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The human pathogen Clostridioides difficile has evolved into the leading cause of nosocomial diarrhea. The bacterium is capable of spore formation, which even allows survival of antibiotic treatment. Although C. difficile features an anaerobic lifestyle, we determined a remarkably high oxygen tolerance of the laboratory reference strain 630Δerm. A mutation of a single nucleotide (single nucleotide polymorphism [SNP]) in the DNA sequence (A to G) of the gene encoding the regulatory protein PerR results in an amino acid substitution (Thr to Ala) in one of the helices of the helix-turn-helix DNA binding domain of this transcriptional repressor in C. difficile 630Δerm. PerR is a sensor protein for hydrogen peroxide and controls the expression of genes involved in the oxidative stress response. We show that PerR of C. difficile 630Δerm has lost its ability to bind the promoter region of PerR-controlled genes. This results in a constitutive derepression of genes encoding oxidative stress proteins such as a rubrerythrin (rbr1) whose mRNA abundance under anaerobic conditions was increased by a factor of about 7 compared to its parental strain C. difficile 630. Rubrerythrin repression in strain 630Δerm could be restored by the introduction of PerR from strain 630. The permanent oxidative stress response of C. difficile 630Δerm observed here should be considered in physiological and pathophysiological investigations based on this widely used model strain.
IMPORTANCE The intestinal pathogen Clostridioides difficile is one of the major challenges in medical facilities nowadays. In order to better combat the bacterium, detailed knowledge of its physiology is mandatory. C. difficile strain 630Δerm was generated in a laboratory from the patient-isolated strain C. difficile 630 and represents a reference strain for many researchers in the field, serving as the basis for the construction of insertional gene knockout mutants. In our work, we demonstrate that this strain is characterized by an uncontrolled oxidative stress response as a result of a single-base-pair substitution in the sequence of a transcriptional regulator. C. difficile researchers working with model strain 630Δerm should be aware of this permanent stress response.
Numerous signalling pathways orchestrate the development, the functions, and the survival of cells, mostly in response to external stimuli. An overwhelming amount of data supports the concept of specific, spatio-temporal redox signalling pathways that affect the redox state of protein cysteinyl side chains and thus the biological function of these proteins. Glutaredoxins (Grxs) and thioredoxins (Trxs) catalyse reversible thiol-disulphide exchange reactions. The cytosolic Grx2 isoform Grx2c is essential for brain development and axonal outgrowth. A reversible dithiol-disulphide switch of CRMP2 has been identified as one of the major targets regulated by Grx2c. This CRMP2 redox switch is toggled in neuronal differentiation. Reduction of CRMP2 thiols induces profound conformational changes, modifying interactions and downstream elements of this redox switch. In [article I] and [manuscript V], we identified the Cys504 of CRMP2 to be the redox regulated residue. We used various in vitro assays with recombinant protein and molecular dynamics simulations to characterise the conformational change. The changes involve the solvent accessible surface area of at least one known phosphorylation site at the C-terminus of the protein. In [article III], we analysed the function of Grx2 and Trx1 in a model for perinatal asphyxia. Trx family proteins exhibit a very complex, cell-type and tissue specific expression pattern following hypoxia/ischemia and reoxygenation, especially Trx1 and Grx2. The results imply the clinical relevance for both proteins in perinatal asphyxia as well as many other neurological disorders. In agreement with the results presented in [articleI], Grx2 may be required for the re-establishment of neuronal integrity and connectivity. Cell shape, all forms of intracellular transport, and cell movement depend on the cytoskeleton, particularly on the fine tuned complex regulation of the dynamic re-arrangement of actin filaments and microtubules. In [article IV], we discuss the redox regulation of this dynamic cytoskeletal remodelling. Taking recent discoveries into account, we focus on redox signalling mechanisms, e.g. reversible thiol and methionyl switches. These switches are specifically controlled by enzymes such as Trx1 and Grx2c, for instance, and not the result of random modification by unspecific oxidants. Methionyl sulphoxidation of actin can be reversed by methionyl sulphoxide reductase (MsrA), promoting actin polymerisation. Human cells express two different Msr enzymes (MsrA and MsrB), that can reduce S- and R-methionyl sulphoxide, respectively. In the gram-positive Streptococcus pneumoniae, on the other hand, both Msr genes and thus enzymes were fused during evolution. In [article II], we characterised the surface-exposed thioredoxin family lipoproteins Etrx1 and 2 and regulators of this Msr (SpMsrAB). A loss of function of both Etrx proteins or SpMsrAB dramatically reduced pneumococcal virulence, enhanced the bacterial uptake by macrophages, and accelerated pneumococcal killing by H2O2 or free methionine sulphoxide. Identification and characterisation of components of this redox regulated system may contribute to the design of new antimicrobials. In [manuscript VI], we investigated the effects of Grx2c expression on cell morphology, migration, and invasion behaviour of cancer cells. Grx2c expressing cancer cells developed dramatic changes in phenotype, including alterations in cytoskeletal dynamics and significantly increased motility and invasiveness. We used quantitative proteomics and phopshoproteomic approaches to characterise the underlying mechanisms. Proteins and pathways regulating cytoskeletal dynamics, cell adhesion, and receptor-mediated signal transduction were detected to be specifically altered. We started a clinical pilot study with patients suffering from clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). Grx2c was expressed with significantly higher frequency in ccRCC compared to healthy kidney tissue, associated with a strong trend for locally more advanced tumour stages and a clear tendency for a decreased cancer-specific survival, compared to patients without detectable Grx2c. These results were supported by data from "The Cancer Genome Atlas". In synopsis, the results presented and discussed in these articles and manuscripts, support the concept of specific redox signalling in different models and model organisms. They also demonstrate the importance of the specific redox control of signalling pathways that, in the case of errors or misinterpretations, contribute to pathophysiological alterations. The regulation of the CRMP2 redox switch by Grx2c, for instance, is physiologically essential for brain development, but might lead to cancer progression, if "switched on" in adult tissue. Identification of further interaction partners as well as the development of compounds modulating this redox switch and CRMP2s conformations, will be part of our future research.
