheinsympathektomierter männlicher Tiere, vermindert die maximale Noradrenalin-induzierte Vasokonstriktion renaler Gefäßsegmente sympathektomierter männlicher Tiere im Vergleich zu weiblichen. Außerdem war die NADPH-Oxidase-abhängige Superoxidbildung in Aortengewebe männlicher Tiere und der NOX2-mRNA-Gehalt bei renalen Gefäßsegmenten scheinsympathektomierter männlicher gegenüber weiblicher Tiere verringert. Aus den Ergebnissen lassen sich Hinweise ableiten, dass chronisch sympath-ektomierte Tiere möglicherweise einen geringeren Gehalt an kontraktilem Gewebe der Gefäßmuskulatur aufweisen. Außerdem beruht die bekannte Noradrenalin-Supersensitivität chronisch denervierter renaler Gefäßsegmente männlicher Tiere, auf Alpha1- wie auch Alpha2-Adrenorezeptor-vermittelten Prozessen, die von chronisch denervierten renalen Gefäßen weiblicher Tiere und mesenterialen Gefäßen unter anderem auf Alpha2-, nicht aber auf Alpha1-Adrenorezeptoren-vermittelten Prozessen. Der eher diskrete Einfluss des Radikalfängers Tiron auf die Gefäßfunktion, der geringe, wenn überhaupt vorhandene Einfluss der Sympathektomie auf die Expression der NADPH-Oxidase-Isoformen und die fehlenden Effekte der Sympathektomie auf die NADPH-Oxidaseaktivität sprechen dafür, dass ROS-abhängige Prozesse, wenn überhaupt nur eine untergeordnete Bedeutung für die Denervierungssupersensitivität kleiner Widerstandsarterien haben.
Das Zusammenspiel von Transportproteinen in den Nieren, der Leber und im Intestinaltrakt ist notwendig für die effiziente Elimination von potentiell giftigen Metaboliten und die Erhaltung von essentiellen Metaboliten für den Organismus. Dabei spielen die Effluxmechanismen der Multidrug Resistance-related Proteine (Mrp) eine wichtige Rolle in der Absorption, Verteilung und Elimination von endogenen und xenobiotischen Substanzen. In den Epithelzellen des Nierentubulus sind Mrp2 (Abcc2) und Mrp4 (Abcc4) apikal exprimiert während sich Mrp3 (Abcc3) in der basolateralen Membran befindet. Die Rolle der Mrp-Transporter in der Regulation des zellulären Redoxstatus ist noch nicht aufgeklärt. Die systemische Mrp2-Defizienz induziert die mRNA-Expression antioxidativer Proteine in der Niere. Auch die Aktivität des sympathischen Nervensystems ist wichtig für die Nierenfunktion. Der Einfluss der renalen Innervation auf den Transport organischer Ionen ist bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Hypothese getestet werden, dass das sympathische Nervensystem einen Einfluss auf die Expression und Funktion der Mrp-Transporter hat. Zunächst sollte nach renaler Denervation von Lewisratten und kongenen Mrp2-defizienten Ratten die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 bestimmt werden. Weiterführend sollte als Modell für eine Nierenschädigung die 5/6-Nephrektomie nach drei bzw. sieben Wochen beschrieben und der Einfluss der renalen Denervation auf die Expression von Mrp2, Mrp3 und Mrp4 bestimmt werden. Ein anderer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Rolle von Mrp2 bei der zellulären Redoxregulation unter nephrotoxischen Bedingungen. Es wurde die Hypothese getestet, dass die renale Mrp2-Defizienz eine akute CsA-induzierte Nephrotoxizität verstärkt. Die kongene Transplantation von Mrp2-defizienten Nieren auf Wildtypempfänger (Lewisratten) erzeugte eine isolierte renale Mrp2-Defizienz. Als Kontrollen dienten syngene Transplantationen unter Lewisratten. Die Tiere wurden für eine Woche mit CsA in einer immunsuppressiv wirkenden Dosis bzw. einer zusätzlich nephrotoxisch wirkenden Dosis oder mit einer Placebodiät behandelt. Zur Überprüfung der Hypothesen wurde die Transporterfunktion durch Clearance-Messungen und die Transporterexpression durch Real-time PCR, Western blot und Immunhistologie untersucht. Darüber hinaus charakterisierte ein PCR-Array