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The thyroid gland is of crucial importance in human metabolism. Its main secretion products, L-thyroxine (T4) and 3,3’,5-triiodo-L-thyronine (T3), are essential for proper development of multiple tissues and organs as well as for their functioning in the adult organism. The secretion of thyroid hormones (TH) is stimulated by thyrotropin (TSH) released from the pituitary gland. This tight connection between both hormones is of crucial importance for the clinical diagnosis of thyroid dysfunction. During the last two decades the concept of TH action developed to increased complexity. However, most of the recent advances in the field of TH research are based either on cell culture, tissue or animal models or stem from studies investigating specific hypotheses in humans. Thus, experimental approaches for the comprehensive, hypothesis-free characterization of metabolic effects of classical and non-classical TH in human are urgently needed. This holds true in particular for the TH derivative 3,5-diiodothyronine (3,5-T2). It was described to alleviate the typical detrimental metabolic consequences of a high-fat diet and even reversed hepatic steatosis. To replicate these experimental findings from rodents in humans, comprehensive data from the population-based Study of Health in Pomerania (SHIP) was analyzed in the present work. Based on a euthyroid, diabetes-free SHIP-subsample (N=761), non-linear associations between the serum concentrations of 3,5-T2 and glucose as well as TSH were detected. In contrast, no significant 3,5-T2 associations with several anthropometric markers or blood lipid parameters were observed, partially questioning the transferability of the beneficial metabolic 3,5-T2 effects reported for pharmacological intervention studies on rodents to humans. Recent advances in technological development now allow for the use of high-throughput spectrometric platforms to characterize the small molecule content (metabolome) of blood and urine samples. The detected metabolome constituents can be associated with any relevant parameters of interest, thereby extending the scope of classical association studies. Therefore, in the second part of the present thesis, the metabolic fingerprints of FT4, TSH as well as the ratio log(TSH)/FT4 as markers of thyroid function were profiled. Strong differences between the metabolic fingerprints of FT4 and TSH were observed, partially alleviated by the log(TSH)/FT4 ratio. These findings not only emphasize the high diagnostic value of the combined evaluation of TSH and FT4 in the assessment of thyroid function but additionally argue for a holistic approach in the diagnosis of thyroid function. More moderate endogenous effects of 3,5-T2 were evaluated by comparing its urinary metabolic fingerprint with that of the classical TH. A number of associations became apparent, indicating a function of endogenous 3,5-T2 in intermediary metabolism. Besides partially confirming associations with respect to the presented findings in animal studies, the strongest 3,5-T2-association was observed with trigonelline, a metabolite described earlier to exhibit similar beneficial effects as 3,5-T2 on glucose metabolism when used as a pharmacological agent in animal studies. An association towards hippurate indicated a partial overlap with the metabolic profile of TSH and hence consolidated results from the first two projects in the sense of a thyromimetic role of 3,5-T2 in the feedback regulation of TH. The diagnosis of thyroid disorders based on the classical markers TSH and FT4 suffers from restricted sensitivity in the subclinical range as both parameters have broad reference ranges in the general population. Therefore, in an approach to detect novel peripheral biomarkers of thyroid function, sixteen healthy young men were challenged with 250 µg of levothyroxine (L-T4) over a period of eight weeks in the fourth project presented here as part of this thesis. Monitoring of the volunteers over a period of sixteen weeks allowed delineation of the metabolic shifts first towards thyrotoxicosis and later in the context of the restoration of euthyroidism. The use of mass spectrometry for the comprehensive characterization of the metabolite as well as the protein content of samples taken at the different time points revealed profound molecular alterations, despite the lack of any clinical symptoms in the volunteers. Molecular signatures of thyrotoxicosis indicated increased energy expenditure, pronounced defense against systemic oxidative stress, a general drop in apolipoproteins, as well as increased abundances of proteins related to the coagulation cascade and the complement system. Good and robust classification of the thyroid state independent of TSH and FT4 was achieved using random forest analysis with a subset of fifteen metabolites and proteins, indicating new options in the individualized diagnosis of thyroid disorders.
