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Challenge of immunized mice with H. pylori induces protective gastric inflammation that is histologically indistinguishable from chronic H. pylori-associated gastritis in non-immune mice. To identify mechanisms of protective immunity gene expression in the gastric tissue from infected mice and mice vaccinated prior to challenge was compared by DNA array analysis. Message RNA was used to screen over 10,000 murine genes. Major Histocompatibility Complex antigens and IFN-γ dependent GTP binding proteins were strongly upregulated in both infected and immunized/challenged mice compared to naive controls. Differences in gene expression were also observed in novel T cell genes, which were exclusively upregulated in immunized/challenged mice. Both IFN I and II associated genes like the IFN-a/ßreceptor or IFN dependent transcription factors mIRF-1 and ISGF3 were also predominantly expressed in this group. These results were confirmed for several candidate genes by semi-quantitative RT-PCR. Additionally, H. pylori-stimulation of CD4+ T cells from immune mice induced significantly more IFN-γ production than stimulation of cells from infected mice. The present study provides evidence that the inflammatory infiltrate that arises in the gastric mucosa when immunized mice are challenged with H. pylori is associated with specific T cells sets and protein families that are distinct from those present in Helicobacter-associated chronic inflammation. Gene array profiles and in vitro assays indicate that immunized mice are more readily poised than infected mice to promote IFN-γ production and IFN related events and thus promote a strong proinflammatory THi response. This study supports recent findings that an immune response dominated by THi cytokines is essential for protection from H. pylori infection. This insight could facilitate the choice of the appropriate adjuvants for the development of vaccines against H. pylori, which are efficient and safe for use in humans. The mechanisms by which THi cells induce protective immunity or reduce Helicobacter colonization remain poorly understood and will be subject of future research.
Körper und Körpererleben gewinnen in Bezug auf Psychotherapie und Psychopathologie in letzter Zeit an neuer Bedeutung. Die Begriffe zur Körpererleben gelten als teils synonym und teils unschaft. Eine Konzeptualisierung mit dem Begriff 'Körperbild' als zentralem Baustein erscheint vor dem Hintergrund der Literatur am pragmatischsten. Es wird ein neuer Körperfragebogen vorgestellt, der folgende Konstrukte abbilden soll: (1) Körperausgrenzung, (2) Körperbewusstheit und (3) Körperzufriedenheit/-unzufriedenheit. Nach theoriegeleiteter Itemkonstruktion wurden dem Konzept entsprechend 3 Skalen konstruiert, die Skala 1 'Abgrenzung und Körperpsychotizismus' (AKP), die Skala 2 'Körperausdruck' (KAD) sowie die Skala 3 'Körperunzufriedenheit und Scham' (KUS). Eine Item- und Faktorenanalyse wurde an einer Stichprobe von SchwesternschülerInnen (n=134) und einer PatientInnengruppe (n=512); depressive und Angststörungen) durchgeführt. Es bestätigte sich empirisch das Vorhandensein der o. g. Konstrukte. Reliabilität und Validitätzeigten befriedigende bis gute Ergebnisse. Cronbach's a lag zwischen .76 - .90 in der PatientInnenstichprobe und zwischen .61 - .86 in der Normalstichprobe. Die Berechnung der Split-half Reliabilität fiel für beide Gruppen mindestens zufriedenstellend aus (.75 - .84). Es fanden sich signifikante Zusammenhänge (r=.5) zwischen der Skala KUS und allen SCL-90-R-Subskalen; die Skala KAD wies über r = .5 theoriekonform keine signifikanten Korrelationen mit den SCL-90-R-Subskalen auf. Die Skala KUS korrelierte mit r=.77 mit der Skala "Ablehnende Körperbewertung" des Fragebogens zum Körperbild (FKB-20); bei demzufolge hoher Übereinstimmung bildet letztere jedoch kaum den Aspekt "Scham" ab. Die Frauen der Gesamtstichprobe gaben eine stärkere stärkere Körperunzufriedenheit an als Männer. Der Fragebogen muss einer Retest-Reliabilitätsprüfung unterzogen werden; außerdem sollte seine Eignung als Diagnose- und Verlaufsbeobachtungsinstrumentarium bei Körpertherapien unter Beweis stellen.
Expression of the T cell regulatory molecule ICOS (CD278) and LICOS (CD275) on human blood cells
(2006)
Expression of the T cell regulatory molecule ICOS (CD278) and LICOS (CD275) on human blood cells Summary General bacterial infections, which can lead to the clinical picture of sepsis, are a major concern in intensive care units (ICU) and mortality remains high. Recent data have shown that, besides an overreaction of the immune system, also immunosuppression also plays a role in the pathogenesis of sepsis. Immunosuppression has been documented in patients with polytrauma, stroke and burn wounds, which all confer a high risk of severe bacterial infection. Moreover, it has been shown that T cells have an important role in sepsis. A shift of a Th1 dominated T cell response towards a Th2 response has been described as a potential mechanism of immune suppression in patients with sepsis. One of the molecules on the surface of T cells that is involved in the Th2-mediated immune response is the Inducible Costimulator of T cells (ICOS). Its ligand, LICOS, is expressed on the surface of B cells and monocytes. ICOS ligation induces the production of anti-inflammatory cytokines, especially of IL-10. However, nothing is known about the expression of ICOS on T cells and that of LICOS on APCs in patients with severe trauma and stroke. Therefore, in the present study, in a first step, a recombinant human LICOS-Ig fusion protein was generated, which was then used as an antigen for the generation of anti-LICOS monoclonal antibodies. In three fusion experiments, 5,000 primay clones were screened and a single hybridoma was obtained, which produced monoclonal antibodies that specifically reacted with recombinant LICOS, both in form of the LICOS-Ig fusion protein and on the surface of a cell line transfected with a full-length LICOS transgene. Since, it turned out that the antibodies did not bind with high affinity to wild type LICOS, as it is expressed on primary human blood cells, phenotypic analyses were carried out with another anti-LICOS monoclonal antibody, which had become commercially available. Next, the expression of HLA-DR, CD86, LICOS, and ICOS, on the surface of monocytes (CD14+), B cells (CD19+) and T cells (CD3+, CD4+) in whole blood was measured by flow cytometry. Six patients with severe trauma and nine stroke patients were compared with 32 healthy donors. On CD14+ monocytes from healthy donors, the expression levels of HLA-DR and CD86 were over 90%, while the expression of LICOS was much lower (7,5%). In critically ill patients, HLA-DR, CD86 and LICOS expression were strongly reduced. CD86 and HLA-DR were co-regulated, while HLA-DR and LICOS were not. In healthy donors, virtually all B cells expressed HLA-DR and the majority of them co-expressed LICOS (72%), while only a small fraction were CD86+ (14%). After trauma and stroke, HLA-DR, as well as LICOS expression on these cells remained normal; CD86 had a tendency towards being downregulated in most of the trauma patients, while most of the stroke patients exhibited normal CD86+ levels. The levels of HLA-DR and LICOS on T cells in trauma and stroke patients were low and very similar to those of healthy donors. The fraction of CD3+ T lymphocytes or their CD4+ subpopulation, which expressed measurable levels of ICOS (64% and 48%, respectively), did not change after stoke or trauma. However, within the ICOS+ T cell population two subpopulations could be distinguished: ICOSbright and ICOSdim T cells. Interestingly, the ICOSbright subpopulation, but not the ICOSdim and ICOSnegative subpopulations, was markedly increased in all trauma patients and in most of the stroke patients. Given that CD86 was co-regulated with HLA-DR on monocytes it appears that, similar to HLA-DR, CD86 expression could discriminate between patients with a low and high risk of sepsis. In contrast, because of its low basal expression on monocytes and its low signal-noise ratio, LICOS expression levels are not informative. Since ICOS expression on T cells is tightly connected to IL-10 secretion, the high proportion of ICOS bright cells in critically ill patients might contribute to the high IL-10 serum concentrations, which have been reported to be linked to immunosuppression in these patients.
