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Docetaxel ist ein halbsynthetisches Zytostatikum aus der Klasse der Taxane, welches den intrazellulären Mikrotubulusapparat stabilisiert und so den gezielten Zelltod einleitet. Dieser Mechanismus wird zur Behandlung von schnell proliferierenden Tumorzellen genutzt, weshalb Docetaxel bis dato als eine First-line Medikation des kastrationsresisten Prostatakarzinoms (CRPC) gilt. Sowohl ein negatives Ansprechen der Therapie als auch die Entstehung zahlreicher Resistenzmechanismen können zur Verzögerung einer adäquaten Behandlung der malignen Erkrankung führen. Besonders Expressionänderungen von HSP27 werden in diesem Zusammenhang als Ursache für Zytostatikaresistenzen in diversen Tumorarten angegeben. In dieser Arbeit sollten die zellulären sowie molekularen Wirkungsweisen von Docetaxel auf PCa-Zellen verschiedener Dignität charakterisiert werden. Dabei wurde gezeigt, dass Docetaxel in allen Zelllinien einen negativen Einfluss auf die Vitalität und Zellzahl ausübt. Über die Aktivierung des Tumorsuppressors p53 führt Docetaxel in LNCaP-Zellen zur Fragmentierung der Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, was den Eintritt in die Apoptose charakterisiert. Wir demonstrierten, dass unter Docetaxel-Behandlung die Expression von HSP27 in LNCaP-, PC-3-Zellen sowie in PC-3-Zellen mit überexprimiertem HSP27 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene steigt. Weiterhin wurde bewiesen, dass eine erhöhte HSP27-Expression mit einer intrazellulären Chemoresistenz einhergeht und dies sowohl in hormonsensitiven als auch in hormoninsensitiven PCa-Zellen den vitalitäts- und proliferationshemmenden Effekt von Docetaxel verringert. Die Blockierung von HSP27, wie es derzeit mit dem HSP27-Inhibitor OGX-427 in Phase II-Studien getestet wird, könnte somit einen geeigneten Angriffspunkt zur Verhinderung einer Resistenzentwicklung im CRPC darstellen und eine adäquate Therapie ermöglichen.
VER155008 konkurriert als ATP-Analogon um die Bindung an HSP70 und agiert hierbei als
spezifischer Inhibitor dieses Hitzeschockproteins. Bisherige Studien konnten einen
zytotoxischen Effekt von VER155008 auf verschiedene Tumorentitäten zeigen, die
vielfältigen Wirkmechanismen bleiben bisher allerdings noch weitgehend ungeklärt.
Hitzeschockproteine (HSPs) sind molekulare Chaperone, sie vermitteln korrekte Faltung,
Stabilisierung, Transport und Abbau von Proteinen, regulieren Transkriptionsfaktoren und
können auf Zellsignalkaskaden Einfluss nehmen. Diverse Tumorentitäten, wie auch das
Prostatakarzinom (PCa) zeigen eine gesteigerte HSP-Expression. HSPs tragen durch
antiapoptotische Effekte zur Proliferation, Invasion und Metastasierung des Tumors bei und
können Resistenzmechanismen gegenüber Therapeutika im PCa vermitteln.
Diese Arbeit konnte zunächst einen wachstumshemmenden, konzentrationsabhängigen
Effekt des HSP70-Inhibitors VER155008 auf die PCa-Zelllinien PC-3 und LNCaP nachweisen.
Geeignete Wirkstoffkonzentrationen, um einen halbmaximalen inhibitorischen Effekt (IC50)
zu erzielen wurden in PC-3-Zellen bei 3μM und LNCaP-Zellen bei 10μM VER155008 ermittelt.