das nephrotoxisch-veränderte Expressionsmuster. Außerdem wurden Enzymaktivitäten durch Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz und fotometrische Enzymaktivitätsassays sowie die Glutathionkonzentration fotometrisch ermittelt. Die renale Denervation ohne Reduktion der Nierenmasse hatte keinen Einfluss auf die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 in der Niere. Die 5/6-Nephrektomie führte zu erhöhten Mrp2- und Mrp4-mRNA-Gehalten und zu einem reduzierten Mrp3-Proteingehalt im renalen Kortexgewebe. Durch zusätzliche renale Denervation bei 5/6-Nephrektomie war der mRNA-Gehalt von Mrp3 signifikant erhöht. Bei 5/6-Nephrektomie war nach drei Wochen ein erhöhter Glutathionquotient als Indikator für oxidativen Stress im Nierengewebe messbar, der durch die renale Denervation signifikant reduziert wurde. Sieben Wochen nach der Denervation bei 5/6-Nephrektomie war die Expression und Lokalisation der Mrp-Transporter nicht verändert. Des Weiteren war zu diesem Zeitpunkt der renale Gesamtglutathiongehalt unabhängig von der renalen Denervation reduziert. Nach sieben Wochen vermehrt auftretende Hydronephrosen im Nierenkortex lassen sich als ein histologisches Anzeichen für einen Nierenschaden deuten. Die durch CsA-Behandlung höheren mRNA-Gehalte der UDP-Glucuronosyltransferase 1a6 und der Glutathionperoxidase 2 waren im Falle einer nierenspezifischen Mrp2-Defizienz zusätzlich erhöht. Dieser Effekt und auch der durch Mrp2-Defizienz erhöhte mRNA-Gehalt des Cytochroms 1a1 weisen auf eine erhöhte metabolische und oxidative Belastung im Transplantatgewebe durch das Fehlen von Mrp2 bei CsA-induzierter Nephrotoxizität hin. Durch die Behandlung mit CsA trat dosisabhängig ein erhöhter Glutathionquotient im Transplantatgewebe auf. Die nierenspezifische Mrp2-Defizienz führte nicht zu einem signifikant erhöhten Glutathionquotienten. Eine mögliche funktionelle Redundanz anderer renaler Transporter wie Mdr1 könnte den Effekt der Mrp2-Defizienz limitieren. In dieser Arbeit konnte eine mit oxidativem Stress assoziierte Abhängigkeit des mRNA-Gehalts des basolateralen Transporters Mrp3 vom sympathischen Nervensystem unter Reduktion der Nierenmasse nachgewiesen werden. Außerdem verstärkt die renale Mrp2-Defizienz nicht die akute CsA-induzierte Nephrotoxizität, was möglicherweise auf eine kompensatorische Induktion der Glutathionperoxidase 2, der UDP-Glucuronosyl-transferase 1a6 oder des renalen Transporters Mdr1 zurückgeht.
Es wurden die Lokalisation des (P)RR/ATP6ap2 in PC12 Tumorzellen neuronalen Ursprungs, kardialen und renalen Zellen und Geweben sowie die funktionellen Folgen nach Downregulation oder Überexpression (paradoxe Downregulation) des Rezeptors untersucht. Er weist sowohl eine ER-spezifische, Membran-assoziierte als auch eine Lokalisation in der löslichen Fraktion auf.
Als akzessorische Untereinheit der vakuolären H+ ATPase beeinflusst der Rezeptor ihre Integrität und Aktivität. Die Vielzahl differenter Daten zwischen den mit einem V ATPase-Inhibitor behandelten und den (P)RR/ATP6ap2-downregulierten PC12 Zellen verdeutlicht, dass die Funktion des (P)RR/ATP6ap2 insbesondere im Metabolismus über eine bloße Regulation der V ATPase-Aktivität hinausgeht und möglicherweise durch die Integration des (P)RR/ATP6ap2 im Wnt-Pathway bestimmt wird.
Aufgrund ihres Einflusses auf das Membranpotenzial wird vaskulären Kaliumkanälen eine Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus und damit an der Blutdruckregulation zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Beitrag von Kaliumkanälen an der Gefäßtonusregulation in intrarenalen Widerstandsgefäßen der Ratte und des Menschen mittels Drahtmyographie untersucht. Zur Untersuchung der Expressionsrate der ATP abhängigen Kaliumkanäle wurden außerdem qPCR Experimente durchgeführt.