Background: Abdominal obesity is a major driver for adverse medical conditions. While an interaction between adipose tissue and thyroid function is thought to exist, to our knowledge, no study has examined the effect of thyroid-stimulating hormone (TSH) on visceral adipose tissue (VAT) in a population-based context. Objective: We determined an association between serum TSH levels and VAT. Methods: A sample of 1,021 female and 956 male adults aged 20-79 years was drawn from registry offices in the cross-sectional, population-based Study of Health in Pomerania Trend (SHIP Trend) in Northeast Germany from 2008 to 2012. Our main exposure was serum TSH levels. Our main outcome was VAT measured using magnetic resonance imaging. The possibly mediating role of leptin on the TSH-VAT association was also assessed. Results: A total of 1,719 participants (87.9%) had serum TSH levels within the reference range. The mean volume of VAT was 5.33 liters for men and 2.83 liters for women. No association between TSH and VAT (β = 0.06, 95% CI: -0.02, 0.14) was observed, and there were no differences detected between sexes. VAT was strongly associated with leptin with a greater effect in women than in men. Leptin was strongly associated with TSH. Conclusions: No association between TSH and VAT was observed. Other biomarkers such as leptin may play a role in the relationship between thyroid function and metabolic risk.
Im Rahmen der Karlsburger Typ-1-Diabetes-Risikostudie wurden 11.986 Schulkinder in einem kombinierten Screening auf die diabetes-assoziierten Autoantikörper (AAk) GADA, IAA und IA-2A mittels Radioliganden-Bindungsassays untersucht, AAk-positive Probanden HLA-DQB1 genotypisiert und hinsichtlich der Entwicklung eines Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) über fast 20 Jahre beobachtet. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass ein Screening auf diese biochemisch definierten AAk das T1DM-Risiko in der Allgemeinbevölkerung ebenso gut differenzieren kann, wie dies bereits in anderen Studien bei Probanden mit einer genetischen Prädisposition beschrieben wurde. Die starke positive Assoziation der AAk mit immungenetischen diabetes-assoziierten Risikomarkern (HLA-DQB1*0302 und/oder *02) konnte in der vorliegenden Studie auch für die Allgemeinbevölkerung bestätigt werden. Positivität für multiple diabetes-assoziierte AAk hatte das größte kumulative T1DM-Risiko und ist vergleichbar mit Ergebnissen von Studien bei erstgradigen Verwandten. Die Ergebnisse konnten außerdem zeigen, dass Studien, welche Probanden aufgrund genetischer Vorselektion rekrutierten, eine substantielle Anzahl der im Rahmen der Karlsburger Typ-1-Diabetes-Risikostudie manifestierten Kinder übersehen hätten. Diabetes-assoziierte HLA-DQB1-Allele hatten zwar eine hohe Sensitivität, aber nur eine geringe Spezifität zur Identifizierung von späteren Diabetikern in dieser Kohorte. Das AAk-Screening mit Nachweis von multipler AAk-Positivität war somit mit hoher Sensitivität und Spezifität zur Identifizierung von Diabetikern der Analyse der HLA-DQB1-Risikoallele bei AAk-positiven Probanden überlegen. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass ein kombiniertes Populationsscreening auf die diabetes-assoziierten Autoantikörper geeignet ist, um Probanden aus der Allgemeinbevölkerung mit höchstem T1DM-Risiko für Präventionsprogramme zu identifizieren. Dies könnte, sobald sichere und effektive Strategien zur Prävention des T1DM zur Verfügung stehen, zum Beispiel im Rahmen der gesetzlichen Vorsorgeuntersuchungen im Kleinkindalter flächendeckend realisiert werden.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, mittels RP (rapid pacing) in vitro bzw. RAP (rapid atrial pacing) in vivo die Bedeutung der miRNAs-1 und -328 für Remodeling-Vorgänge bei Vorhofflimmern zu untersuchen. Von Interesse ist dabei einerseits die Bestimmung des zeitabhängigen Expressionsniveaus der miRNAs unter RP, während andererseits die Auswirkungen ihres funktionellen „knock-down“ auf das Protein-Expressionsmuster von Kardiomyozyten untersucht werden. Für die geplanten Analysen (RT-qPCR, 2-D-Gelelektrophorese) solletn primäre Schweine- und Mauskardiomyozyten sowie die murine HL-1-Kardiomyozytenlinie als Modelle dienen. Im Zentrum der Untersuchungen stehen dabei akut eintretende Veränderungen, da diese für den pathophysiologischen Übergang in die persistierende Rhythmusstörung relevant sind, aber aufgrund der möglichen reversiblen Natur interessante therapeutische Optionen eröffnen könnten. Aufbauend auf die bereits gewonnenen Erkenntnisse in der Literatur soll diese Arbeit einen Beitrag für das Verständnis von atrialen Remodeling-Prozessen leisten, die das Vorhofflimmern zu einer chronischen Krankheit mit erheblichen Komplikationen machen.
Type I interferonopathies cover a phenotypically heterogeneous group of rare genetic diseases including the recently described proteasome-associated autoinflammatory syndromes (PRAAS). By definition, PRAAS are caused by inherited and/or de novo loss-of-function mutations in genes encoding proteasome subunits such as PSMB8, PSMB9, PSMB7, PSMA3, or proteasome assembly factors including POMP and PSMG2, respectively. Disruption of any of these subunits results in perturbed intracellular protein homeostasis including accumulation of ubiquitinated proteins which is accompanied by a type I interferon (IFN) signature. The observation that, similarly to pathogens, proteasome dysfunctions are potent type I IFN inducers is quite unexpected and, up to now, the underlying molecular mechanisms of this process remain largely unknown. One promising candidate for triggering type I IFN under sterile conditions is the unfolded protein response (UPR) which is typically initiated in response to an accumulation of unfolded and/or misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) (also referred to as ER stress). The recent observation that the UPR is engaged in subjects carrying POMP mutations strongly suggests its possible implication in the cause-and- effect relationship between proteasome impairment and interferonopathy onset. The purpose of this present review is therefore to discuss the possible role of the UPR in the pathogenesis of PRAAS. We will particularly focus on pathways initiated by the four ER-membrane proteins ATF6, PERK, IRE1-a, and TCF11/Nrf1 which undergo activation under proteasome inhibition. An overview of the current understanding of the mechanisms and potential cross-talk between the UPR and inflammatory signaling casacades is provided to convey a more integrated picture of the pathophysiology of PRAAS and shed light on potential biomarkers and therapeutic targets.