In dieser Pilotstudie wurde der Einfluss eines elektiven chirurgischen Eingriffes auf das Immunsystem untersucht. Eingeschlossen waren 12 Patienten, die einen endoprothetischen Ersatz eines Hüftgelenkes erhielten. Um eine aus dem chirurgischen Eingriff resultierende Infektion auszuschließen, wurden Temperatur, Herzfrequenz und Blutdruck als klinische Parameter präoperativ sowie vom ersten bis zum sechsten Tag postoperativ bestimmt. Für die immunologischen Untersuchungen wurden den Patienten präoperativ sowie am ersten, dritten, sechsten und achten Tag postoperativ Blut entnommen. Die Anteile von Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten wurde im Durchflusszytometer bestimmt. Zur Charakterisierung des Aktivierungsstatus wurde der Phänotyp der T-Zellen (CTLA-4 [CD152], CD25 und HLA-DR) immunzytochemisch analysiert. Die Funktionsfähigkeit der T-Zellen wurde in Proliferationsassays überprüft. Im Rahmen des hier beschriebenen chirurgischen Traumas wurde bei keinem der Patienten eine Infektion mit den erhobenen klinischen Parametern festgestellt. Im peripheren Blut wurden eine Expansion von Granulozyten- und Monozytenpopulationen sowie eine Reduktion der peripheren Lymphozyten respektive der T-Zellen festgestellt. Daraus resultierte aber keine Balanceverschiebung der T-Zellsubpopulationen. Die Expression der Aktivierungsmarker CD25 (früh) und HLA-DR (spät) auf T-Zellen veränderten sich über den gesamten Beobachtungszeitraum nicht signifikant. CD25 zeigte lediglich einen ansteigenden Trend am dritten Tag postoperativ. Im Gegensatz dazu wurde das funktionell inhibitorische Molekül CTLA-4 postoperativ vermehrt detektiert. Die Expression erreichte am sechsten Tag ihr Maximum mit 3,03% gegenüber 0,9% Basisexpression präoperativ. Im Gegensatz dazu waren bereits einen Tag nach dem Eingriff signifikant niedrigere Level an HLA-DR Moleküle auf Monozyten detektierbar. Über den tatsächlichen Aktivierungszustand der verschiedenen T-Zellpopulationen kann abschließend nur spekuliert werden. Die erhöhte CTLA-4 Expression könnte ein Indikator dafür sein, dass dieses inhibitorische Molekül ein sensitiverer Aktivierungsmarker als CD25 oder HLA-DR auf T-Zellen ist. Andererseits lässt sich nicht ausschließen, dass der höhere Anteil CTLA-4+ T-Lymphozyten auf einen Anstieg von regulatorischen T-Zellen im Blut, zum Beispiel durch Gewebsumverteilungen oder Proliferation, zurückzuführen ist. Dafür sprechen auch die durchgeführten Proliferationstest. In diesen konnte am dritten Tag postoperativ eine Verringerung der T-Zellproliferation festgestellt werden. Sie war unabhängig von den Eigenschaften des Stimulanz (Antigen-, APC- oder Kostimulation-abhängig). Es konnte in dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden, ob diese reduzierte Expansion auf der verringerten T-Zellzahl basierte oder ob es sich um eine aktive Immunsuppression handelte. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse für einen geringfügigen Einfluss des chirurgischen Eingriffes auf das Immunsystem. Die genauen Mechanismen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht eindeutig geklärt werden. Allerdings deuten die Ergebnisse aus den Funktionstests darauf hin, dass die T-Zellen schwerfälliger auf Antigene jeglicher Art reagieren. Dies könnte zu einem erhöhten Infektionsrisiko nach Operationen beitragen.
SUMMARY To date, Staphylococcus aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. Beyond this, S. aureus colonises the nasal mucosa of circa 35% of the healthy population, so-called carriers. Importantly, S. aureus nasal carriage is a major risk factor for the development of S. aureus infections, which are commonly caused by the colonising strain. This underlines the importance of host factors for the outcome of S. aureus-host interactions. Despite the clinical importance of nasal carriage, little is known about humoral immune responses triggered by colonisation. Therefore, this thesis was focussed on the anti-staphylococcal antibody responses of S. aureus carriers and noncarriers. Staphylococcal superantigens (SAgs) served as indicator antigens for our studies. SAgs are virulence factors with extraordinary variability in the species S aureus and act as extremely potent T cell mitogens. To date, 19 different SAg gene loci are known in the species S. aureus, but molecular-epidemiological studies on the distribution of these genes are limited. Therefore, we established five multiplex PCRs for the detection of all known SAgs. With this robust and high-throughput technique we analysed the SAg gene patterns of more than 300 isolates, including 107 nasal isolates of S. aureus carriers and 88 blood culture isolates of hospital patients from Western Pomerania. The SAg gene patterns were highly heterogeneous, which can be explained by their localisation on mobile genetic elements (MGE), such as genomic islands, pathogenicity islands, phages and plasmids. Most isolates (~80%) harboured SAg genes, on average five to six, and SAgs of the enterotoxin gene cluster (egc) were by far the most prevalent. Additionally, we observed a strict correlation between the presence of SAg genes and the T cell mitogenic potency of clinical isolates. SAg-encoding MGEs can be distributed by two distinct mechanisms: horizontal transfer by bacteriophages and vertical transmission to daughter cells. To investigate the distribution of SAg genes within the S. aureus population, we determined the clonal relationship of our isolates by spa genotyping. Interestingly, SAg-gene encoding MGEs were not randomly distributed, but rather closely linked to clonal lineages. Each clonal lineage was characterised by defined combinations of SAg genes. These data suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly enhances the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus virulence. Indeed, the comparison of virulence genes within each clonal complex indicated a role in invasiveness for some MGEs, e.g. the exfoliative toxin D-encoding pathogenicity island, while rendering it unlikely for SAgs. It is known that neutralising serum antibodies against the SAgs SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 are frequently present in healthy individuals. However, the neutralising antibody profiles against more recently described SAgs or complex SAg cocktails as secreted by clinical isolates had not been determined so far. Therefore, we screened more than 100 sera for their SAg neutralising capacity with a neutralisation assay. We observed a marked heterogeneity and surprisingly large “gaps” in the neutralising capacity. Interestingly, the egc SAgs were inhibited only rarely (5-10%), whereas between 32 and 86% of the tested sera neutralised “classical” SAgs. This “egc gap” in the SAg-neutralising antibody profiles of healthy individuals was unexpected, since egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. We could demonstrate that the “egc gap” is probably not due to different T cell activating properties of egc SAgs compared to classical SAgs, but rather to a differential regulation of SAg gene expression. S. aureus carriers have an increased risk of developing an S. aureus bacteraemia, which is in most cases caused by the colonising strain. Intriguingly, a large prospective clinical trial revealed a considerably higher mortality in noncarriers with invasive S. aureus strains compared to carriers with invasive disease. To explain these paradoxical findings, we hypothesised that in carriers partial immunity against the colonising strain may contribute to their improved outcome. We used SAgs as strain-specific indicator antigens. Importantly, sera from persistent carriers neutralised SAgs of their colonising strain with significantly higher efficiency than sera from noncarriers. This antibody response was strain-specific, since the antibody response of carriers against other SAgs did not differ from that of noncarriers. Thus, colonisation with S. aureus confers a strong and strain-specific antibody response against staphylococcal SAgs. We suggest that in carriers neutralising antibodies directed against SAgs and other staphylococcal virulence factors confer partial protection during systemic infections. This could explain the better prognosis of carriers with S. aureus bacteraemia compared to noncarriers. Moreover, our data imply that the key to understanding the pathogenesis of S. aureus disease may lie in the identification of host factors rather than bacterial factors. Such host factors could be the immune status and gene polymorphisms that contribute to colonisation, susceptibility to infection and outcome of infection. Finally, while the treatment of S. aureus bacteraemia with pooled immunoglobulins was performed in the past without significant success, our findings on strain-specific antibody profiles suggest that therapies with customised cocktails of monoclonal antibodies could have a higher efficacy.