Die Myographieexperimente zeigten, dass die kombinierte Blockade der calciumabhängigen (BK , IK , SK ), spannungsabhängigen (Kv ), einwärts gleichrichtenden (Kir ) und ATP abhängigen (KATP ) Kaliumkanäle zu einem starken Anstieg des Gefäßtonus führte. Noradrenalin-induzierte Vasokonstriktionen wurden dadurch nicht verändert. L Typ Calciumkanalaktivator-induzierte Vasokonstriktionen wurden durch die Blockade der BK , IK und Kv Kanäle erleichtert, die cAMP abhängige Vasodilatation hingegen durch die Inhibition von Kv7 Kanälen vermindert. Die Öffnung der KATP Kanäle führte zu einer deutlichen Abschwächung der Noradrenalinantwort. Mittels qPCR-Analysen wurden die Untereinheiten Kir6.1 und SUR2B als die vorherrschenden Einheiten der KATP Kanäle im untersuchten Gefäßgebiet ausgemacht. Somit lässt sich schlussfolgern, dass Kaliumkanäle, vor allem KCa-, Kv- und KATP Kanäle, an der Aufrechterhaltung des Ruhetonus beziehungsweise an Tonusänderungen intrarenaler Arterien der Ratte und des Menschen beteiligt sind.
Der Phänotyp der glatten Gefäßmuskelzellen und darauf basierend die Gefäßeigenschaften hängen unter anderem von einer dauerhaften sympathischen Innervation ab. Nach Sympathektomie zeigen glatte Muskelzellen intrarenaler Rattenarterien ein depolarisiertes Membranpotenzial im Vergleich zu scheinsympathektomierten Kontrollen. In Myographieversuchen wurde sowohl für Gefäße systemisch sympathektomierter als auch lokal renal denervierter Tiere eine erhöhte Noradrenalinsensitivität im Vergleich zu Kontrollgefäßen beobachtet. Diese war unter hyperpolarisierten Bedingungen vermindert und ist folglich zum Teil auf ein verringertes Membranpotenzial zurückzuführen. Veränderungen in Bezug auf die Expressionsrate und Funktionalität der KATP Kanäle in den Gefäßen hingegen ergaben sich nicht, sodass die Auswirkungen der sympathischen Denervierung demzufolge nicht auf Veränderungen der KATP Kanäle beruhen.
Beim Typ-1 Diabetes handelt es sich um eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die auf dem Zusammenspiel genetischer, immunologischer und umweltbedingter Faktoren beruht. Hilfreich bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Genloci sind diverse Tiermodelle, bei denen durch Kreuzungsstudien kongene Linien mit spontanen Rekombinationen im Bereich diabetes-suszeptibler oder diabetes-resistenter Genloci entstehen. Ein „Produkt“ solcher Kreuzungen ist die homozygote BB.6S m Rattenlinie, die obwohl Träger der diabetogenen Iddm1 und Iddm2 Genloci, nur eine T1D-Inzidenz von 10 % aufwies. Ursache für den diabetes-protektive Effekt war der alleinige chromosomale Austausch des diabetogenen Iddm4 Bereiches auf Chromosomen 6 der BB/OK Ratte durch den einer männlichen, diabetes-resistenten SH Ratte. Innerhalb dieser Arbeit sollten daher folgende Fragestellungen geklärt werden. 1. Ist die Iddm4 vermittelte Reduktion der Diabetesinzidenz auf die Expression eines oder mehrere potentieller diabetes-protektiver Gene zurückzuführen? 2. Wird das T1D Risiko durch den in diesem Bereich liegenden Imprintinglokus Dlk1-Dio3 beeinflusst? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine zweite kongene Rattenlinie generiert. Die BB.6S f Linie, deren Iddm4 Genlocus von weiblichen SH Ratten abstammte, zeichnete sich wie die BB.6S m durch eine massive Reduktion der T1D Inzidenz aus. Nur 13 % der BB.6S f Ratten entwickelten einen T1D. Bei der Analyse der Expression von Strukturgenen konnten keine einheitlichen Muster zwischen BB.6S m und BB.6S f Ratten im Bezug zu BB/OK Ratten detektiert werden. Erst die Analyse des Expressionsmusters von mikroRNAs, deren Gene im Iddm4 Bereich und hier insbesondere im Dlk1-Dio3 Gencluster lokalisiert sind, ergaben sich Hinweise auf die mikroRNAs mir-337, mir-345 und mir-299 als potenzielle Kandidaten für einen T1D Schutz. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob die T1D Inzidenz durch genomische Prägung der Gene des Dlk1-Dio3 Imprintingclusters beeinflusst wird: So sind auf dem väterlich vererbten Allel unter anderem die Gene Dlk1, Rtl1 und Dio3 aktiviert, während bei mütterlicher Abstammung Gtl2 und mikroRNAs exprimiert werden. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden heterozygote F1 Hybride aus den Kreuzungen (BB/OK x BB.6S m) und (BB.6S m x BB/OK) generiert. Die phänotypischen Daten belegen, dass die heterozygoten Tiere in der Regel eine höhere T1D Inzidenz aufwiesen, die zusätzlich in Abhängigkeit vom Geschlecht der Nachkommen und dem Vererbungsmuster zwischen 21 und 74 % variierte. Generell waren weibliche Nachkommen besser vor einem T1D geschützt als männlichen Nachkommen. Außerdem zeigte sich, dass die T1D Inzidenz niedriger war, wenn das SHR Allels väterlicherseits vererbt wurde. Diese Sachverhalte deuten einerseits auf eine Interaktion des Iddm4 Bereichs von Chromosom 6 mit dem biallelischen X-Chromosom hin. Eine weitere Analyse der Dlk1 Expression belegt, dass es beim Fehlen des paternalen SHR Allels überraschenderweise zu einer biallelischen Expression des Dlk1 Genes kommt. Dieser Effekt ist assoziiert mit dem Verlust der Iddm4 vermittelten T1D Protektion. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen zusammenfassend drei Aussagen zu. I. Es konnte unter Einsatz der beiden kongenen BB.6S Rattenlinien kein Gen identifiziert werden, das den durch den Iddm4 Bereich der SH Ratte vermittelten Diabetesschutz bewirkt. II. Die Diabetesinzidenz wird offensichtlich durch Interaktion zwischen Chromosom 6 und dem biallelischen X-Chromosom beeinflusst. III. Hier konnte erstmals tierexperimentell bestätigt werden, dass die Manifestation eines T1D durch Imprinting geprägt wird.
Den Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit bilden Versuche, in denen bei spontan hypertensiven Ratten durch neonatale Sympathektomie eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorgerufen wurde. Durch Nierentransplantation und bilaterale Nephrektomie konnte diese Blutdrucksenkung auf bis dahin unbehandelte Empfängertiere übertragen werden. Der renale Gefäßwiderstand der sympathektomierten SHR war dabei im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrolltieren reduziert. Das Ziel der von uns durchgeführten Studie war es deshalb, mögliche Veränderungen in der Funktionsweise arterieller, renaler Widerstandsgefäße zu charakterisieren, die bei spontan hypertensiven Ratten an der Blutdrucksenkung durch neonatale Sympathektomie beteiligt sein können. Mit der Methode der Small-Vessel-Drahtmyographie wurde dazu das Konstriktions- und Dilatationsverhalten isolierter Segmente der distalen Interlobararterien ex vivo untersucht. Diese Gefäße entsprechen mit einem Durchmesser von etwa 150 µm den proximalen renalen Widerstandsarterien der spontan hypertensiven Ratten. Das Untersuchungsmaterial ist männlichen SHR im Alter von 12 Wochen entnommen worden. Die Tiere waren bis dahin einem von drei Vorbehandlungsschemata zugeordnet. Sie wurden entweder neonatal sympathektomiert, scheinsympathektomiert und mit Hydralazin antihypertensiv behandelt oder ausschließlich scheinsympathektomiert. Die entnommenen, isolierten Segmente der renalen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihrer Antwort auf die Depolarisation des Membranpotentials untersucht. Diese bestand in allen Vorbehandlungsgruppen aus einer Vasokonstriktion ähnlichen Ausmaßes. Kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die physiologischen Vasokonstriktoren Noradrenalin, Vasopressin und Endothelin-1 ergaben keine verminderte Reaktivität der distalen Interlobararterien nach Sympathektomie. Die Gefäßsegmente der sympathektomierten SHR verhielten sich supersensitiv gegenüber Noradrenalin und konstringierten nach Endothelin 1-Gabe stärker als die entsprechenden Gefäße der scheinbehandelten Tiere. Die Empfindlichkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion gegenüber extrazellulärem Kalzium war in der sympathektomierten Gruppe und bei den Kontrolltieren gleich groß. Auf die Aktivierung der L Typ-Kalziumkanäle mit S( ) BayK8644 reagierten die untersuchten Arterienabschnitte nach Sympathektomie und nach Hydralazin-Behandlung sensitiver als nach alleiniger Scheinbehandlung. Die endothelvermittelte, mit Acetylcholin ausgelöste Vasodilatation und die endothelunabhängige Relaxation der distalen Interlobararterien mit Nitroprussidnatrium zeigten bei den Tieren aller Vorbehandlungsgruppen ähnliche Ausmaße. Versuche mit L NAME und Indomethacin stehen im Einklang mit Befunden, die auf die Existenz eines endothelialen, Zyklooxygenase-abhängigen Konstriktionsfaktors und auf das Vorhandensein eines endothelialen, Zyklooxygenase- und Stickstoffmonoxidsynthase-unabhängigen relaxatierend wirkenden Faktors hindeuten. Die Wirkungen dieser Faktoren in den untersuchten Gefäßsegmenten der SHR wurden durch die neonatale Sympathektomie nicht beeinflusst. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die Senkung des renalen Gefäßwiderstandes nach neonataler Sympathektomie bei SHR wahrscheinlich nicht auf einer geringeren Reaktivität der distalen Interlobararterien gegenüber den untersuchten Vasokonstriktoren, nicht auf einer vergrößerten Fähigkeit dieser Gefäße zur Vasodilatation und nicht auf einem verminderten Einfluss extrazellulärer Kalziumionen auf die Vasokonstriktion beruht. In den durchgeführten Versuchen waren keine Veränderungen in der Funktion der proximalen renalen Widerstandsgefäße nachweisbar, die zur Erklärung der antihypertensiven Wirkung der Nierentransplantate sympathektomierter spontan hypertensiver Ratten herangezogen werden können.