Glutaredoxine (Grxs) gehören zur Enzymgruppe der Oxidoreduktasen und sind Teil der Thioredoxin-Familie. Grxs katalysieren die reversible (De-)Glutathionylierung von Proteinen und die Reduktion von Protein-Disulfiden. Diese Aktivitäten sind entscheidend für diverse redoxvermittelte Signaltransduktionsprozesse in den verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Zudem werden sie im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen und der Krebsentstehung und -progression gesehen. Säugetiergenome kodieren vier Grxs (Grx1, Grx2, Grx3 und Grx5) mit zytosolischer, nukleärer oder mitochondrieller Lokalisation. Von humanem Grx2 wurden bisher drei Isoformen charakterisiert. Das mitochondrielle Grx2a wird ubiquitär exprimiert, während die nukleären und zytosolischen Isoformen Grx2b und Grx2c ein Vorkommen in Testes und Krebszellen aufweisen. Grx2c ist an der Aussprossung von Axonen beteiligt und daher entscheidend für die Hirnentwicklung. Die Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen führt zu einem elongierten Phänotyp mit filopodienartigen Ausläufern, der in vorangegangenen Studien gut beschrieben wurde. Als potentielles Ziel der Grx2c-Wirkung wurde das Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) identifiziert. In der Tat konnte ein Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 ermittelt werden. Grx2c wurde als spezifische Reduktase identifiziert, während MICALs (molecule(s) interacting with CasL) als potentielle Oxidasen dieses Schalters vermutet werden. Basierend auf diesen vorangegangenen Ergebnissen erarbeiteten wir die Hypothese, dass der Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 die Interaktion des Proteins mit Regulatoren der Aktinpolymerisation und -verzweigung (das heißt Sra1/Cyfip1 und wave regulatory complex) kontrolliert und dadurch die Dynamik des Zytoskeletts beeinflusst. Hauptsächliches Ziel der Arbeit war die Überprüfung dieser Hypothese. Besonders die Protein-Protein-Interaktionen und deren Abhängigkeit vom CRMP2-Redoxstatus sollten untersucht werden. Unter Verwendung von HeLa-Zellen und Grx2c-exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-Grx2c-Zellen) konnte mittels Immunopräzipitation und unter Verwendung quervernetzender Substanzen keine direkte Interaktion zwischen Sra1/Cyfip1 und CRMP2 festgestellt werden. Es zeigte sich jedoch eine Co-Immunopräzipitation von Sra1/Cyfip1 und MICAL2, was für eine direkte Interaktion der beiden Proteine spricht. Des Weiteren fanden sich bei Betrachtung von Bandenmustern nach in vivo Quervernetzung Anhaltspunkte für eine indirekte Interaktion von CRMP2 und MICAL2. Die Auswertung von Western Blots ergab teils deutliche kompensatorische Änderungen im Expressionsmuster der untersuchten Proteine bei Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen. So kam es zur Erhöhung der Sra1- und Beta-Aktin-Menge, während sich die MICAL2-Menge in der Zelle verringerte. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse wurde ein neues Modell erstellt, welches auf einer indirekten Interaktion von CRMP2, MICAL2 und Sra1/Cyfip1 via Plexin A (Teil des Semaphorin3A-Rezeptors) beruht. In diesem Modell wirken MICAL2 über Oxidation und Grx2c über Reduktion von CRMP2, was zu konformationellen Änderungen des CRMP2s führt. Die oxidierte, geschlossene Konformation inhibiert Sra1 über Bindung an MICAL2, während die reduzierte, offenere Konformation zu einer Freigabe und Aktivierung von Sra1 führt und letztendlich in der Aktinpolymerisation und -verzweigung mündet. Dieser Mechanismus hat eine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese verschiedenster Krebserkrankungen und neurodegenerativer Erkrankungen. Die weitere Beleuchtung der Rolle des Redoxschalters in CRMP2 und die genaue Kenntnis dessen Involvierung in spezifische Signalwege wie der Sema3A-Signalkaskade, basierend auf dem neu erstellten Modell, könnten zukünftig bei der Verwirklichung gezielter pharmakologischer Therapien gegen Krebserkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen eingesetzt werden.
Zusammenfassung:
Zielstellung dieser Arbeit war es, den Einfluss von „lone atrial fibrillation“ auf die extrazelluläre und intrazelluläre Signaltransduktion des TGF-beta1-Signalweges zu untersuchen. Dazu wurde das Modell des „acute rapid pacing“ unter Verwendung muriner HL-1-Zellen genutzt. Weiterhin wurde die Einflussnahme von Irbesartan auf die festgestellten Veränderungen geprüft.
„Acute rapid pacing“ führte zu einer erhöhten mRNA-Expression profibrotischer Faktoren wie CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Marker für kardiale Schädigung wie MSTN und FSTL3 zeigten ebenfalls eine Erhöhung des mRNA-Gehaltes nach „acute rapid pacing“. Kardial protektive Faktoren wie FSTL1 fanden sich im mRNA-Gehalt dagegen erniedrigt. Auf Proteinebene zeigte sich eine Mehrexpression des Stressmarkers GSK. Die Verwendung von Irbesartan beim „acute rapid pacing“ führte zu einer Reduktion der elevierten mRNA-Gehalte der profibrotischen Faktoren CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Gleichfalls sank durch Irbesartan der erhöhte mRNA-Gehalt der kardialen Schädigungsmarker MSTN und FSTL3. Auf den mRNA-Gehalt des kardioprotektiven FSTL1 hatte Irbesartan keinen bedeutenden Einfluss. Auf Proteinebene konnte eine Minderexpression des Stressmarkers GSK festgestellt werden, wenn „rapidly paced“ Zellen mit Irbesartan inkubiert worden waren. Für andere untersuchte, mutmaßliche Modifikatoren wie Endoglin und FSTL5 lassen sich keine relevanten Aussagen ableiten.
In Bezug auf den weiteren Signalweg sprechen die Ergebnisse der mRNA-Werte von ALK1 (Acvrl1), ALK2 (Acvr1) und ALK5 (Tgfbr1) nach „acute rapid pacing“ für eine Aktivierung des Phospho-Smad-1/-5/-8-Schenkels. Die Ergebnisse der Proteinexpression von Phospho-Smad-1/-5/-8 und phospho-Smad-2 nach „acute rapid pacing“ bzw. Inkubation mit TGF-beta1 stützen diese These.