Histondeacetylase-Inhibitoren (HDI) wirken toxisch auf verschiedene Tumortypen. Sie lockern durch Hemmung von Histondeacetylasen die Chromatinstruktur maligner Zellen. Dadurch können sie Apoptose, Zellzyklusarrest und Differenzierung auslösen. Weiterhin ermöglichen sie die Wiederaufnahme der Transkription von Tumorsuppressorgenen sowie die verstärkte Expression proapoptotischer Proteine, und sie führen zu einer Aktivitätserhöhung von Caspasen. Werden Tumorzellen mit HDI inkubiert, erhöht sich deren Empfindlichkeit gegenüber dem tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), so dass in Tumorzellen, die vorher nahezu resistent gegen TRAIL waren, sehr effektiv Apoptose ausgelöst wird. Natural killer cells (NK-Zellen) sezernieren nach Stimulation mit Interleukin 2 (IL-2) TRAIL und exprimieren das Molekül auf ihrer Zelloberfläche. Deshalb sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob eine Vorbehandlung mit HDI die Empfindlichkeit von Tumorzellen für zytolytische Effekte von Immunzellen erhöht. Dafür wurden Prostatakarzinomzellen (PC3) und Medulloblastomzellen (DAOY) 24 Stunden mit verschiedenen HDI vorinkubiert und dann mit IL-2 stimulierten peripheral blood mononuclear cells (PBMC) konfrontiert. IL-2 stimulierte PBMC enthalten aktivierte cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und aktivierte NK-Zellen. Beide Zellpopulationen können prinzipiell in Tumorzellen Apoptose auslösen. Verwendete HDI waren suberoyl anilide hydroxamic acid (SAHA), Natriumbutyrat (NaB) und das Benzamid MS-275. Um deren Wirkungen mit einem etablierten Zytostatikum zu vergleichen, wurde Vincristin als Kontrolle eingesetzt. Die quantitative Bestimmung der Zahl überlebender Tumorzellen erfolgte 24 bzw. 48 Stunden nach der Konfrontation mit den Zytokin-aktivierten Blutzellen in einem durchflusszytometrischen Verfahren. Propidiumjodid wurde zur Identifizierung toter Tumorzellen verwendet. Die HDI SAHA, NaB und MS-275 hatten allein eine dosisabhängige zytotoxische Wirkung auf die getesteten Tumorzelllinien. In Kombination mit den aktivierten PBMC zeigten die HDI überadditive und manchmal sogar synergistische zytolytische Effekte. Dagegen wirkten Vincristin und aktivierte PBMC stets nur additiv. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die in klinischen Studien beobachteten tumortherapeutischen Wirkungen von HDI neben ihrer direkten zytotoxischen Wirkung teilweise auf einer synergistischen Wirkung mit Effektormechanismen des Immunsystems beruhen könnten.
Die Rolle der CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis - Untersuchungen in einem Peritonitismodell der Maus
(2007)
Generalisierte bakterielle Infektionen, auch Sepsis genannt, sind trotz intensivmedizinischer Behandlung mit einer sehr hohen Letalität verbunden. Um kausale Therapiestrategien zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen, insbesondere der Reaktionen des Immunsystems, notwendig. Da die Sepsis ein hoch komplexer Vorgang ist, an dem der gesamte Organismus beteiligt ist, sind grundlegende Untersuchungen im Tiermodell dafür unverzichtbar. Nach aktuellen Modellvorstellungen verläuft die Immunreaktion bei einer Sepsis typischerweise in zwei Phasen: Auf eine überschießenden Entzündungsantwort folgt eine Phase der generalisierten Immunparalyse. Die Rolle des angeborenen Immunsystems bei diesen Reaktionen ist gut dokumentiert, jene des adaptiven Immunsystems in der Pathogenese der Sepsis ist dagegen wenig untersucht. Ihr wurde zwar eine wichtige Rolle in der späten Phase zugesprochen, denn die Lymphozytenapoptose trägt zur Entstehung einer Immunparalyse bei. Da adaptive Immunreaktionen jedoch einige Zeit in Anspruch nehmen, wurde eine wichtige Rolle in der frühen Phase des hoch akuten Krankheitsbildes Sepsis für unwahrscheinlich gehalten und deshalb bisher kaum betrachtet. Wir hatten jedoch aus Vorversuchen Hinweise auf eine sehr schnelle T-Zellbeteiligung bei der Sepsis. Deshalb lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Aufklärung der Rolle von CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis. Diese wurde in einem etablierten Sepsismodell der Maus untersucht, der Colon ascendens Stent-Peritonitis (CASP). Das Modell wurde entwickelt, um die klinische Situation von Patienten, bei denen es aufgrund der Insuffizienz einer chirurgischen Naht im Magen-Darm-Trakt zur Entwicklung einer diffusen Peritonitis kommt, möglichst genau abzubilden. Überraschend beobachteten wir bei CASP innerhalb weniger Stunden eine starke Induktion der Expression von CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4) auf den CD4+ T-Lymphozyten. Die Expression dieses Moleküls wird nach der Aktivierung von T-Zellen induziert. Dies lässt auf eine Beteiligung der CD4+ T-Zellen in einem frühen Stadium der Erkrankung schließen. Eine Depletion der CD4+ T-Zellen im Vorfeld der CASP-Operation mit dem monoklonalen Antikörper GK1.5 führte zu einer effektiveren Beseitigung der Bakterien aus dem Peritoneum, zu einer geringeren systemischen Verbreitung der Erreger und zu einem deutlich verbesserten Überleben der Tiere. Damit verbunden war eine verstärkte Einwanderung von Zellen des angeborenen Immunsystems in das Peritoneum. Dies impliziert, dass bei einer systemischen Dissemination kommensaler Bakterien die CD4+ T-Zellen die lokale Reaktion des angeborenen Immunsystems inhibieren, in diesem Tiermodell mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Die Blockade der T-Zellrezeptorvermittelten Signalgebung durch Tacrolimus (FK506) hatte dagegen keinen Einfluss auf das Überleben der Peritonitis. Dies zeigt, dass die Effekte der CD4+ T-Zellen zumindest teilweise unabhängig von der T-Zellrezeptorvermittelten Antigenerkennung sein müssen. Eine Blockade von des inhibititorischen T-Zelloberflächenmoleküls CTLA-4 bewirkte eine starke Induktion von ICOS (inducible co-stimulator) sowie eine deutliche Inhibition der Sekretion von IL-10. Die verstärkte T-Zellaktivierung und Hyperinflammation ging einher mit einem Überlebensnachteil. Zur Untersuchung der Langzeitkonsequenzen, die eine Sepsis nach sich zieht, wurden die Tiere bis zu drei Monate nach der Operation untersucht. Die Peritonitis war mit massivem Zelltod in Thymus, Milz und mesenterialen Lymphknoten assoziiert, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. Die systemische Infektion führte innerhalb kurzer Zeit zu einem fast vollständigen Verlust des Thymus, doch 14 Tage nach der Operation war das Organ wieder unauffällig. In der Milz hingegen setzte die Apoptose später ein und war nicht so ausgeprägt, hielt aber länger an. Eine sich anschließende Hyperplasie der Milz war drei Monate nach Induktion der Peritonitis am stärksten und ein Zeichen für eine noch nicht abgeschlossene Immunreaktion. Neben der Aktivierung von T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung wurde auch etwa eine Woche nach der Operation eine Reaktion von T-Zellen anhand der Änderung von Oberflächenmolekülen und der Sekretion von Zytokinen beobachtet. Diese Aktivierung erfolgte aufgrund der Kinetik vermutlich auf dem „klassischen“ Weg. Das Muster der Zytokinausschüttung lässt vermuten, dass nach CASP eine Th1-Antwort überwiegt. Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Dissertation ist, dass nach diffuser Peritonitis ein Immungedächtnis aufgebaut wird. Es entwickelten sich funktionsfähige Keimzentren, und im Serum ließen sich ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Antikörpern der Klassen IgM und IgG messen. Die Bildung von T-Gedächtniszellen ging damit einher. Erste Immunisierungsversuche mit TNP-KLH zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach CASP deuten darauf hin, dass die Peritonitis weder die Entwicklung einer primären Immunantwort verhinderte noch ein bereits etabliertes Immungedächtnis störte. Im multifaktoriellen Prozess einer Sepsis spielen folglich auch die T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. Dies sollte bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien berücksichtigt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Population der CD4+ T-Lymphozyten sehr heterogen ist und verschiedene Funktionen bei der Abwehr bakterieller Infektionen ausübt. Deshalb ist die Elimination der Gesamtheit der CD4+ T-Zellen höchstwahrscheinlich keine Behandlungsoption bei der Sepsis, obwohl sie in dieser Arbeit beim Tiermodell einen deutlichen Überlebensvorteil bewirkte. Es ist jetzt notwendig, die Funktionen der verschiedenen T-Zellsubpopulationen bei generalisierten bakteriellen Infektionen im Detail zu untersuchen. Die Herausforderung liegt in der Identifikation von wichtigen Kontrollpunkten der T-Zellen, die therapeutischen Eingriffen zugänglich sind. Bei diesen Interventionen muss die Gefahr einer starken Dysbalance des Immunsystems vermieden werden. Es ist ebenso wichtig zu beachten, dass die Reaktion des Immunsystems nicht nach der akuten Phase einer Sepsis endet, sondern Monate - möglicherweise sogar Jahre - danach andauert, wie in dieser Arbeit gezeigt wird. Dies könnte erklären, warum sich bei Patienten, die diese Erkrankung überlebt haben, bis zu fünf Jahren später eine signifikant erhöhte Mortalität epidemiologisch nachweisen lässt. Eine besseres Verständnis der immunologischen Langzeitkonsequenzen einer Sepsis ist die Voraussetzung für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Senkung der Mortalität bei Überlebenden dieser schweren Erkrankung. In einer prospektiven klinischen Pilotstudie sollte überprüft werden, ob die aus den tierexperimentellen Versuchen gewonnenen Befunde auch für den Menschen Relevanz haben könnten. Hierzu wurde die Expression von CTLA-4 als Parameter einer Beteiligung von T-Zellen bei Patienten untersucht, die sich einem großen abdominalchirurgischen Eingriff unterzogen, welcher mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer Sepsis verbunden war. Bei allen Patienten zeigten sich eine teilweise dramatische Abnahme der CD3+ T- Zellen, bei dem überwiegenden Teil der Patienten war ein Anstieg der Expression von CTLA-4 zu beobachten. Mit der Induktion des Moleküls einhergehend waren Änderungen der klinischen Parameter, der Zusammensetzung der T-Zellpopulationen und deren Aktivierungszustand, so dass die Bestimmung der Expression von CTLA-4 für die Beurteilung des Immunstatus der Patienten nützlich sein könnte. Da die Messung jedoch sehr aufwändig, zeitintensiv und schwer standardisierbar ist, erscheint sie aktuell ungeeignet für die Routinediagnostik.
Pretransplant Tolerance Induction Reduces the Islet Mass Required to Reverse Diabetes in NOD Mice
(2007)
Islet transplantation can restore normoglycemia in diabetic patients. However, its application is limited by the high number of islets required to reverse diabetes. As the mass and potency of most human islet preparations are marginal, a large impact on the applicability of islet transplantation is expected from the implementation of strategies that improve engraftment of these islet preparations. The roles of adaptive immunity and immunosuppression on islet engraftment are not well studied. Therefore, the effects of currently used immunosuppression with antilymphocyte serum, tacrolimus and sirolimus on islet engraftment were separated from their impact on immunity and diabetes reversal rates were compared after islet allotransplantation in immunosuppressed and chimeric, non-immunosuppressed NOD mice. Both strategies prevented rejection of islet allografts and reduced the frequency of donor-specific, IFN-gamma-secreting T cells. However, in order to achieve stable diabetes reversal with a probability of about 80% after islet allotransplantation in diabetic NOD mice, a fourfold higher islet mass (400 islets) was required in immunosuppressed recipients, compared with non-immunosuppressed recipients made tolerant pretransplant by induction of mixed hematopoietic chimerism (100 islets). The failure of immunosuppressed mice to become normoglycemic after low-dose islet transplantation primarily resulted from the inhibitory effects of tacrolimus combined with sirolimus on islet engraftment and not from the inhibitory effects of this combination on islet graft function. These data suggest that immunotherapeutic strategies that control adaptive immunity without interfering with islet neovascularization or other processes critical to islet engraftment are likely to improve the success rate of marginal mass human islet allografts.
Chronischer psychischer Stress, der in einem Modell aus kombiniertem Immobilisations- und akustischem Stress realisiert wurde, führt bei weiblichen BALB/c-Mäusen zu einem Anstieg der Plasma-Kortikosteronkonzentration, Immunsuppression und depressionsähnlichem Verhalten. Eine durch chronischen psychischen Stress verursachte Darmbarrierestörung ruft über die Translokation bakterieller Produkte eine systemische IDO-Aktivierung hervor. Frühere Experimente zeigen, dass IDO-Hemmung durch 1-MT die stressinduzierte Immunsuppression und das depressive Verhalten, aber auch den Glukokortikoidanstieg im Plasma der Mäuse verhindert. Zur Klärung der Frage, welche Stresseffekte auf Glukokortikoide und welche auf eine IDO-Aktivierung zurückzuführen sind, wurde weiblichen BALB/c-Mäusen während chronischer Stressexposition der Glukokortikoidrezeptor-blocker RU486 injiziert und die Wirkungen von RU486 denen von 1-MT in ausgewählten Read-out-Systemen gegenübergestellt. Bei der Etablierung der Interventionsbehandlung mit RU486 tauchten schwerwiegende Probleme auf: Die tägliche Injektion des Medikaments führte zu einer Modifizierung der HPA-Achsenaktivität nicht gestresster Mäuse im Vergleich zu nicht behandelten, ungestressten Tieren. Außerdem wurde deutlich, dass die Wahl des Lösungsmittels einen Einfluss auf die Ergebnisse hatte. Jede Manipulation an Versuchstieren ist folglich ein ernstzunehmender Störfaktor in Tiermodellen. Die Ergebnisse dieses Mausmodells wurden nach der Wirksamkeit der Inhibitoren 1-MT und RU486 in drei Blöcke eingeteilt: Stresseffekte, die sowohl durch 1-MT als auch durch RU486 in ähnlicher Weise beeinflusst wurden, sind durch einen HPA-Achsen-vermittelten Glukokortikoidanstieg vermittelt. Dazu zählen die Gewichtsabnahme und depressionsähnliches Verhalten. Ein Stresseffekt, der nur durch RU486, aber nicht durch 1-MT vermindert wurde, ist die durch chronischen Stress vermittelte Apoptose der Leukozyten im Blutkreislauf und der Thymozyten. Dieser Zellverlust ist unabhängig von IDO-Aktivität ausschließlich Glukokortikoid-vermittelt. Überraschenderweise konnte die stressbedingt verminderte Fähigkeit zur Bekämpfung einer experimentellen Infektion ausschließlich durch 1-MT-Behandlung wieder hergestellt werden. Tryptophanmangel und Kynurenine beeinträchtigen die bakterielle Abwehr folglich stärker als Glukokortikoide. Ob Glukokortikoide ihrerseits einen Einfluss auf die IDO-Aktivität haben, konnte nicht abschließend geklärt werden.