Das Ziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Rolle des Renin Binding Proteins (RenBP) bei der kardioprotektiven Wirkung des zytosolischen Renins in H9c2 Zellen, die einer Glucosedepletion ausgesetzt waren.
Die Ergebnisse der Immunhistochemie ließen eine Kolokalisation beider Proteine nach Glucosedepletion erkennen. Mittels chemischen Detergenzien und Renin gelang im Nativen Western Blot die Unterscheidung zwischen RenBP Homodimer, Heterodimer und Monomer. Ein artifizieller ATP-Mangel durch Apyrase, ähnlich der Glucosedepletion, bewirkte eine Heterodimerbildung. Allerdings gelang mit dieser Methode kein Nachweis des endogenen zytosolischen Renins mit dem verwendeten Antikörper. Der Abfall der NAGE-Aktivität unter Überexpression des zytosolischen Renins und Glucosemangel in Zusammenhang mit den bisher erhobenen Ergebnissen konnte die initial vermutete Interaktion zwischen RenBP und zytosolischen Renin bestätigen.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob ein RenBP Knock down ähnliche Effekte ausübt, wie eine Interaktion zwischen RenBP und zytosolischem Renin. Der Knock down hatte keinen Einfluss auf die Nekroserate unter Kontrollbedingungen. Im Gegensatz zu den Kontrollzelllinien konnte bei Zellen mit einem milden RenBP Knock down ein weiterer Glucosedepletion-induzierter Anstieg der Nekroserate vermieden werden. Anhand dieser Daten schlussfolgern wir, dass unter Ischämie-relevanten Bedingungen, wie einer Glucosedepletion, die zytosolische Bildung von RenBP-Renin-Heterodimeren mit einer Zellprotektion assoziiert ist. Weitere Untersuchungen müssen nach kritischer Betrachtung dieser Erkenntnis zur Verifizierung folgen.
Insgesamt weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf die Notwendigkeit des RenBP beim zytoprotektiven Effekt des zytoslischen Renins in H9c2 Zellen hin. Neben der Suche anderer Interaktionspartner für das zytosolische Renin ist zudem die Klärung des Stellenwertes des RenBP im Zellmetabolismus mit Auswirkung auf Prozesse wie Sialisierung und Glykosylierung zukünftig notwendig.