Tgfbr2-mRNA konnte in HL-1-Zellen wiederholt nicht nachgewiesen werden, wurde jedoch in Kardiozyten von Mus musculus detektiert. Dies spricht für relevante Unterschiede im kanonischen TGF-beta-Signalweg zwischen HL-1-Zellen und nativem Mausgewebe.
Die untersuchten Zielgene des TGF-beta-Signalwegs – ID1, ID2 und ID3 – zeigten in Bezug auf ihre mRNA nach „acute rapid pacing“ ein differenziertes Verhalten mit Anstieg von ID1 und Absenkung von ID2 und ID3, was zum Prozess eines Remodelings passt. Irbesartan führte in Bezug auf die mRNA der genannten Zielgene nach „acute rapid pacing“ zu keiner signifikanten Änderung.
Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste Herzrhythmusstörung im Erwachsenenalter. In den kommenden Jahren und Jahrzehnten werden die Prävalenz und Inzidenz von Vorhofflimmern weiter zunehmen. Die VHF-assoziierten Pathomechanismen sind nicht vollständig geklärt. Derzeitige Therapieansätze sind oft nur zeitlich begrenzt wirksam, mit starken Nebenwirkungen behaftet und können aktuelle Beschwerden der Patienten zwar eindämmen, ein Fortschreiten der Krankheit aber nicht aufhalten. Daher ist es notwendig, weitere Untersuchungen auf Ebene der Zellregulation und Zellkommunikation zu fördern, um das Wissen über Entwicklung, Progression und Reversibilität von VHF-assoziierten Remodeling-Prozessen zu erweitern und neue therapeutische Interventionspunkte zu identifizieren.
VHF-induzierte atriale Remodeling-Prozesse werden maßgeblich und zum Teil ursächlich durch reversible Veränderungen der Protein-Phosphorylierung verursacht. In vorherigen Arbeiten des Labors konnten bereits im Rahmen von Phosphoproteom-Analysen Proteine in HL-1 Zellen detektiert werden, die nach Rapid Pacing (RP) auffällig differentiell reguliert waren. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Analyse und Verifizierung dieser Proteine nach kontinuierlichem und Intervall-RP von HL-1 Zellen auf mRNA- und Proteinebene. Der Vergleich der im HL-1-Modell erhaltenen Daten mit denen, die aus atrialem Gewebe von Patienten in SR und VHF gewonnen wurden, soll Rückschlüsse auf klinisch und therapeutisch potenziell relevante Signalwege und Pathomechanismen bei VHF geben. Es stellte sich heraus, dass RP keinen Einfluss auf die mRNA-Expression von DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2 und eingeschränkt auf JPH2 und GPX1 in HL-1 Zellen hatte. Lediglich nach Intervall-RP war die mRNA-Menge von JPH2 erhöht und von GPX1 reduziert. Sowohl nach kontinuierlichem als auch nach Intervall-RP war die Genexpression der Proteine SNIP1 und SBK2 stark reduziert. Gleichzeitig stellte sich eine ebenso stark reduzierte SBK2 Proteinexpression sowohl in den HL-1 Zellen als auch im humanen Vorhofgewebe bei VHF dar. In der immunhistochemischen Untersuchung atrialer Gewebeschnitte präsentierte sich SBK2 im Zytoplasma, entlang der Zellmembran und vesikelartig im perinukleären Raum der humanen Kardiomyozyten. RP und VHF hatten keinen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression von MARK2 in den HL-1 Zellen und im humanen Vorhofgewebe. In der Untersuchung der Protein-Phosphorylierung von MARK2 an Thr208 ergaben sich allerdings Diskrepanzen zwischen den murinen und humanen Zellen. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde in den humanen Kardiomyozyten für MARK2 eine regelmäßige Anordnung in longitudinaler Ausrichtung und zwischen den Z-Linien nachgewiesen. Eine VHF-abhängige durch Phosphorylierung vermittelte subzelluläre Translokation von MARK2 konnte ausgeschlossen werden. Diese RP-assoziierten Veränderungen im Phosphoproteom sind am atrialen Remodeling, bei der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Aktivierung des TGF-β- und NF-κB-Signalwegs involviert. Des Weiteren wird ein Zusammenhang zwischen MARK2 und dem Wnt-Signalweg vermutet.
In weiterführenden Arbeiten sollten Untersuchungen der spezifischen Effekte von Protein-Phosphorylierungen und der Protein-Protein-Interaktionen erfolgen. Da zu den kardialen Funktionen von SBK2 keine Daten vorliegen, könnten mithilfe des Knock-outs von SBK2 (Knock-out Maus oder CRISPR-Cas9 Knock-out in HL-1 Zellen) grundlegende Aussagen zu dessen Rolle im gesunden Herzen oder bei VHF erhalten werden.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde untersucht, zu welchen Veränderungen es im Proteom der pankreatischen β-Zelle durch Erzeugung von Hyperglykämie und/oder Hyperlipidämie kommt, die z.B. im Rahmen des Metabolischen Syndroms auftreten können.
Für die Experimente wurde die Zelllinie BRIN BD11 verwendet. Eine Behandlung erfolgte vergleichend mit Glucose (25 mM) und/oder Docosahexaensäure (DHA 0,1 mM) für 24 Stunden.
Das Proteom der BRIN-BD11 Zellen wurde mit Hilfe von 2D Differenzial-Fluoreszenz-Gelelektrophorese (DIGE) analysiert und die Proteine unter Verwendung der Massenspektrometrie identifiziert. Es konnten insgesamt 1101 Proteine in 1487 detektierten Spots bestimmt werden. Darunter stellten sich 90 Spots unter den oben genannten Stimulationen als signifikant reguliert dar. Aus diesen wurden 63 regulierte Proteine identifiziert, die sich verschiedenen Bereichen des Stoffwechsels zuordnen lassen, u.a. dem Glucosestoffwechsel, der Atmungskette, katabolen Prozessen oder den Reparatur- und Schutzmechanismen.
Eine Ingenuity Pathway Analyse anhand der regulierten Proteine ergab Zuordnungen zu 3 Netzwerken:
1 Nukleinsäuremetabolismus, Lipidmetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
2 DNA -Replikation, -Rekombination und -Reparatur, Nukleinsäuremetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
3 Kohlenhydratmetabolismus, molekularer Transport und Biochemie kleiner Moleküle.
Weiterhin konnte eine funktionelle Einteilung sowie die Verteilung der Proteine nach Zellkompartimenten dargestellt werden.