Anschließende Proteinanalysen zeigten eine Modulation der Expression verschiedener HSPs,
sowie des Androgenrezeptors (AR), einem zentralen Proliferationsfaktor des PCa, als
Reaktion auf die HSP70-Inhibition. Untersucht wurde die Expression von HSP27, HSP70,
HSP90α/ß, sowie der Co-Chaperone HSP40, HSP60 und HOP und des AR. Die Expression von
HSP90ß, dem Bindungspartner des AR im AR-Multi-Chaperonkomplex, sowie HOP, seinem
Co-Chaperon, wurde in beiden PCa-Zelllinien um bis zu 50% signifikant supprimiert.
Zusätzlich zeigt sich eine um bis zu 70% supprimierte Expression von HSP27 nach
VER155008-Behandlung beider PCa-Zelllinien im Vergleich zur Kontrolle. HSP27 ist ein
wichtiges zytoprotektives Chaperon, dessen vermehrte Expression mit Therapieresistenzen
gegenüber Docetaxel, sowie einer schlechten Prognose des PCa assoziiert wird. Es vermittelt
die Translokation des AR in den Zellkern und reguliert dadurch die proliferative Wirkung der
AR-Aktivierung. Die HSP70-Inhibierung zeigte zusätzlich eine signifikante Reduktion des AR
um 40% in LNCaP-Zellen.
VER155008 zeigt sich als effektiver Wachstumsinhibitor des Prostatakarzinoms, der sowohl
in der hormonsensitiven LNCaP-, als auch in der kastrationsresistenten PC-3-Zelllinie
antiproliferative Wirkung zeigt, die unter anderem durch eine Modulation der Expression
von Hitzeschockproteinen und des Androgenrezeptors vermittelt wird.
mikroRNAs (miRNAs oder miRs) sind kurze nicht-kodierende RNA-Moleküle, welche die Expression einer Vielzahl von Genen regulieren können. Das versetzt sie in die Lage, onkogene Zellsignalwege auf mehreren Ebenen fördern oder hemmen zu können. Die Rolle von miRNAs im Prostatakarzinom (PCa) wird zurzeit intensiv untersucht. Einen Beitrag dazu liefert diese Arbeit, welche die Rolle der miRNA miR-1 in PCa-Zellen charakterisiert. Untersucht wurde das Expressionsverhalten von Hitzeschock-Proteinen (HSPs) und Androgenrezeptor (AR) in PCa-spezifischen Zelllinien nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-1. Des Weiteren wurde mit Hilfe einer Microarray-Untersuchung nach weiteren Zielen von miR-1-Regulation gesucht. Dabei erwies sich miR-1 als zentraler Faktor in einem regulatorischen Netzwerk, in dem sich HSP70, HSP90α, AR und TGF-β als Ziele miR-1-gesteuerter Suppression darstellten. miR-1 selbst unterliegt dabei ihrerseits der Regulation durch HSP27. Die Suppression von AR und HSPs hat letztlich anti-proliferative zelluläre Effekte zur Folge. Zum einen, weil HSP70 und AR pro-proliferativ wirken, zum anderen, da HSP70 und HSP90α den AR stabilisieren und dadurch seine pro-proliferative Funktion vermitteln. Auch das im Zuge einer Mircoarray-Untersuchung identifizierte miR-1-Ziel TGF-β wird durch diese miRNA negativ reguliert, was ebenfalls anti-proliferative Wirkung auf PCa-Zellen hat. Zudem wird TGF-β mit Metastasierungs-Prozessen in Verbindung gebracht, auf die miR-1, über die Suppression von TGF-β, möglicherweise regulatorisch einwirken kann. Die in dieser Arbeit gezeigte Herabregulation von miR-1 in menschlichem PCa-Gewebe bestätigt die in vitro Ergebnisse und lässt die Schlussfolgerung zu, dass miR-1 die Funktion eines Tumorsuppressors im PCa besitzt, welcher im Zuge der Malignisierung des Karzinoms, im Sinne eines Resistenz-Mechanismus, herunterreguliert wird. Damit stellt die miR-1 ein mögliches Ziel zukünftiger pharmakologischer Intervention bei der Therapie des PCa dar.