Obwohl der Myokardinfarkt eine der häufigsten Todesursachen überhaupt ist, sind die zellulären und molekularbiologischen Pathogenesemechanismen und seine Therapiemöglichkeiten nicht ausreichend untersucht. Es ist bekannt, dass die Entzündungsreaktion für die Folgen eines Myokardinfarkts eine große Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde ein Modell zur näheren Untersuchung grundlegender intrazellulärer und interzellulärer Mechanismen dieser Entzündungsreaktion entworfen. Es wurde ein in vitro Kokultursystem zwischen mononukleären Zellen (MNC) und Kardiomyozyten (H9c2 Zellen) etabliert. Damit konnten nicht nur bisher unbekannte Zellmechanismen aufgezeigt, sondern auch ein Modell zum Screening neuer therapeutischer Substanzen im Rahmen eines Myokardinfarkts entwickelt werden. So können beispielsweise neue Wirkstoffe für den Patienten sicherer gestaltet werden. Dieses Modell wurde durch die Simulation vieler bereits in vivo beschriebener Befunde im Rahmen eines Myokardinfarkts verifiziert. Dazu zählen die Verstärkung der Expression von ICAM‑1 auf Herzzellen sowie eine Erhöhung von ICAM‑1 und LFA‑1α auf MNC. Diese Befunde konnten mit dem entwickelten in vitro Kokultur‑Modell in Bezug auf Lymphozytensubpopulationen differenziert werden. Zusätzlich wurden Aussagen über LFA‑1α speziell auf B- und T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen, über MHC Klasse I und II auf T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen und über den Aktivierungsgrad der T‑Lymphozytensubopulationen getroffen. Durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen kommt es zu Veränderungen von Oberflächenstrukturen auf beiden Zelltypen. Es kann von einem erhöhten Aktivierungszustand der MNC nach der Kokultur ausgegangen werden, da die Expressionsdichte von Aktivierungsmarkern (IL‑2 Rezeptoren, MHC Klasse II) auf MNC durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen erhöht war. Die verstärkte Expression von ICAM‑1, LFA‑1α, MHC Klasse I und MHC Klasse II auf H9c2 Zellen sowie die erhöhten prozentualen Anteile an CTL und T‑Helferzellen und die erhöhten Expressionen von LFA‑1α und ICAM‑1 auf MNC durch die Kokultur lassen auf eine Interaktion zwischen mononukleären Zellen und Kardiomyozyten schließen. Insbesondere die Ergebnisse aus den an den H9c2 Zellen adhärierten MNC verstärken diesen Aspekt. Es gibt verschiedene Interaktionsmöglichkeiten zwischen MNC und H9c2 Zellen. Einerseits ist die Rezeptorbindung zwischen LFA‑1α auf MNC oder H9c2 Zellen und ICAM‑1 auf Kardiomyozyten oder MNC wichtig, andererseits spielt die Rezeptorbindung über MHC Klasse I/CD8 beziehungsweise über MHC Klasse II/CD4 eine Rolle. Durch die Kokultur wurde die erhöhte Produktion und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und löslichen Mediatoren für TNF‑α, IL‑6 und NO gezeigt. Da H9c2 Zellen unter Kontrollbedingungen kein TNF‑α in das Kulturmedium freisetzten, wird deutlich, dass die gemessene erhöhte Menge an TNF‑α nach der Kokultur von MNC stammte. Andererseits konnte nicht geklärt werden, ob das erhöhte IL‑6 durch die MNC oder durch die H9c2 Zellen produziert wurde, da sowohl MNC als auch H9c2 Zellen in der Kultur unter Kontrollbedingungen geringe Mengen an IL‑6 freisetzten. Es muss davon ausgegangen werden, dass die erhöhte IL‑6 Konzentration aus der infolge der Kokultur vermehrten Produktion beider Zelltypen hervorgegangen ist. Aufgrund dessen, dass besonders IL‑6 für die Induktion der Expression von ICAM‑1 verantwortlich ist, scheint eine Signaltransduktion zwischen MNC und H9c2 Zellen von TNF‑α über IL‑6 und ICAM‑1 wahrscheinlich. H9c2 Zellen sowie MNC sezernieren unabhängig von der Kulturzeit eine geringe NO Menge, die durch die Kokultur gesteigert wurde. Durch eine längere Kokulturzeit wurde quantitativ nicht mehr NO sezerniert als bereits nach 24 Stunden, sodass geschlussfolgert werden kann, dass die NO Freisetzung besonders in der frühen Inflammationsphase eine Rolle spielt. Da IL‑6 erst verzögert nach 48 Stunden Kokultur verstärkt freigesetzt wird, TNF‑α aber bereits nach 24 Stunden ein Maximum im Kulturüberstand erreichte, wird die Induktion der NO Freisetzung eher auf TNF‑α oder andere proinflammatorische Zytokine, nicht aber auf IL‑6 zurückzuführen sein. Es ist nicht bekannt, ob NO durch IL‑6 induziert werden kann. Mit Hilfe durchflusszytometrischer und molekularbiologischer Auswertung konnte ein lokales RAS in den MNC nachgewiesen werden. In der mRNA Analyse wurden sowohl AT1AR als auch AT1BR detektiert. Ebenso wurde in den MNC der F344 Ratten mRNA für Angiotensinogen, AT2 Rezeptoren, ACE, Renin und Exon 1A Renin nachgewiesen. Renin, AOGEN und ACE von sMNC, die mit Hilfe einer