Eine Verifizierung der Ergebnisse mittels RT-qPCR erfolgte für Cathepsin D, Endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 2, Melanocyte proliferating gene 1, Glutamat-Cystein-Ligase sowie für die Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2. Desweiteren wurden Western Blot Analysen zu Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2 durchgeführt.
Die Ergebnisse weisen auf eine Regulation im Sinne einer Kompensation der Stressoren hin, die durch gesteigerte Expression/Aktivität antioxidativer Systeme wie Glutathion und Thioredoxin erklärbar wären. Zudem konnte ein Proteommuster der BRIN BD11 Zellen erstellt werden und bildet mit der massenspekrometrischen Identifizierung der Proteine eine Grundlage für weitere Untersuchungen an der Zelllinie.
Die miRNAs sind an der Regulation der Genexpression und somit an der zellulären Proteinbiosynthese beteiligt. Die Expressionsmuster von miRNAs unterscheiden sich sowohl bei Entwicklung als auch bei verschiedenen Stadien von Tumoren, sodass sie zu interessanten Kandidaten als prognostische Biomarker werden können.
In der vorliegenden Arbeit stand die Überexpression der miR-3687 im Vordergrund. Ihre Rolle als pro- oder antionkogen agierende miRNA sollte untersucht werden. Mithilfe der Transfektion prostataspezifischer kastrationssensibler sowie kastrationsresistenter Zelllinien konnte eine Überexpression der miR-3687 in Prostatagewebe simuliert werden. Um den Erfolg der Zelltransfektion zu quantifizieren, wurde die stem – loop RT-qPCR etabliert.
Mittels Massenspektrometrie konnten die differentiell exprimierten Proteine analysiert werden. Zur Anwendung kamen 2 verschiedenen Verfahren, gelfrei sowie gelbasiert. Dabei ergaben sich deutliche zellspezifische Unterschiede. Im gelbasierten Ansatz wurden beispielsweise für PC-3 Zellen ca. 1685 Proteine, im gelfreien Ansatz bis zu 543 Proteine (bei min. 2 Peptide count) detektiert, die anhand statistischer Parameter ausgewählt wurden.
Über Western Blot Experimente erfolgte die Verifizierung interessanter Proteine. Hierbei konnte gezeigt werden, dass PC-3 Zellen miR-3687 reguliert die kleine Isoform des Androgenrezeptors exprimieren. Insbesondere das Protein Vimentin zeigte unter miR-3687 Einfluss in den beiden kastrationssensiblen Zelllinien eine Expressionsminderung. Da es sich bei diesem Protein um einen Marker für den epithelial mesenchymalen Übergang handelt, könnte die Überexpression der miR-3687 der Metastasierung von Krebszellen entgegenwirken und so einen neuen Therapieansatz darstellen.
Hinweise auf einen antionkogenen Effekt ergeben die verminderte Expression des Androgenrezeptors in den kastrationsresistenten Zelllinien, die signifikant verminderte Expression des Tumorproteins D52-IF1 sowie die verminderte Expression des Proteins β3-Tubulin in allen Zelllinien.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Vielzahl an Proteinen durch miR-3687 reguliert werden. Bei weiterer Untersuchung der miR-3687 könnte geklärt werden, ob dessen Überexpression allgemein im Gewebe oder nur in ausgewählten Zelllinien antionkogene Wirkungen aufweist und damit tumorsupprimierend wirkt, sodass sich daraus eine spezifische Therapie, beispielsweise nur für das kastrationsresistente Stadium des Prostatakarzinoms, ergeben könnte.
Untersuchungen zur Wirkung von miRNAs stehen im Fokus der aktuellen Forschungen, besonders aufgrund ihrer wichtigen regulatorischen Funktion bei der Biosynthese von Proteinen. Durch die Korrelation mit der Karzinomentwicklung und den Tumorstadien rücken miRNAs als prognostische Biomarker in den Vordergrund.
Mit dieser Arbeit wurden der Einfluss der miR-4417 als pro- oder antionkogen wirkende miRNA auf das Prostatakarzinom und dessen Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese untersucht. Hierzu wurde die miR-4417 mittels Transfektion in 4 verschiedenen Prostatakarzinom- Zelllinien überexprimiert. Die Quantifizierung erfolgte unter Anwendung der sogenannten stem loop RT-qPCR. Die modulierten Proteommuster der Zelllinien wurden quantitativ und qualitativ verglichen. Dabei fanden gelbasierte und gelfreie Methoden unter Beachtung statistischer Kriterien Verwendung. Bei der Analyse der 2D-Gele wurden ca. 1600 Spots detektiert und quantifiziert. Zellspezifisch ergaben sich zwischen 40 und 60 differentielle Expressionen. Mithilfe der Massenspektrometrie wurden die Peptide nach tryptischem Verdau analysiert und die Proteine identifiziert. Die Verifizierungen von ausgewählten, differenziell exprimierten Proteinen wurden mittels Westernblot durchgeführt.
Die Expression des Androgenrezeptors war unter miR-4417 Einfluss in den beiden kastrationsresistenten Zelllinien gemindert, ebenso wie die Isoform 1 des Tumorproteins D52. Dies lässt eine antionkogene Wirkung der miR-4417 vermuten. Im Gegensatz dazu war die Expression von Peroxiredoxin 3 erhöht. Da dieses Protein zu einer Resistenz von Zellen gegen die H2O2 induzierte Apoptose führt und somit Krebszellen einen Überlebensvorteil verschafft, besteht in diesem Zusammenhang der Verdacht auf einen proonkogenen Effekt der miR-4417. Auch bei weiteren untersuchten Proteinen wie dem Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 oder dem Poly(U)-binding-splicing factor PUF60 ergaben sich zum Teil gegensätzliche Expressionen. In weiteren Untersuchungen könnte geklärt werden, ob die pro- oder antionkogenen Eigenschaften dieser miRNA überwiegen oder ob möglicherweise bestimmte Einflussfaktoren bestehen, die dazu führen. Eventuell existieren der miR-4417 vorgeschaltete Regulationsmechanismen, die dessen gewebespezifische Wirkung beeinflussen.