Tumorbiologie und molekulare Mechanismen der Progression des Prostatakarzinoms (PCa) sind komplex und bisher nur unzureichend verstanden. Trotz einiger medikamentöser Ansätze zur Therapie des PCa mit teilweise neuartigen Wirkstoffen spielen primäre und sekundäre Therapie-Resistenzen bei der Behandlung eine große Rolle. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des apoptotischen Faktors Hitzeschockprotein HSP60 in PCa-Zellen, um potentielle Signalkaskaden und Effektormoleküle einer HSP60-abhängigen PCa-Progression aufzudecken. Durch massenspektrometrische Analysen von potentiellen HSP60-Bindungspartnern wurden mit den Proteinen Peroxiredoxin-1 (Prx-1), Peroxiredoxin-2 (Prx-2), Hitzeschockprotein HSP70, Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP) sowie Prohibitin (PHB) Kandidaten identifiziert, die bei Chemoresistenz wie auch bei proliferativen und apoptotischen Prozessen eine Rolle spielen können. Jedoch konnten durch Western Blot Analysen der Bindungs-Experimente nur Prx-1 und PHB als HSP60-Bindungspartner bestätigt werden. Die Modulation der HSP60-Expression mittels klonierter Überexpressions- und Knock-Down-Vektoren schlug aufgrund einer mutmaßlichen starken und sehr raschen zellulären Gegenregulation fehl. Dies kann als Hinweis darauf gedeutet werden, dass es sich bei HSP60 um einen essentiellen zellulären Faktor mit einer sehr stringenten Expressions-Kontrolle handeln könnte. Analysen der HSP60-Expression nach Modulation der Syntheseraten von miR-1 zeigten eine deutliche Induktion des Hitzeschockproteins durch die MikroRNA. Die Frage, ob HSP60 in PCa-Zellen pro- oder anti-apoptotisch wirkt, konnte mangels effizienter Modulation der HSP60-Expression nicht ausführlicher untersucht werden. Da der positive HSP60-Regulatior miR-1 jedoch als Tumorsuppressor beschrieben wird und eine Protein-Protein-Interaktion von HSP60 mit den pro-apoptotischen Proteinen Prx-1 und PHB nachgewiesen werden konnte, kann man die begründete Annahme formulieren, dass HSP60 in PCa-Zellen pro-apoptotische Funktionen ausführt.
Der Androgen-Rezeptor ist zentraler Regulator der PCa-Zelle und maßgeblich an der Entwicklung eines kastrationsresistenten Tumorstadiums beteiligt. Daher sollten mögliche Interaktionspartner der Androgen-Rezeptor-Achse identifiziert und deren regulatorischer Einfluss untersucht werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte einerseits eine positive Korrelation zwischen dem AR und dem HSP27 in PCa-Zellen als auch eine direkte Beeinflussbarkeit des AR durch das HSP27 gezeigt werden. In den Androgen-abhängigen LNCaP-Zellen war ein höheres endogenes HSP27-Level als in den Androgen-unabhängigen PC3-Zellen nachweisbar. Ein gezielter HSP27-Knock-Down in LNCaP-Zellen führte zu einer signifikanten Reduktion der AR-mRNA als auch des AR-Proteins. Darüber hinaus zeigte sich eine Reduktion der transkiptionellen Aktivität des AR in Form einer verringerten Anzahl an PSA-Transkripten. In Übereinstimmung damit führte eine HSP27-Überexpression in PC3-Zellen zu einer Re-Expression der AR-mRNA, obgleich kein funktionelles AR-Protein nachweisbar war. Auch die transkriptionelle Aktivität blieb unbeeinflusst. Als potentieller Modulator dieser AR-HSP27-Interaktion konnte die MikroRNA miR-1 identifiziert werden. Diese stand in negativer Korrelation zum AR und dem HSP27 in den verwendeten PCa-Zelllinien. So konnte in LNCaP-Zellen mit hohem endogenen HSP27-Level eine niedrigere miR-1-Nachweisrate als in den weniger HSP27 exprimierenden PC3-Zellen nachgewiesen werden. Ein Beleg für die direkte Interaktion des HSP27 mit der miR-1 ist die Tatsache, dass in PC3-HSP27-Zellen eine deutlich niedrige miR-1-Expression als in PC3-Zellen nachweisbar war. Abschließend bestätigen diese Daten die direkte Beteiligung des HSP27 und der miR-1 an der AR-Signalkaskade und die direkte Beeinflussbarkeit des AR durch HSP27. Dies unterstreicht die potentielle pharmakologische Einsatzfähigkeit beider Targets in der Therapie des Prostatakarzinoms.