Vergleichende Untersuchungen zu rekombinanten Toxoplasma-gondii-Isolaten natürlichen Ursprungs
(2020)
Toxoplasma gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit mit hohem zoonotischen Potential. In Nordamerika und Europa haben sich drei klonale Toxoplasma-Linien durchgesetzt, Typ I, Typ II und Typ III. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Virulenz in Labormäusen: Toxoplasma gondii vom Typ I gilt im Allgemeinen als hochvirulent, wohingegen Typ II und III wenig virulent in Labormäusen sind. In Deutschland dominieren T. gondii vom Typ II. Trotz selten vorkommender natürlicher sexueller Rekombinationen von T. gondii in Deutschland konnten in einer vorausgegangenen Studie rekombinante T. gondii-Typ II-III-Oozysten aus dem Kot einer natürlich infizierten Katze in Deutschland isoliert werden. Mittels klonaler Vereinzelung wurden in einer weiteren vorausgegangenen Studie aus diesen Oozysten die fünf Tachyzoiten-Klone B6-H6, 2-C10, 2-H8, C12 und A7 generiert, die sich in der Verteilung ihrer Typ II- und III-Allele voneinander unterschieden. Ziel dieser Arbeit war es, die fünf Klone vergleichend zu untersuchen hinsichtlich ihrer Geno- und Phänotypen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die bekannten polymorphen Virulenzfaktoren ROP18, ROP5, ROP16 und GRA15 gelegt, die maßgeblich für Unterschiede in der Labormausvirulenz zwischen den klonalen Linien sorgen können. ROP18 und ROP5 sind an der Inhibition der IRG-vermittelten Zerstörung der parasitophoren Vakuole, dem Hauptabwehrmechanismus in Mäusen, beteiligt. Während alle fünf Klone das virulente Allel von ROP5 besaßen, hatten nur zwei der fünf Klone, B6-H6 und 2-C10, das virulente Allel von ROP18, dessen virulenter Genotyp in einer hohen Expression resultiert. Diese beiden Klone lösten auch eine 100 %-ige Mortalität in den infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier stimmte der virulente ROP18-Genotyp mit der hohen Mausvirulenz überein. Die anderen drei Klone, 2-H8, C12 und A7, besaßen das nicht virulente Allel von ROP18. Von letzteren drei Klonen lösten jedoch lediglich nur C12 und A7 eine geringere, 30 %-ige Mortalität in infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier würde der nicht-virulente ROP18-Genotyp die niedrigere Virulenz erklären. Der Klon 2-H8, der ebenso ein nicht-virulentes ROP18-Allel besaß, löste dagegen eine 100 %-ige Mortalität aus. Demnach ließe sich die Virulenz der infizierten BALB/c-Mäuse in dieser Studie nur in vier von fünf Klonen mit dem ROP18-Genotypen erklären. Neben ROP5 und ROP18 wurden auch die Virulenzfaktoren ROP16 und GRA15 untersucht. Diese regulieren das Zytokinprofil in infizierten Makrophagen und können dadurch Einfluss auf den klinischen Verlauf der Infektion nehmen. Von ROP16 und GRA15 besaßen jeweils alle fünf Klone das virulente Allel. Daher kann auch der Genotyp dieser Virulenzfaktoren hier nicht alleine die Unterschiede in der BALB/c-Mausvirulenz erklären. Auch das Expressionsprofil der Virulenzfaktoren in in-vitro inokulierten J-774A.1-Makrophagen mit geringen, wahrscheinlich nicht biologisch relevanten Abweichungen, ließ keine eindeutigen Rückschlüsse für die Ursache der unterschiedlichen Mausvirulenzen zu. Die in-vitro-Inokulation von J-774A.1-Makrophagen mit den Klonen ergab weiterhin, dass der mittelvirulente Klon C12 in der Lage war, die Makrophagen deutlich früher zu infizieren und eine höhere IL-12-Expression hervorzurufen. In überlebenden BALB/c-Mäusen verursachte er einen geringeren Gewichtsverlust gegenüber den anderen Klonen. Es kann für diese Studie festgehalten werden, dass sich die Virulenz der Klone in Labormäusen nicht allein durch das Vorhandensein virulenz-vermittelnder ROP18- oder anderer Virulenzgene erklären ließ. Durch die sexuelle Rekombination zwischen T. gondii des Typs II und III waren offenbar Allelkombinationen entstanden, welche auf ein komplexes multifaktorielles Netzwerk schließen lässt, das ursächlich für die Unterschiede in der Mausvirulenz und der Makrophagenfunktionalität zu sein schien.