Insgesamt ist mithilfe dieser Arbeit deutlich geworden, dass die miR-4417 eine bedeutende regulatorische Rolle in Bezug auf die Progression des Prostatakarzinoms einnimmt und somit einen wichtigen Ansatzpunkt für die weitere Krebsforschung darstellten könnte. Eine miRNA getriggerte Krebstherapie könnte auf Basis umfangreicher Forschungsdaten als alternative Methode Anwendung finden.
Summary Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer found in men from western countries and is the leading cancer death next to lung cancer and colorectal cancer. Proteomic studies on PCa identified a number of differentially expressed proteins and some of them were reported as potential markers, but clinical application of these markers is mostly missing. Most of the expression profiling studies have been carried out on radical prostatectomy specimens, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, serum, urine and prostate fluids. To define the protein expression pattern of prostate biopsies, in the present study we investigated biopsy samples from benign prostate hyperplasia (BPH) and PCa patients by two-dimensional gel electrophoresis (BPH n=11 and PCa n=12) and mass spectrometry to identify potential biomarkers which might distinguish the two clinical situations. 2-DE results revealed 88 protein spots expressed differentially among hyperplasia and cancer groups with statistical significance. Interesting spots were analyzed by MALDI-TOF-MS-MS and 79 different proteins identified. The important proteins identified included, Prohibitin and NDRG1 tumor suppressor proteins, HSPs, cytoskeletal proteins, enzymes like DDAH1 and ALDH2. Prohibitin expression was investigated in detail at mRNA level and protein level using immunohistochemistry on prostatectomized specimens. We found that the level of mRNA for prohibitin correlates with the increased amount of protein indicating the involvement of changes at transcriptional level. Furthermore, immunohistochemistry revealed no staining in BPH, moderate staining in prostate intraepithelial neoplasia (PIN) and strong staining in PCa. From the list of differentially proteins compared to PCa, TPD52 is over expressed in prostate cancer and also mRNA estimation by real-time PCR confirmed over expression of TPD52 at transcriptional level in cancer. TPD52 is a protein over expressed in prostate and breast cancer due to gene amplification but its exact physiological function is not investigated in detail. In the present study, we explored the responsiveness of LNCaP cells after dysregulation of TPD52 expression. Transfection of LNCaP cells with specific shRNA giving efficient knockdown of TPD52 resulted in a significant cell death of the carcinoma LNCaP cells. As evidenced by the activation of caspases (caspase-3 and -9) and by the loss of mitochondrial membrane potential, cell death occurs due to apoptosis. The disruption of the mitochondrial membrane potential indicates that TPD52 acts upstream of the mitochondrial apoptotic reaction. To study the effect of TPD52 expression on cell proliferation, LNCaP cells were either transfected with EGFP-TPD52 or a specific shRNA. EGFP-TPD52 overexpressing cells showed an increased proliferation rate whereas TPD52-depleted cells showed a reverse effect. Additionally, we demonstrated that the exogenous expression of TPD52 promotes cell migration via ávâ3 integrin in prostate cancer cells through the activation of protein kinase B (PKB/Akt) pathway. In an attempt to identify new interacting proteins for TPD52, GST pulldown assays provided evidence for the physical interaction between TPD52 and Prx1 in LNCaP cells. Further, immunoprecipitation results confirmed this interaction. Our results demonstrates that protein profiling and mRNA studies can be performed on prostate biopsies. Moreover, our study revealed a significant up-regulation of prohibitin in prostate cancer compared to BPH which may be a potential marker to distinguish PCa and BPH. From the results for functional characterization of TPD52, we conclude that TPD52 plays an important role in various molecular events particularly in morphological diversification and dissemination of PCa. It may be a promising target to investigate further in detail to develop new therapeutic strategies to treat PCa patients. Caspases represent a family of cysteine proteases that are regarded as central executioners of apoptotic cell death. Activation of caspase cascade is an essential prerequisite in the induction of apoptosis in cellular systems. So far, in many tumors caspases were shown to be downregulated while anti-apoptotic Bcl-2 is up-regulated. To get insight in their putative role in PCa progression we determined the expression of caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved (activated) caspases 3 and 6, caspase-9 and antiapoptotic protein Bcl-2 in benign prostate epithelium (BPE) and prostate carcinoma. In the current study 20 prostates were obtained from patients undergoing radical prostatectomy due to PCa. Paraffin embedded prostate whole mounts were cut at (4 µm) and investigated immunohistochemically using anti-mouse monoclonal antibodies directed against caspases 1 and 9, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved caspases 3 and 6, and Bcl-2. In BPE all caspases were localized in the cytoplasm of glandular cells. Comparing BPE to PCa, no differences were found for caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6 as well as caspase-9. Immunostaining for cleaved caspases 3 and 6, however, revealed a statistically significant reduction in PCa compared to non-neoplastic tissue. Whereas in BPE Bcl-2 protein was detected in the basal compartment of epithelial gland cells no immunostaining was seen in PCa. As our results show a decreased amount of activated caspases may be due to the alterations of posttranslational cleavage rather than expression of caspases 3 and 6. This suggests that the modification in their activation pathway could play an important role during PCa progression.
Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Verfahren zur morphometrischen Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Biomaterialien stellt eine reproduzierbare, vielfältig anwendbare Methode dar. Das Programm ImageJ ermöglicht ein einfaches, modifiziertes Adaptieren dieses Analyseverfahrens an verschiedene immunhistochemische Untersuchungen. Die Anwendung des etablierten manuellen Zählverfahrens ermöglichte in den nachfolgenden Untersuchungen den Nachweis, dass das Konzept der Beschichtung von Implantatmaterialien mit einer biomimetischen Membran, basierend auf dem Phospholipid POPE, keine negativen Einflüsse auf die akute und chronische Entzündungsreaktion im das Implantat umgebenden Gewebe zeigte. Die Herstellung von biomimetischen Oberflächen als Implantatbeschichtung, die von den Zellen als körpereigen erkannt wird, könnte somit die langfristige Integration des Implantats in den Wirtsorganismus verbessern. Zusammen mit den In-vitro-Ergebnissen [Willumeit et al., 2007], in denen günstige Auswirkungen dieser Beschichtung auf Zell- und Bakterienadhäsion nachgewiesen wurden, zeigen die In-vivo-Befunde der vorliegenden Arbeit das Potential von Phospholipidbeschichtungen zum Erreichen von lang andauernder Integrität und Biofunktionalität metallischer Implantate in der klinischen Anwendung.