Enzalutamid ist seit 2012 ein zugelassenes Medikament für die Hormontherapie nach Docetaxel-Behandlung bei kastrationsresistenten Prostatakarzinom (CRPC). Als bekannter Wirkmechanismus gilt der Antagonismus am Androgenrezeptor (AR) und die Verhinderung der Translokation in den Nukleus, sowie die Inhibition der Transkription am AR.
In dieser Arbeit wurde der Wirkmechanismus von Enzalutamid auf zellulärer und molekularer Ebene präzisiert. In der Wachstumskinetik zeigt sich eine Wachstumshemmung sowohl der AR-positiven LNCaP Zellen, als auch der AR- negativen PC-3 Zellen. Zur Untersuchung des antiproliferativen Effektes von Enzalutamid betrachtet diese Arbeit AR-assoziierte Wachstumsfaktoren, den AR selbst und Östrogenrezeptoren. Als Einflussgrößen gelten die AR-assoziierten Proteine, wie Hitzeschockprotein (HSP) 27, HSP70, HSP90α/β und die Co-Chaperone HSP40 und HSP 70/90 organizing Protein (HOP). Hierbei zeigte vor allem HSP27 aber auch HSP90β eine deutliche Suppression der Protein-Expression in beiden Zelllinien. Die Untersuchung der Proteinexpression der Co-Chaperone, HSP40 in beiden Zelllinien und HOP in LNCaP Zellen, ergab ebenfalls eine deutliche Supression. Diese Proteine, insbesondere HSP27, haben aufgrund ihrer zellulären Funktion Einfluss auf die Proliferation der PC-Zellen, somit kann ein supprimierender Effekt unter Enzalutamid die Erklärung für das eingeschränkte Wachstum der LNCaP Zellen aber auch der hormonresistenten PC-3 Zellen sein. In LNCaP Zellen konnte der supprimierende Effekt von Enzalutamid auf die AR-Expression bestätigt werden. Als weiteren möglichen Proliferationsfaktor wurde in dieser Arbeit der Östrogenrezeptor (ER) mit seinen Isoformen ERα, ERβ1 und ERβ2 untersucht. Es zeigte sich dabei eine deutliche Suppression des ERβ1, welcher in einem möglichen Zusammenhang mit dem AR stehen kann. Die Suppression der ERβ1-Expression zeigte sich aber auch deutlich in AR-negativen PC-3 Zellen, was auch als antiproliferativer Effekt gewertet werden kann. Die Untersuchung der weiteren ER-Isoformen unter Einwirkung von Enzalutamid zeigten keine Effekte.
Das Resultat dieser Arbeit ist, dass Enzalutamid nicht nur ein Hormonrezeptorantagonist ist, sondern auch auf AR-unabhängige Signalkaskaden Einfluss hat. Enzalutamid zeigt im Zellmodell einen deutlich antiproliferativen Effekt, was mit seiner effektiven Wirkung bei CRPC korreliert und auch an den in dieser Arbeit betrachteten Faktoren liegen kann.