The human antibody response to experimental colonization with Staphylococcus aureus NCTC8325-4
(2008)
The four main work packages and their most important results are briefly described as following. 1. Characterization of the extracellular proteome of S. aureus NCTC8325-4 Reference maps of the extracellular proteins of S. aureus NCTC8325-4 were produced at pH ranges 6-11 and 4-7. In total, 119 (pH 6-11) and 177 (pH 4-7) protein spots were identified, corresponding to 48 and 114 proteins, respectively. Among them were many well-known virulence factors such as alpha-hemolysin (Hla), beta-hemolysin Hlb, gamma-hemolysin subunits (HlgA-C), hyaluronate lyase (HysA) and staphylococcal superantigen-like protein 11 (Ssl11). We also detected various extracellular enzymes, which can cause tissue degradation and are involved in nutrient acquisition, for example, autolysin (Atl), glycerol ester hydrolase (Geh), lipase (Lip), thermonuclease (Nuc), several serine proteases SplA-F (SplA-F), V8 protease (SspA), cysteine protease (SspB), staphopain thiol proteinase (88195808, SspP). Many of these proteins probably also contribute to the virulence of S. aureus. 2. Optimization of a 2-D immunoblot (IB) method for the comprehensive investigation of IgG binding to S. aureus extracellular proteins (strain NCTC8325-4) The immune proteome of S. aureus NCTC8325-4 was revealed by probing 2-D blots of S. aureus extracellular proteins at the two pH ranges 6-11 and 4-7 with a pool of sera from 16 volunteers. IgG binding was detected with high sensitivity using a peroxidase-coupled secondary Ab in combination with an ECL-substrate. With application of the software package Delta2D, we could clearly define 66 immune reactive spots on the immunoblots (IBs) of pH range 6-11 and 38 spots on IBs of pH range 4-7. 72 of these 104 immune reactive spots could be identified by matching the IBs with the protein reference maps. These spots represented 36 identified proteins, many of which are known virulence factors, or they are involved in bacterial cell wall biosynthesis and degradation. Generally, the most abundant proteins were also highly immune reactive, but there was no strict correlation between protein abundance and immune reactivity. Some low abundance proteins, especially basic proteins, showed high immune reactivity on 2-D IBs, for example, Atl, 88195808 (SspP) and iron-regulated surface determinant protein A (IsdA). On the other hand, we observed proteins, which were present in large amounts but did not bind IgG such as peptidoglycan hydrolase (LytM) and a hypothetical protein 88193909 (SAOUHSC_00094). 3. Determination of the anti-staphylococcal Ab profiles of S. aureus carriers and noncarriers Comparing the serum IgG binding patterns of sera from the 16 individual volunteers, we observed pronounced heterogeneity in total IgG binding, spot patterns and spot intensities. Five spots were stronger in carriers than in noncarriers (P< 0.05, Mann-Whitney U test). These spots represent IgG binding to SspA, SspB, IsaA, and two hypothetical proteins. A principal component analysis based on differential IgG binding to these spots showed that the carriers were more closely related to each other than the noncarriers, but that they could not be clearly separated from the noncarriers. 4. Does experimental colonization induce changes of the anti-staphylococcal Ab profiles? Finally, we tested whether symptom-free experimental colonization of the 16 volunteers with S. aureus NCTC8325-4 elicited an IgG response. When we compared sera obtained before colonization with those taken 4 weeks after the inoculation with the laboratory S. aureus strain, we did not observe major changes in the Ab patterns. We conclude that short- term colonization with a strain of low virulence does not suffice to induce an Ab production, which is comparable to that present already before the colonization. Thus, either long term high density colonization is required, or as we consider most likely, the adaptive immune response is primarily triggered by (minor) S. aureus infections. Taken together, in this work we have separated the soluble proteins from complex extracellular S. aureus protein extracts with good reproducibility, large coverage (pH 6-11 and 4-7) and high resolution. With application of an ECL substrate, our 2-D immunoblotting procedure resulted in the highly sensitive detection of IgG binding over a wide range of signal intensities. The most important finding with this technique was the pronounced variability of anti-staphylococcal Ab profiles in healthy adults. This could well explain differences in susceptibility to S. aureus infection and its complications. The Ab responses are presumably triggered by long-term colonization or, more likely, by minor infections with S. aureus, since experimental nasal colonization of healthy volunteers with a bacterial strain of low virulence did not induce impressive changes in the Ab profiles.
Effect of surgical intervention on the activation status of circulating monocytes and T-cells
(2009)
Major surgery causes alterations in immune function which results in immune suppression in post surgical patients. Deactivation of monocytes in these patients is characterised by the reduced ability of these cells to produce pro-inflammatory cytokines on stimulation with LPS in vitro and by markedly reduced HLA-DR expression. Immune suppression in patients with systemic inflammation has also been associated with a high level of apoptosis in both the circulating T and B cell populations. In addition post surgical T cells have a reduced capacity to proliferate ex vivo in response to co-ligation of the T cell receptor and CD-28. Considering these impairments of immune system, this study aimed to define the extent of immune modulation in both innate and adaptive system in a cohort of surgical patients. Measurment of the level of HLA-DR expression of monocytes in these patients showed a considerable change in monocyte phenotype in the immediate post operative period. In line with previous work, all patients showed a considerable reduction in monocytic surface HLA-DR expression which persisted for many hours and those who had post surgical septic complications showed the most severe reduction. Importantly, patients with minor surgical intervention also exhibited decreased HLA-DR expression. Gene expression analysis of monocyte in these patients showed the up-regulated transcripts of genes involved in extravasation and realignment of the cytoskeleton. Analysis of periperal T cell demonstrated a significant reduction in their number in the circulation and a sharp raise in the number of apoptotic T –cells in the immediate post surgical period. Microarray analysis of T cells from patients who developed sepsis and patients with an uneventful recovery within the post-operative period (3 days) showed a substantial reduction in the transcriptional activity of many genes in both groups. However, this down regulation of T cell transcriptional activity appears to be a rather broad and non specific effect since it is not restricted to particular functional pathways. Real time PCR analysis of both the CD4+ and CD8+ populations using selected down-regulated genes showed that the change in transcriptional profile is equally evident both in CD4+ and CD8+ T-cells. The cause of this transient immune depression following surgery remains to be established and it may represent an important enabling factor which contributes to the development of post surgical infections and inflammatory complications.
Chronischer psychischer Stress, der durch die wiederholte Kombination von akustischem und Immobilisationsstress erzeugt wurde, führt bei BALB/c-Mäusen zu einer Immunsuppression. Im Verlauf der chronischen Stressbehandlung zeigen BALB/c-Mäuse außerdem ein reduziertes Erkundungsverhalten sowie verminderten Kontakt zu den Artgenossen, was einem depressionsähnlichen Verhalten entspricht. Die Immunsuppression und die Verhaltensänderungen werden auf eine stressbedingte Darmbarrierestörung mit bakterieller Translokation und systemischer IDO1-Aktivierung zurückgeführt. Um zu prüfen, ob die beobachteten Veränderungen mausstammspezifische Stresseffekte darstellen, wurden C57BL/6- und BALB/c-Mäuse, die generelle Unterschiede in der Qualität ihrer Immunantwort aufweisen, in einer einzelnen Stresssitzung (akutes Stressmodell) oder in neun aufeinanderfolgenden Stresssitzungen (chronisches Stressmodell) verglichen. Nach akuter Stressexposition kam es, ebenso wie bei BALB/c-Mäusen, bei C57BL/6-Mäusen zu einer bakteriellen Translokation in die mesenterialen Lymphknoten, womit auch bei C57BL/6-Mäusen eine stressbedingte Schädigung der Darmbarriere aufzutreten scheint. Eine systemische IDO1-Aktivierung infolge bakterieller Translokation erfolgte im akuten Stressmodell unabhängig vom Mausstamm. Allerdings hielt der Tryptophanabbau entlang des Kynureninweges in C57BL/6-Mäusen kürzer an als in BALB/c-Mäusen. Im chronischen Stressmodell war nur bei BALB/c-Mäusen ein aktivierter Kynureninstoffwechsel messbar. Da keine Hinweise auf einen aktivierten Tryptophanabbau in chronisch gestressten C57BL/6-Mäusen gefunden wurden, kann vermutet werden, dass diese Mäuse keine Immunsuppression entwickeln. Desweiteren könnten damit die unterschiedlichen Verhaltensänderungen während chronischer Stressexposition erklärt werden. Die Entwicklung eines depressionsähnlichen Verhaltens im Verlauf des chronischen Stressmodells wurde nur bei BALB/c-Mäusen aber nicht bei C57BL/6-Mäusen beobachtet. Bei chronisch gestressten C57BL/6-Mäusen wurde jedoch eine deutlich vermehrte Kot- und Urinabgabe nachgewiesen, was auf eine durch den Sympathikus getriebene Pathologie der Stressantwort bei diesen Mäusen hindeuten könnte. Eine stressbedingte Aktivierung der HPA-Achse, gekennzeichnet durch ansteigende Plasmakortikosteronspiegel sowie durch eine periphere Leuko- und Lymphozytopenie, konnte bei beiden Mausstämmen sowohl im akuten als auch im chronischen Stressmodell nachgewiesen werden. Während der akuten Stressantwort eine aktivierende Funktion bezüglich des Organismus zukommt, die meist keine gefährlichen Auswirkungen hinterlässt, kann eine chronische Stressexposition hingegen das Individuum schädigen. Dass sich dabei die stressbedingten Konsequenzen zwischen verschiedenen Individuen unterscheiden, konnte durch die vergleichenden Untersuchungen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen gezeigt werden.