Ziel der Arbeit war die Untersuchung der lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen nach intramuskulärer Implantation von Niedertemperatur-Plasmapolymer-modifizierten Titanplättchen (Ti) im Tiermodell Ratte. Ausgangspunkt dafür waren vorherige Zellkultur-Untersuchungen zu Ti-Proben mit einer positiv geladenen Schicht aus plasma-polymerisiertem Allylamin (PPAAm) beziehungsweise einer negativ geladenen Schicht aus plasma-polymerisierter Acrylsäure (PPAAc). Diese In-vitro-Studien ergaben für eine Beschichtung mit PPAAm positive Effekte auf das Wachstum von Osteoblasten sowie für eine Beschichtung mit PPAAc auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen. Für die darauf aufbauenden in dieser Arbeit durchgeführten In-vivo-Untersuchungen war es zunächst notwendig, eine Methode zur quantitativen histologischen Untersuchung der lokalen Gewebsreaktionen nach Implantation von Ti-Proben zu etablieren. Deren Evaluierung zeigte eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und damit die Eignung des Bildanalyse-Verfahrens für die weiteren Untersuchungen. Anschließend erfolgten unter Anwendung dieser Methode morphometrische immunhistochemische Untersuchungen der lokalen Entzündungsantwort nach intramuskulärer Implantation von PPAAc- und PPAAm-beschichteten Ti-Plättchen. Hierzu wurden in einer ersten Studie für beide Beschichtungen die Gesamt-Monozyten und -Makrophagen sowie die MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen im Periimplantatgewebe nach 56 Tagen Implantationsdauer im Vergleich zu unbeschichteten Kontrollproben untersucht. Dabei ergab sich für die PPAAc-beschichteten Ti-Plättchen im Vergleich zu PPAAm-beschichteten Implantaten und Kontrollen eine verstärkte chronische Entzündungsreaktion. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in einer anschließenden zweiten Studie für drei verschiedene PPAAm-Beschichtungen, die sich hinsichtlich der Plasmaprozessparameter im Duty cycle unterschieden, die Gewebsreaktionen im Kurz- und Langzeitverlauf analysiert. Dafür erfolgte eine Untersuchung der Gesamt-Monozyten und -Makrophagen, der gewebsständigen Makrophagen, der T Lymphozyten und der MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen 7, 14 und 56 Tage nach Implantation für diese drei PPAAm-Varianten im Vergleich zu Kontrollen. Im Ergebnis waren die lokalen Gewebsreaktionen für die zwei PPAAm-Varianten mit dem höheren Duty cycle im Langzeitverlauf schwächer ausgeprägt als für die PPAAm-Schicht mit dem geringen Duty cycle und die Kontrollen. Dieses Ergebnis stand im Einklang mit entsprechenden Unterschieden in den physikochemischen Schichteigenschaften wie zum Beispiel der Schichtdicke, der Aminogruppendichte und der Proteinadsorption. Darüber hinaus wurden das Serumprofil und die Korrelationen der pro-inflammatorischen Zytokine IL-2 und IFNγ sowie der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 vor sowie wöchentlich für 56 Tage nach Implantation von PPAAc-und PPAAm-beschichteten Implantaten sowie Kontrollen analysiert. Diese Untersuchungen ergaben für die PPAAc-Gruppe in der Spätphase einen gegensätzlichen Verlauf von IL-4 und IL-10 sowie abweichende Korrelationen des IL-10 mit den anderen untersuchten Zytokinen, während in der PPAAm-Gruppe die systemischen Reaktionen und die Korrelationen zwischen den untersuchten Zytokinen mit den Befunden in der Kontrollgruppe vergleichbar waren. Die Gesamtbetrachtung der in dieser Arbeit erhobenen In-vivo-Ergebnisse mit den vorherigen In-Vitro-Befunden zeigt, dass eine positiv geladene PPAAm-Beschichtung einen vielversprechenden Ansatz zur Erzeugung von zelladhäsiven Implantatoberflächen mit dem Ziel einer Verbesserung des Einwachsens von Ti-Implantaten darstellt. Darüber hinaus konnte für die PPAAm-Beschichtung gezeigt werden, dass Variationen in den Plasmaprozessparametern zu Unterschieden in den physikochemischen Eigenschaften und den daraus resultierenden In-vivo-Gewebsreaktionen führen. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in vier wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht (Walschus et al. 2011 J Microsc 242:94–99; Schröder et al. 2010 J Adh Sci Technol 24:1191–1205; Hoene et al. 2010 Acta Biomater 6:676–683; Walschus et al. 2012 J Mater Sci Mater Med 23:1299–1307).
Aufgrund der immensen ökonomischen Verluste im Zusammenhang mit Ausbrüchen der Klassischen Schweinepest (KSP) werden Notfall-Immunisierungspläne für die Europäische Union diskutiert. Tiere, welche mit dem konventionellen C-Stamm Lebendimpfstoff immunisiert wurden, unterliegen Handelsrestriktionen. Um diese Restriktionen zu lockern bzw. aufzuheben sind wirksame Markerimpfstoffe notwendig. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Prüfung der Markerimpfstoff-Kandidaten CP7_E2alf und CP7_E1E2alf_TLA in Tierversuchen. Weiterhin wurden neue diagnostische Methoden wie real-time RT-PCR Systeme zur Unterscheidung von Impfviren und Feldvirusstämmen entwickelt. Die Volllängen-Sequenzierung von Genomen ist eine hilfreiche Methode im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen. Fünf aktuelle deutsche KSP Isolate wurden sequenziert und die Ergebnisse für die Nachverfolgung der Virusverbreitung und für phylogenetische Analysen des Virus in den Wildschweinepopulationen von Nordrhein-Westfalen und Rheinland-Pfalz herangezogen.
Vordergründiges Ziel der Arbeit war eine Grundlagenforschung über die Expression der TRPCKanäle in Osteosarkomzellen unter basalen und stimulierten Bedingungen durchzuführen. Als thematisches Setting wurde zum einen die bisher unklare Wirkung des erfolgversprechenden Medikaments Mifamurtid gewählt sowie zum anderen ein möglicher Zusammenhang mit der alternativen Ang-(1-7)/Mas-Achse gesucht.