Summary Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer found in men from western countries and is the leading cancer death next to lung cancer and colorectal cancer. Proteomic studies on PCa identified a number of differentially expressed proteins and some of them were reported as potential markers, but clinical application of these markers is mostly missing. Most of the expression profiling studies have been carried out on radical prostatectomy specimens, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, serum, urine and prostate fluids. To define the protein expression pattern of prostate biopsies, in the present study we investigated biopsy samples from benign prostate hyperplasia (BPH) and PCa patients by two-dimensional gel electrophoresis (BPH n=11 and PCa n=12) and mass spectrometry to identify potential biomarkers which might distinguish the two clinical situations. 2-DE results revealed 88 protein spots expressed differentially among hyperplasia and cancer groups with statistical significance. Interesting spots were analyzed by MALDI-TOF-MS-MS and 79 different proteins identified. The important proteins identified included, Prohibitin and NDRG1 tumor suppressor proteins, HSPs, cytoskeletal proteins, enzymes like DDAH1 and ALDH2. Prohibitin expression was investigated in detail at mRNA level and protein level using immunohistochemistry on prostatectomized specimens. We found that the level of mRNA for prohibitin correlates with the increased amount of protein indicating the involvement of changes at transcriptional level. Furthermore, immunohistochemistry revealed no staining in BPH, moderate staining in prostate intraepithelial neoplasia (PIN) and strong staining in PCa. From the list of differentially proteins compared to PCa, TPD52 is over expressed in prostate cancer and also mRNA estimation by real-time PCR confirmed over expression of TPD52 at transcriptional level in cancer. TPD52 is a protein over expressed in prostate and breast cancer due to gene amplification but its exact physiological function is not investigated in detail. In the present study, we explored the responsiveness of LNCaP cells after dysregulation of TPD52 expression. Transfection of LNCaP cells with specific shRNA giving efficient knockdown of TPD52 resulted in a significant cell death of the carcinoma LNCaP cells. As evidenced by the activation of caspases (caspase-3 and -9) and by the loss of mitochondrial membrane potential, cell death occurs due to apoptosis. The disruption of the mitochondrial membrane potential indicates that TPD52 acts upstream of the mitochondrial apoptotic reaction. To study the effect of TPD52 expression on cell proliferation, LNCaP cells were either transfected with EGFP-TPD52 or a specific shRNA. EGFP-TPD52 overexpressing cells showed an increased proliferation rate whereas TPD52-depleted cells showed a reverse effect. Additionally, we demonstrated that the exogenous expression of TPD52 promotes cell migration via ávâ3 integrin in prostate cancer cells through the activation of protein kinase B (PKB/Akt) pathway. In an attempt to identify new interacting proteins for TPD52, GST pulldown assays provided evidence for the physical interaction between TPD52 and Prx1 in LNCaP cells. Further, immunoprecipitation results confirmed this interaction. Our results demonstrates that protein profiling and mRNA studies can be performed on prostate biopsies. Moreover, our study revealed a significant up-regulation of prohibitin in prostate cancer compared to BPH which may be a potential marker to distinguish PCa and BPH. From the results for functional characterization of TPD52, we conclude that TPD52 plays an important role in various molecular events particularly in morphological diversification and dissemination of PCa. It may be a promising target to investigate further in detail to develop new therapeutic strategies to treat PCa patients. Caspases represent a family of cysteine proteases that are regarded as central executioners of apoptotic cell death. Activation of caspase cascade is an essential prerequisite in the induction of apoptosis in cellular systems. So far, in many tumors caspases were shown to be downregulated while anti-apoptotic Bcl-2 is up-regulated. To get insight in their putative role in PCa progression we determined the expression of caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved (activated) caspases 3 and 6, caspase-9 and antiapoptotic protein Bcl-2 in benign prostate epithelium (BPE) and prostate carcinoma. In the current study 20 prostates were obtained from patients undergoing radical prostatectomy due to PCa. Paraffin embedded prostate whole mounts were cut at (4 µm) and investigated immunohistochemically using anti-mouse monoclonal antibodies directed against caspases 1 and 9, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved caspases 3 and 6, and Bcl-2. In BPE all caspases were localized in the cytoplasm of glandular cells. Comparing BPE to PCa, no differences were found for caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6 as well as caspase-9. Immunostaining for cleaved caspases 3 and 6, however, revealed a statistically significant reduction in PCa compared to non-neoplastic tissue. Whereas in BPE Bcl-2 protein was detected in the basal compartment of epithelial gland cells no immunostaining was seen in PCa. As our results show a decreased amount of activated caspases may be due to the alterations of posttranslational cleavage rather than expression of caspases 3 and 6. This suggests that the modification in their activation pathway could play an important role during PCa progression.