Histondeacetylase-Inhibitoren (HDIs) bilden eine Gruppe relativ neuer vielversprechender anti-neoplastischer Wirkstoffe. Sie hemmen die Funktion der Histondeacetylasen und greifen somit in die Regulation der genomweiten Transkription ein. HDIs besitzen direkte tumortoxische Wirkung, lassen nicht transformierte Zellen jedoch weitgehend unbeeinflußt. Darüber hinaus verstärken sie die zytotoxischen Aktivitäten einer Vielzahl anderer Tumortherapeutika und sensibilisieren Tumorzellen für die zytolytischen Effekte aktivierter NK-Zellen. Die Einbindung des Immunsystems in die Tumortherapie wirft jedoch die Frage nach einer direkten, möglicherweise hemmenden Wirkung der HDIs auf Immunzellen auf. In dieser Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus dem Synergismus von HDIs und aktivierten NK-Zellen zugrunde liegt, ob HDIs Tumorzellen auch für die zytolytischen Effekte tumorspezifischer T-Zellen sensibilisieren und welche direkte Wirkung HDIs auf Immunzellen ausüben. Alle Arbeiten wurden in vitro mit humanen Zellen/Zellinien durchgeführt. Als HDIs kamen Suberoylanilid-Hydroxamsäure (SAHA) und Natriumbutyrat (NaB) zum Einsatz. Aufbauend auf ein bereits etabliertes in-vitro-Testsystem, wurde gezeigt, daß nach IL-2-Aktivierung von PBMCs im wesentlichen NK-Zellen Tumorzelltod induzierten. Dabei war die Funktionsfähigkeit der aktivierenden NK-Rezeptoren NKG2D, DNAM-1 und der NCRs kritisch für Erkennung und Lyse der Tumorzellen, wie der Einsatz blockierender Antikörper deutlich machte. Sowohl bei unbehandelten als auch bei HDI-behandelten Tumorzellen führte die Maskierung all dieser Rezeptoren zu einer vollständigen Inhibition der Tumorzellyse, d.h. die Induktion alternativer aktivierender NK-Liganden durch HDIs wurde ausgeschlossen. Wurden nur ein oder zwei aktivierende Rezeptoren maskiert, ergab sich hingegen ein Unterschied zwischen unbehandelten und HDI-behandelten Tumorzellen: Der protektive Effekt der Maskierung fiel bei HDI-behandelten Tumorzellen deutlich geringer aus. HDIs erhöhen also die Redundanz der schon zuvor involvierten aktivierenden NK-Rezeptoren. Oberflächenfärbungen legten nahe, daß diese Redundanzerhöhung – und somit die Sensibilisierung der Tumorzellen – auf die HDI-induzierte Heraufregulation aktivierender NK-Liganden auf Tumorzellen zurückzuführen ist. Ein Einfluß der HDIs auf die Expression der Todesrezeptoren Fas, DR4 und DR5 wurde ausgeschlossen. Um die Untersuchungen auf das Zusammenwirken von HDIs und zytotoxischen T-Zellen auszuweiten, wurde ein Primingsystem zur Generation tumorspezifischer T-Effektorzellen etabliert. Allogene Spender-T-Zellen wurden mit Hilfe CD86-transfizierter Zellen der Melanomzellinie SkMel63 geprimt, d.h. in diesem System dienten Alloantigene als Ersatz für Tumorantigene. Starke T-Zellproliferation und die Sekretion T-Zell-spezifischer Zytokine zeigten ein erfolgreiches Primen der T-Zellen an. Geprimte tumorspezifische T Zellen lysierten Wildtyp-SkMel63-Zellen effektiv ohne die Notwendigkeit eines Ko-Stimulus. Die Vorbehandlung mit SAHA sensibilisierte die SkMel63-Zellen für die Zelltodinduktion durch T-Zellen. Eine mögliche Ursache für den Synergismus könnte auch hier die verstärkte Expression der NKG2D-Liganden sein, da NKG2D auf T-Zellen als ko-stimulierender Rezeptor fungiert. Da funktionsfähige Immunzellen eine Voraussetzung für die beschriebenen sensibilisierenden HDI-Effekte sind, wurde auch die direkte Wirkung der HDIs auf NK- und T-Zellen untersucht. Tumortoxische Konzentrationen von SAHA verhinderten ihre aktivierungsinduzierte Proliferation und Zytokinsekretion, beeinträchtigten die CD107a-Mobilisierung und hemmten die zytolytische Aktivität der Immunzellen. Diese Beobachtungen spiegeln zwei Phänomene wider: Erstens übt SAHA eine zytotoxische Wirkung auf die Immunzellen aus, und zweitens inhibiert SAHA die IL-2-Aktivierung von NK-Zellen sowie das Primen tumorspezifischer T-Zellen. In starkem Gegensatz dazu wurden NK- und T-Zellen, die in Abwesenheit von HDIs aktiviert wurden, resistent gegen deren zytotoxische und immunsuppressive Wirkung und zeigten später – auch in Anwesenheit hoher HDI-Konzentrationen – normale zytolytische Aktivität. Die Sensibilität von NK- und T-Zellen für suppressive HDI-Effekte hängt also von ihrem Aktivierungszustand ab, und nur vollständig aktivierte Immunzellen sind resistent gegen HDIs. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ein großes therapeutisches Potential der Kombination von HDIs und immunstimulierender Behandlung auf. Als eine vielversprechende therapeutische Strategie erscheint daher ein sequentieller Ansatz, bestehend aus der Immunstimulation der Tumorpatienten gefolgt von der HDI-vermittelten Sensibilisierung der Tumorzellen für die Angriffe des patienteneigenen Immunsystems.
Staphylococcus (S.) aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. In contrast, about 35% of the healthy population are colonized with S. aureus in the anterior nares. The genetic make-up of this species is highly diverse. Mobile genetic elements comprise about 15% of the S. aureus genome. They encode many virulence factors like the 21 different known staphylococcal superantigens (SAgs), highly potent activators of T lymphocytes. Besides their well known causative role in food poisoning and toxic shock syndrome, information about SAg involvement in pathogenesis is limited. On the other hand, the human host and its immune response are also highly diverse. This study focuses on SAgs, because they are potent virulence factors that are highly diverse and therefore mirror of the variability of the species S. aureus. The goals of this work were (i) to identify virulence determinants by comparing the prevalence of SAg genes and phages among colonizing and invasive S. aureus isolates and to correlate it with the clonal background, (ii) to determine the prevalence and the development of anti-SAg antibodies in healthy S. aureus carriers and noncarriers as well as in bacteremia patients, and (iii) to elucidate the reasons for the selective lack of neutralizing serum antibodies specific for a subgroup of SAgs, the egc SAgs. In search for a molecular-epidemiological associations between SAgs and different diseases caused by S. aureus we investigated the distribution of SAg genes and/ or bacteriophages and correlated this with the clonal background, determined by spa genotyping. The analysis of more than 700 S. aureus isolates from nasal colonization, bacteremia or furunculosis revealed that SAg-encoding mobile genetic elements and bacteriophages were strongly associated with the clonal background. As a consequence, each clonal lineage was characterized by a typical SAg gene and phage repertoire. Therefore, we suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly increases the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus pathogenesis. However, we found no association of SAg genes with bacteremia or furunculosis. While functional neutralization assays closely mimic the protective action of anti-SAg antibodies in vivo, they are labor-intensive and time-consuming. A fast and easy method for the simultaneous quantification of antibody binding to multiple staphylococcal antigens is the Luminex® technology. Using serum samples from persistent carriers and noncarriers we showed a strong correlation between antibody binding and neutralizing capacity against the SAg TSST-1. This assay confirmed the astonishing lack of antibodies against egc SAgs in healthy carriers and noncarriers, which was previously described by Holtfreter and coworkers. Since colonization is probably not sufficient to induce a robust antibody response as revealed by experimental colonization with S. aureus, we propose that (minor) infections are required to induce the high titers of non-egc SAg-neutralizing antibodies in healthy adults. To test this, we investigated whether SAgs elicit a neutralizing antibody response during S. aureus bacteremia. At the acute phase of the disease most patients already had neutralizing antibodies against non-egc SAgs, and antibody titers frequently increased during infection. Notably, egc SAgs did not elicit a boost or de novo generation of specific antibodies. The “egc gap” in the antibody response, which has now been shown in healthy adults, as well as following systemic infection with S. aureus, is astonishing. After all, egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. In search for an explanation, the intrinsic properties of three recombinant egc (SEI, SElM, SElO) and non-egc SAgs (SEB, SElQ, TSST-1) were compared in depth. Egc and non-egc SAgs were very similar with regard to induced T cell proliferation, cytokine profiles, and gene expression of human immune cells. However, there was a striking difference in the regulation of the two groups of SAgs by S. aureus in bacterial culture. We conclude that the differential regulation of egc and non-egc SAg has an impact on the immune response. But how are SAgs regulated by S. aureus during its interaction with the host? Up until now most research on regulation of virulence factors has been performed in vitro. The immune response can help to shed light on this problem, because it is an exquisitely specific sensor for the exposure to different antigens. The high prevalence of neutralizing serum antibodies against non-egc SAgs indicates that most healthy adults have been exposed to these toxins during their encounters with S. aureus. For egc SAgs this remains an open question. However, initial data indicate that the egc SAg genes are transcribed during nasal colonization.