Die vorliegende Arbeit hat einerseits die Expression der TRPC-Kanäle in Osteosarkomzellen nachgewiesen und andererseits interessante Schnittpunkte zu der alternativen ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse des RAS gezeigt. So wird in Zukunft möglicherweise ein Zusammenhang zwischen der Mas-Aktivität und den TRPC-Kanälen – insbesondere von TRPC6 – substantiviert werden können. Die massive Induktion der Transkription von TRPC5 unter Inhibierung der PI3-Kinase ist eine interessante Beobachtung, die Ansätze für weiterführende Untersuchungen eröffnet. Inwieweit die pharmakologische Modulation von Mas- (oder MrgD-) Rezeptoren eine therapeutisch relevante Option beim Osteosarkom darstellt und inwieweit die Modulation der TRPC-Kanäle dazu beitragen kann, ist mit dieser Arbeit nicht geklärt. Die vorgelegten Daten zeigen jedoch eindeutig, dass der Mas-Antagonist D-Ala die Expression von zumindest TRPC 5, 6 und 3 sowie von Mas selbst in Osteosarkom-Zellen beeinflusst; Effekte die auch durch die Modulation von PI3K und MAP-Kinase Signalwegen erreicht werden können.
Der akute Myokardinfarkt auf Grundlage einer koronaren Herzerkrankung ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Besonders ältere Patienten leiden oft an mehreren kardiovaskulären Grunderkrankungen - so sind Vorhofflimmern und KHK häufige Komorbiditäten. Die pharmakologische Therapie von Vorhofflimmern bei bestehender KHK ist ein therapeutisches Problem. Dronedaron hat sich in zahlreichen klinischen Studien als wirksames Antiarrythmikum herausgestellt und zeigte zudem positive Effekte auf die Inzidenz und Sterblichkeit von akuten Myokardinfarkten (ATHENA-Studie). In verschiedenen Forschungsarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass Dronedaron in der Frühphase nach einem akuten Myokardinfarkt eine Reduktion der Infarktgröße bewirken kann. Im Gegensatz dazu scheinen Patienten mit schwerer struktureller Herzerkrankung bezüglich ischämischer Ereignisse nicht von einer Dronedarontherapie zu profitieren (PALLAS-Studie).
In dieser Arbeit sollte unter Nutzung des Schweins als Modellorganismus geklärt werden, ob im Langzeitverlauf vier Wochen nach einem akuten Myokardinfarkt protektive Effekte Dronedarons auf die Infarktgröße und die kardiale Funktion nachgewiesen werden können. Desweiteren wurden mithilfe ventrikulärer Gen- und Proteinexpressionsanalysen Dronedaroneffekte in gesundem Myokard, Infarktgrenze und Infarktnarbe auf molekularbiologischem Level untersucht.
Für den experimentellen Myokardinfarkt wurde mithilfe eines Ballonkatheters der rechte Ramus interventricularis anterior distal des ersten Septalastes für 90 Minuten verschlossen. Nach 4-wöchiger Infarktheilung wurden die Herzen explantiert und Gewebsproben für die Expressionsanalysen entnommen. Die Größe der Infarktnarbe wurde an den formalinfixierten Herzen mithilfe der MRT-Bildgebung bestimmt. Genexpressionsprofile wurden mittels RNA-Microarray und anschließender Validierung mittels RT-qPCR, Proteinexpressionsprofile mittels 2D-DIGE-Analyse und anschließender massenspektrometrischer Proteinidentifizierung erstellt.
Die Infarktgröße wurde durch die Dronedarontherapie nicht signifikant beeinflusst (Kontrolle vs. Dronedaron: 10,1 % vs. 9,2 %, n.s.). Das Schlagvolumen der dronedaronbehandelten Tiere zeigte im Gegensatz zu den Kontrolltieren vier Wochen nach Infarzierung keine signifikante Reduktion. Enddiastolisches Volumen, Ejektionsfraktion sowie Serummarker zeigten keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen.
In den Expressionsanalysen konnten insbesondere in der Infarktgrenze Effekte der Dronedarontherapie beobachtet werden. Es kam zu einer Expressionssteigerung von TGFβ3, der TGFβ-Rezeptoren 1 und 2 sowie der TGFβ-bindenden Proteine LTBP1 und 2. Die vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zeigte sich auch in einer Expressionssteigerung matrizellulärer Proteine, darunter Thrombospondin 1 und 2, Periostin und Fibronektin, sowie diverser extrazellulärer Matrixproteine, v.a. Kollagen-Subtypen.
Die Aktivierung des TGFβ-Signalings sowie die Expressionssteigerung TGFβ-induzierter matrizellulärer Proteine in der Infarktgrenze begünstigen durch antiinflammatorische Effekte und Stimulation der Kollagensynthese die Infarktheilung sowie die Stabilisierung des Narbengewebes. Die Proteine Thrombospondin 1 und 2 verhindern zudem eine Expansion des Infarktes in gesunde Myokardareale. Desweiteren kann insbesondere Periostin die Kardiomyozytenproliferation im infarzierten Myokard stimulieren. So können das TGFβ-Signaling sowie matrizelluläre Proteine zu einer Verbesserung der kardialen Funktionalität nach akutem Myokardinfarkt beitragen. Es ist vorstellbar, dass Calcium-abhängige Mechanismen in Kardiomyofibroblasten die dronedaronabhängige gesteigerte Aktivierung des TGFβ-Signalings und als Folge der matrizellulären Proteine vermitteln.
Die Aufrechterhaltung des Schlagvolumens des linken Ventrikels durch die Dronedarontherapie vier Wochen nach einem Myokardinfarkt spricht für einen Erhalt der systolischen Kontraktionskraft des Herzens. Auch wenn keine signifikante Reduktion der Infarktgröße festgestellt werden konnte, deuten die gefundenen Ergebnisse auf eine protektive Wirkung von Dronedaron auf kardiale Funktionalität und die Infarktheilung bei ansonsten gesunden Patienten hin. Bei Patienten mit bereits strukturell vorgeschädigtem Herzen beispielsweise im Sinne einer schweren Herzinsuffizienz könnte die gefundene vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zu einer Verschlechterung der Prognose führen, was die Ergebnisse der PALLAS-Studie erklären könnte.