Abirateron ist ein selektiver CYP17A1-Inhibitor und hemmt die Synthese von Steroiden wie Testosteron und Dihydrotestosteron. Molekulare Analysen an unserem PCa Zellkultur-Modell zeigten, dass Abirateron eine Hemmung der Androgen-Rezeptor(AR)-Aktivität bewirkte, die sowohl durch eine unterdrückte Expression des AR selbst als auch durch die Suppression AR-assoziierter Hitzeschock-Proteine (HSP) vermittelt wurde. Von besonderer Bedeutung waren die Analysen der AR-negativen Zelllinie PC-3 deren Proliferation unerwartet ebenso durch Abirateron gehemmt wurde. Diese Beobachtung ließ weitere, AR-unabhängige Wirkmechanismen von Abirateron vermuten. So konnte gezeigt werden, dass Abirateron die Expression von Survivin unterdrückt, möglicherweise durch die Hemmung des Survivin-Bindungspartners HSP90, was eine AR-unabhängige Reduktion der Zellzahl zur Folge hätte. Ein weiterer durch Abirateron regulierter Faktor ist die microRNA miR-1. Diese als Tumorsuppressor charakterisierte miR wurde in Gegenwart von Abirateron induziert und kann unabhängig von der Steroid-Synthese-Hemmung das Wachstum der PCa-Zellen reduzieren. Die Analyse apoptotischer Mechanismen zeigte zudem die Induktion der pro-apoptotischen Faktoren p53, HSP60 und p21, was ebenfalls auf eine antiproliferative Abirateron-Wirkung unabhängig von AR-Signalwegen hinweist. In der Gesamtheit zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Abirateron nicht nur ein Inhibitor der Androgensynthese ist, sondern auch auf davon unabhängige Signal- und Effektorkaskaden wirken kann, welche zu einer Reduktion des Zellwachstums führen. Abirateron ist ein äußerst wirksames Mittel zur Therapie des CRPC. Diese Effektivität liegt möglicherweise in den vielfältigen Wirkmechanismen begründet und könnte die Applikation von Abirateron auch in frühen PCa-Stadien sinnvoll erscheinen lassen.
Low risk prostate cancer does not always necessitate aggressive or invasive intervention and is best monitored through active surveillance, but in daily practice a majority of men seek a more proactive approach. Therefore, tertiary chemoprevention is an attractive option for men seeking a way to slow disease progression. Several natural anti-carcinogens have been identified in soy beans, especially isoflavones. Case series have been published, demonstrating a positive influence of isoflavones on PSA serum levels in prostate cancer.
Therefore, a systematic review of the effect of isoflavones versus placebo on PSA levels in localized prostate cancer was conducted, following the recommendations of the Cochrane Handbook of systematic Reviews. On the whole, the primary aim of this review is to summarize the evidence for the use of isoflavones in localized prostate cancer in terms of PSA response. In total, we identified four relevant RCTs involving 298 treated men. The result of this synopsis was that none of the studies showed a significant effect on serum PSA levels, suggesting that isoflavone intake has no effect on biochemical progression. The influence of isoflavones on overall survival in localized prostate cancer remains unclear.
Nevertheless, there are indications that isoflavones may be clinically beneficial, for example regarding lipid metabolism and cholesterol. Isoflavones represent a safe therapeutic option with few side effects, where further interdisciplinary research is needed.