Regulatorische CD4+Foxp3+ T-Zellen (Tregs) beeinflussen die Immunabwehr gegen verschiedene Mikroorganismen. Jedoch ist ihre Rolle in der bakteriellen Sepsis kritisch zu sehen. Deshalb wurden in dieser Arbeit DEREG-Mäuse benutzt um die Rolle von CD4+Foxp3+ Tregs in der Colon Ascendens Stent Peritonitis, einem Modell der postoperativen abdominellen Sepsis, zu beleuchten. DEREG-Mäuse exprimieren einen Diphtherie-Toxinrezeptor und eGFP unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus, so dass natürliche Tregs visualisiert und selektiv depletiert werden konnten. Sepsis führte zu einer raschen Aktivierung von Tregs und zu einer Verschiebung des Treg/Effektor-T-Zellen (Teff) Verhältnisses in der Milz. Unter nicht-septischen Bedingungen führte die Treg-Depletion zu einer verstärkten Aktivierung von Teff und zu erhöhten Zytokinkonzentrationen. Dies verstärkte die Krankheitsschwere nach Sepsisinduktion. 20 Stunden nach Sepsis zeigten jedoch depletierte und nicht-depletierte Mäuse eine gleich starke inflammatorische Reaktion. Auch der Influx von Immunzellen ins Peritoneum, die Begrenzung der bakteriellen Dissemination, sowie die Letalitätsraten waren durch die Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen unverändert.
Postoperative Immune Suppression in Visceral Surgery: Characterisation of an Intestinal Mouse Model
(2011)
Background: Postoperatively acquired immune dysfunction is associated with a higher mortality rate in case of septic complications. As details of this severe clinical problem are still unknown, animal models are essential to characterise the mechanisms involved. Methods: Mice were laparotomised and the small intestine was pressed smoothly in antegrade direction. For extension of trauma, the intestine was manipulated three times consecutively. Following this, the ex vivo cytokine release of splenocytes was determined. The degree of surgical trauma was analysed by detection of HMGB1 and IL-6 in serum and by neutrophil staining in the muscularis mucosae. Results: We adapted the previously described animal model of intestinal manipulation to provide a model of surgically induced immune dysfunction. Following intestinal manipulation, the mice showed elevated serum levels of HMGB1 and IL-6 and increased infiltration of granulocytes into the muscularis mucosae. Ex vivo cytokine release by splenocytes was suppressed in the postoperative period. The degree of suppression correlated with the extent of surgical trauma. Conclusions: In this study, we describe a surgically induced immune dysfunction animal model, in which a significant surgical trauma is followed by an immune dysfunction. This model may be ideal for the characterisation of the postoperative immune dysfunction syndrome.
Staphylococcus (S.) aureus besiedelt bei 30 % der gesunden Bevölkerung den Nasenraum, meist ohne Symptome zu verursachen (sog. Carrier). Die Bakterienspezies ist aber auch eine der häufigsten Ursachen für nosokomiale Infektionen mit zum Teil hoher Letalität, wie z. B. bei einer S. aureus-Sepsis. In den letzen Jahrzehnten haben sich multiresistente S. aureus-Isolate in und außerhalb der Krankenhäuser stark ausgebreitet. Dies lässt befürchten, dass eine erfolgreiche antibiotische Behandlung schwerer S. aureus-Infektionen in der Zukunft immer seltener möglich sein wird. Deshalb werden andere präventive und therapeutische Strategien wie Impfstoffe benötigt. Die Impfstoffentwicklung gestaltet sich jedoch schwierig. Zum einen ist die Variabilität der Spezies S. aureus sehr groß: Zwei Isolate können sich in bis zu 20 % ihres Genoms unterscheiden. Zum anderen ist auch die Immunantwort des Wirts sehr komplex. Die Mechanismen der angeborenen Immunabwehr sind bereits gut untersucht, das Zusammenspiel von S. aureus mit dem adaptiven Immunsystem dagegen weniger umfassend charakterisiert. Dabei ist gerade dies für die Vakzineentwicklung bedeutsam, denn jede erfolgreiche Vakzinierung beruht auf der Bildung eines Immungedächtnisses, der Kernkompetenz des adaptiven Immunsystems. Da sich die gegen S. aureus gerichtete adaptive Immunantwort von Individuum zu Individuum stark unterscheidet, ist die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Mechanismen eine besondere Herausforderung. Die rasche Entwicklung von OMICs-Techniken ermöglicht nun erstmals eine umfassende Charakterisierung des Immunoms von S. aureus; der Gesamtheit der von B-Zellen (und Antikörpern) und T-Zellen erkannten bakteriellen Antigene. In dieser Arbeit sollten diese modernen Methoden eingesetzt werden, um einen Beitrag zum Verständnis der vielfältigen Interaktionen zwischen S. aureus und dem adaptiven Immunsystem zu leisten; mittelfristig soll dieses Projekt zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen S. aureus beitragen. Informativ erschien ein Vergleich der adaptiven Immunantwort bei S. aureus-Carriern und Patienten, weil er Aufschluss darüber verspricht, wie die Interaktion zwischen Erreger und Wirt in der Balance gehalten wird und was dieses Gleichgewicht stört. Weil die individuelle Antiköperantwort (IgG, IgA und IgM) in ihrer Komplexität und Variabilität erfasst werden sollte, wurde ein personalisierter Ansatz gewählt, d.h. mittels zweidimensionaler Immunoblots (2D-IB) wurde bei jedem S. aureus-Carrier oder Patienten die Antikörperantwort auf den eigenen kolonisierenden bzw. invasiven S. aureus-Stamm untersucht. Durch die Kombination mit massenspektrometrischen Analysen ließ sich das S. aureus-Immunom der Kolonisierung und der Bakteriämie herauskristallisieren. Um in der Zukunft auch S. aureus-spezifische T-Zellen charakterisieren zu können, wurde ein Verfahren für die Herstellung von humanen T-Zellbanken entwickelt, das die funktionelle Analyse von T-Lymphozyten auf Einzelzellebene ermöglicht.