quantitativen PCR untersucht wurden, werden durch die Kokultur von MNC und H9c2 Zellen signifikant vermindert. Der Anteil AT1R positiver Zellen verminderte sich durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen und die AT2 Rezeptordichte auf sMNC und speziell auf T‑Lymphozyten erhöht sich. Jedoch spiegelt die Kokultur nicht in allen Parametern die Aktivierung des lokalen RAS innerhalb der nicht adhärierten MNC wieder. Die adhärierten MNC waren für die PCR Untersuchung nicht zugänglich. Es bleibt offen, inwieweit es zur Aktivierung des lokalen RAS in MNC durch die Kokultur kommt. Da sowohl sMNC als auch PBMC über alle RAS-Komponenten zur Generierung von ANG II verfügen, kann geschlussfolgert werden, dass sie ein lokales Renin‑Angiotensin‑System besitzen. Es können durch die Kokultur bedingte Veränderungen hinsichtlich der Oberflächenexpression einiger Strukturen durch den Einsatz von spezifischen Hemmstoffen des RAS vermindert oder aufgehoben werden. Dieser Effekt ist ein Indikator dafür, dass das lokale RAS in der Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen eine wichtige Rolle spielt. Beispielsweise verminderte der AT1 Rezeptorblocker DUP753 signifikant den prozentualen Anteil an LFA‑1α und ICAM‑1 exprimierenden T‑Lymphozyten. Zusätzlich kam es zur Verminderung der Dichte von MHC Klasse II Oberflächenmolekülen auf T‑Lymphozyten und der IL‑2 Rezeptordichte auf CTL gegenüber den ohne Inhibitor kokultivierten Zellen. Diese Befunde lassen auf einen geringeren Aktivitätszustand der MNC und auf eine schwächere Interaktion zwischen MNC und H9c2 Zellen durch Behandlung mit einem AT1 Rezeptorblocker schließen. Dies ist ein Indiz dafür, dass das lokale RAS der MNC in der Kokultur von MNC und H9c2 Zellen aktiviert wird. Im Gegensatz dazu lässt sich die durch die Kokultur bei H9c2 Zellen induzierte Apoptose und Nekrose durch AT1R und AT2R Blockade nicht verhindern. Dieses Modell ist geeignet, zelluläre und molekulare Prozesse des Myokardinfarkts zu simulieren. Es könnte künftig ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelscreenings der Herzinfarkttherapie darstellen und als Grundlage für weitere Studien in der Behandlung des Myokardinfarktes dienen. Zur Optimierung dieses Modells sollte eine Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die adhärierten MNC von den H9c2 Zellen zu trennen, um sie molekularbiologisch untersuchen zu können.
Fokus der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation des Aldosterons durch kaliumreiche Diät in Assoziation mit Expression und Funktion des AT2R in der NNR zu analysieren. Es wurde nachgewiesen, dass eine Renin-unabhängige Stimulation der Aldosteronsynthese durch die HKD in verschiedenen Tierstämmen (Sprague Dawley und transgene CxmAT2R- Ratten der Linie 235) mit Erhöhung der Expressionen des AT2R und der Proteinkinase p85α einhergehen. Die Ergebnisse über TASK-3 stellen die bisher publizierten Befunde in Frage, sodass eine abschließende Beurteilung der Lokalisation und Regulation offen bleiben muss. Wie erwartet, kam es nach Kaliumbelastung in allen untersuchten Tierstämmen zur Erhöhung der gemessenen Plasmakonzentration für Aldosteron bei annähernd gleichbleibenden Plasmareninkonzentrationen. Dieser Effekt konnte durch mRNA- Untersuchungen in der ISH bestätigt werden. Die relativen Expressionen des AT2R in der NNR ergaben für die SD und WT- Tiere signifikante Anstiege. Da die TGR des zweiten Experiments bereits eine basale Überexpression des AT2R aufwiesen, war hier keine weitere Stimulation des AT2R mehr zu verzeichnen. Die Bedeutung von Differenzierungsprozessen/ Steigerung der Proteinbiosynthese wird durch die nachgewiesene Stimulation der relativen Expression von p85α in beiden Experimenten nahegelegt. Weitere Ziele der Arbeit waren Untersuchungen zur Lokalisation des TASK-3- Kanals in der NN. Analog zur bekannten AS- Sequenz von TASK-3 wurden codierende Abschnitte mit geringer Homologie zu anderen Kaliumkanälen gewählt. Dabei konnte unabhängig von der Diät spezifische cDNA sowohl aus NNR und NNM amplifiziert werden. Auch in der ISH konnte TASK-3 im Bereich der ZG, ZF und in geringem Maße auch in weiter innen liegenden Schichten gefunden werden, sodass die Richtigkeit der bisher zu TASK-3 veröffentlichten Daten angezweifelt werden muss. Auf Proteinebene (IHC) zeigte sich eine kräftige Färbung im NNM sowie nur einzelne, gefärbte Zellnester ohne Zuordnung zu ZF bzw. ZG. Die Daten weisen darauf hin, dass TASK-3 in unterschiedlichem Maße in der gesamten Nebenniere exprimiert wird und die Regulation der relativen Expression nicht eindeutig durch Kalium reguliert oder funktionell mit dem AT2- Rezeptor assoziiert ist. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten betonen die Bedeutung der Regulation des RAAS durch kaliumreiche Diät für die Aldosteronproduktion und dessen funktionellen Zusammenhang mit Expressionen verschiedener Rezeptoren der Nebenniere. Von besonderem Interesse wird in zukünftigen Untersuchungen sein, inwieweit es Interaktionen zwischen AT2R, p85α, weiteren Adapterproteinen und den hyperpolarisierenden Kaliumkanälen auf intrazellulärer Signalebene sowie Liganden-abhängigen Signaltransduktionswegen gibt. Auch sollte der Einfluss lokaler Renin- Angiotensin- Systeme auf die Homöostase bei systemischer Applikation von Rezeptorantagonisten und –agonisten weiter untersucht werden. Das transgene CxmAT2R- Modell oder auch die Verwendung des kürzlich neu entwickelten AT2- Rezeptoragonisten (Compound 21) könnten in diesem Zusammenhang zu aufschlussreichen Erkenntnissen führen.
Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems
(2011)
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diätetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten Größenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der Veränderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugeführten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte Veränderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von Prä-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und Präzisierung der gefundenen Veränderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere Präparation des Nierenmarks in äußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der Salzdiät beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine Niedrigsalzdiät von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von Prä-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterführenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der äußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer Ausprägung (Prä-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese Diäteffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollständig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medulläre Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate Veränderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten Veränderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei Prä-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der äußeren Medulla unter Niedrigsalzdiät. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
In früheren Studien gelang der Nachweis der Expression eines alternativen Renin-Transkripts im kardialen Gewebe, dessen Konzentration nach Eintritt eines Herzinfarktes deutlich anstieg. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Funktionalität dieses alternativen Renin-Transkripts, mit besonderem Augenmerk auf den Einfluss des Renins hinsichtlich Wachstum und Metabolismus von Herzzellen. In Abhängigkeit vom jeweiligen Promotor des kardialen Renin-Gens enstehen zum einen das sekretorische Exon(1-9)Renin und zum anderen das nicht sekretorische Exon(2-9)Renin, welches zytosolisch gebildet und in der mitochondrialen Fraktion gespeichert wird. Die funktionellen Bedeutungen des nicht-sekretorischen Renins sind bisher nicht gesichert. Aus früheren Beobachtungen ist jedoch bekannt, dass nach einer kardialen Ischämie die Konzentrationen der nicht-sekretorischen Renin-Transkripte erhöht sind und somit hypothetisch von einem Einfluss auf postischämische Prozesse ausgegangen werden kann. Zur Untersuchung dieser Hypothese etablierten wir mittels der H9c2-Zelllinie ein geeignetes Zellmodell, welches uns durch Überexpression der Exon(1A-9)Renin-, Exon(2-9)Renin-bzw. Exon(1-9)Renin-Transkripte die Möglichkeit gab, funktionelle Besonderheiten der Prorenine auf Rattenherzzellen zu untersuchen. Dabei konnte eindrucksvoll belegt werden, dass die unterschiedliche Lokalisation der Prorenine die Funktionalität der Kardiomyoblasten massgeblich beeinflusst. So führte die Exon(1-9)Renin-Überexpression zu Veränderungen der metabolischen Aktivität, Hypertrophie und Nekrose. Im Gegensatz dazu kam es bei der Exon(2-9)Renin-Überexpression eher zum Schutz vor Nekroseprozessen. Die beobachteten Effekte lassen sich dabei sowohl bei den Exon(2-9)Renin- als auch bei den Exon(1-9)Renin-transfizierten Zellen auf eine direkte, ANG II-unabhängige Wirkung zurückführen. Das sekretorische Prorenin kann zweifelsfrei pro-inflammatorisch, pro-apoptotisch, pronekrotisch und damit schädigend wirken. Die vorliegende Arbeit weist jedoch nach, dass vom selben Renin-Gen, welches für dieses sekretorische Prorenin kodiert, ein zweites Transkript abgelesen wird, dessen Exon(2-9)Renin intrazellulär verbleibt und antinekrotisch (und damit protektiv) wirkt.