1 Akuter kombinierter akustischer und Immobilisationsstress führt im Mausmodell zu einer HPA-Achsenaktivierung mit Anstieg von Corticosteron im Plasma und transienter Leuko- und Lymphozytopenie, zur Aktivierung des sympathischen Nervensystems und zu Apoptosen des Epithels im terminalen Abschnitt des Ileums, mit vermutlich konsekutiver, bakterieller Translokation in die Blutbahn, die zu Veränderungen im Tryptophanmetabolismus, im Sinne einer Aktivierung der Indolamin-2,3-Dioxygenase führt. 2. Der Sympathikus interagiert bei der Reaktion des Organismus auf Stress eng mit der HPA-Achse und dem Magen-Darm-Trakt. Die HPA-Achse wiederum hat über CRF Einfluss auf die Integrität der Darmbarriere. Zusätzlich reguliert der Sympathikus direkt die Durchblutung und den Tonus des Darmes und hat Einfluss auf die lokale Immunität des Darmes. 3. Mit Hilfe des Ergotaminderivates Reserpin, das 24 Stunden nach subkutaner Applikation zu einem signifikanten und langanhaltenden Abfall des Noradrenalinspiegels im Plasma von sowohl gestressten als auch ungestressten BALB/c Mäusen führte, wurde der Einfluss des Sympathikus auf die stressinduzierten Veränderungen der HPA-Achse und Darmbarriere bewertet. 4. Ein Einfluss der Sympathikolyse auf die HPA-Achse konnte hierbei nicht gezeigt werden, da weder der stressinduzierte Anstieg des Corticosterons noch die Leuko- und Lymphozytopenie durch Reserpin verhindert werden konnten. 5. Einen weiteren, so vorher nicht bekannten, Corticosteron-Anstieg 8 Stunden nach Stressbeginn deuteten wir als durch bakterielle Translokation hervorgerufen. Da sich dieser Peak durch Reserpinbehandlung nicht aufheben ließ, scheint die stressinduzierte bakterielle Translokation durch Sympathikolyse nicht verhinderbar zu sein. Bei genauerer Untersuchung der stressinduzierten Darmbarrierestörung anhand der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der Transsudation von Evans Blue in die Submukosa des Ileums und der durch mikrobielle Produkte hervorgerufenen systemischen Aktivierung der Indolamin-2,3-Dioxygenase, zeigte sich ebenfalls kein protektiver Effekt der Sympathikolyse. 6) Durch einen Zufallsbefund zeigte sich, dass weibliche BALB/c Mäuse, die 4 Wochen zuvor Transportstress ausgesetzt wurden, auf die akute Stresssitzung mit einer verminderten HPA-Achsenantwort und damit assoziierten fehlenden Darmbarrierestörung reagierten, obwohl sie am Ende der Adaptationsphase nur unwesentliche Unterschiede in den untersuchten Stressparametern Gewicht, Plasmacorticosteronkonzentration und Leuko- und Lymophozytenzahl aufwiesen. Diese langanhaltende, zentrale Abschwächung der HPA-Achsensensibilität wird vermutlich über adaptive, inhibitorische monoaminerge Signalwege reguliert, da bei fehlender Sympathikusaktivierung eine HPA-Achsenantwort zu beobachten ist. 7. Zusätzlich lassen die Ergebnisse einen Zusammenhang zwischen HPA-Achsenaktivierung und Darmbarrierestörung vermuten. Als Ursache hierfür erscheint ein CRF- und Mastzell-vermittleter Mechanismus wahrscheinlich. 8. Bereits Routinetätigkeiten wie der Transport von Labortieren beeinflussen basale Stressparameter langfristig und können dadurch die Vergleichbarkeit von Experimentalergebnissen kommerziell erworbener und selbst gezüchteter Mäuse stark einschränken.
IL-10 drives the re-establishment of peritoneal macrophage populations in bacterial peritonitis
(2011)
The aim of this thesis work was to explore the physiological and functional properties of peritoneal macrophage populations in both the steady state and in inflammatory conditions. In the steady state there are two populations of macrophages in the peritoneum which I refer to as the R1 and R2 populations. The R1 cells are a rapidly turning over population which constitute around 20% of the peritoneal macrophages. I show that these cells have the capacity to efficiently present peptides on MHC-II to CD4+ T cells but that they are poor at phagocytosis. Monocytes transferred into the un-infected peritoneum give rise almost exclusively to this R1 population, suggesting that the R1 fate is the default pathway of monocyte development under steady state conditions. In contrast, the R2 population in the peritoneum turns over very slowly in the steady state and is composed of cells which are poor at the presentation of peptide to T cells but which are efficient at phagocytosis. Both of these populations are lost from the peritoneum within an hour of the induction of a poly-microbial peritonitis. A large fraction of the R2 population relocates from the peritoneal wash fraction to the omentum, the fate of the R1 population is less clear. Over the course of the next three days, the macrophage populations in the peritoneum are re-established. Transfer experiments using genetically marked cell populations demonstrated that neither the R1 nor the R2 populations which “disappeared” one hour after infection contributes to the re-established peritoneal wash fraction macrophage pool at day 3. While the re-established R1 population retains the functional properties and the FACS phenotype of the steady state R1 cells, the re-established R2-like population is clearly not identical to the R2 cells present in the pre-infection environment. In particular, this R2-like population can be split into two sub-populations which have non-identical functional properties. In this inflammatory situation monocytes transferred into the peritoneum now acquire the capacity to differentiate not only into R1-like cells but also into R2-like macrophages. I looked for the molecular basis driving this change of monocyte differentiation in the infected peritoneum by using a solid phase cytometry based ELISA procedure to examine the spectrum of cytokines produced in the peritoneum in response to poly-microbial infection. One of the most prominent cytokines produced early in infection is IL-10. To determine whether IL-10 is directly involved in assigning monocyte fate in the peritoneum I looked at the ability of mice carrying a targeted deficiency of either the IL-10 gene or of the IL-10 receptor gene to form the R2-like cells after infection. Neither mouse strain efficiently generates the R2-like population after infection. Adoptive transfer of genetically marked wild type or mutant monocytes into appropriate hosts demonstrated that the effect of IL-10 is not direct. Rather, the IL-10 responding cell produces a mediator which then directs monocyte fate. Thus, the bystander IL-10R deficient monocytes are driven by the mediator produced by wild type monocytes to generate R2 cells with high efficiency. The crucial role of this IL-10 dependent pathway was underscored by supplementation experiments. Mice carrying a targeted deficiency of the IL-10 gene fail to generate the R2 population during peritonitis. However, injection of IL-10 into these animals rescues the capacity to form the R2 population. In addition the normal default pathway of monocyte development in un-infected animals which leads to the R1 population is modulated by injection of IL-10 so that the monocytes can now differentiate into the R2 population. The work presented in this thesis describes the steady state populations of phagocytes in the un-infected peritoneum and the dynamics of these populations during the induction of peritonitis. It also uncovers an IL-10 dependent pathway which regulates the choice of monocyte developmental fate within the peritoneum.
Die Rolle von Foxp3-positiven regulatorischen T-Zellen in der polymikrobiellen murinen Sepsis
(2011)
Trotz moderner intensivmedizinischer Behandlung bleibt die Sepsis eine bedrohliche Komplikation operativer Eingriffe. Welche Rolle regulatorische T-Zellen (Tregs) bei ihrer Pathogenese spielen, wird kontrovers diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurden DEREG-Mäuse verwendet, um die Funktion von Foxp3+ Tregs im murinen Sepsismodell der cecal ligation and puncture (CLP) zu untersuchen. Der Transkriptionsfaktor Foxp3 ist aktuell der beste Marker für Tregs. DEREG-Mäuse exprimieren unter der Kontrolle des foxp3-Lokus ein enhanced green fluorescent protein und Diphtherietoxin-Rezeptoren, sodass endogene Tregs ex vivo einfach visualisiert und in vivo selektiv depletiert werden können. Sepsis führte zu einer schnellen systemischen Aktivierung von Foxp3+ Tregs. 24 h nach CLP waren ihr suppressorisches Potential und die Expression von Aktivierungsmarkern stark erhöht. Zudem wurde das Verhältnis zwischen Tregs und T-Effektorzellen (Teffs) zu Gunsten der Tregs verschoben. Die Depletion endogener Foxp3+ Tregs vor Sepsisinduktion zeigte, dass diese Zellen das Überleben verbessern: Drei Tage nach CLP lebten noch 25 % der Treg-kompetenten Tiere, jedoch nur 5 % der Treg-depletierten Tiere. Dieser Effekt der Treg-Depletion war statistisch signifikant, wurde aber erst mit einer Latenz von 30 h nach CLP sichtbar. Vorher erschien der Verlauf der Überlebenskurve unabhängig von der Kontrolle durch Tregs. Durch einen adoptiven Transfer von präaktivierten Tregs konnte der protektive Effekt von endogenen Tregs bei einer Sepsis nicht vergrößert werden.