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Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems (2011)
Klinger, Franziska Martha
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diĂ€tetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten GrĂ¶ĂŸenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der VerĂ€nderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugefĂŒhrten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte VerĂ€nderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von PrĂ€-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und PrĂ€zisierung der gefundenen VerĂ€nderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere PrĂ€paration des Nierenmarks in Ă€ußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der SalzdiĂ€t beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine NiedrigsalzdiĂ€t von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von PrĂ€-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterfĂŒhrenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der Ă€ußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer AusprĂ€gung (PrĂ€-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese DiĂ€teffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollstĂ€ndig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lĂ€sst sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medullĂ€re Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate VerĂ€nderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten VerĂ€nderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei PrĂ€-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der Ă€ußeren Medulla unter NiedrigsalzdiĂ€t. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
Einfluss NADPH-Oxidase-abhÀngiger Sauerstoffradikale auf die Entwicklung der arteriellen Hypertonie spontan hypertensiver Ratten und Untersuchungen zu vaskulÀren Wirkmechanismen von Apocynin (2011)
Steffen, Anja
Zahlreiche Studien liefern Erkenntnisse ĂŒber den Zusammenhang zwischen reaktiven Sauerstoffspezies und der Entstehung kardiovaskulĂ€rer Erkrankungen, wie der Hypertonie. Besonders NADPH-Oxidase-abhĂ€ngige Sauerstoffradikale wurden als wichtige krankheitserzeugende Faktoren in der Entwicklung und Aufrechterhaltung kardiovaskulĂ€rer Erkrankungen, wie der arteriellen Hypertonie identifiziert und Substanzen erforscht, die zu experimentellen und therapeutischen Zwecken die NADPH-Oxidase-AktivitĂ€t hemmen. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch frĂŒhzeitige Behandlung spontan hypertensiver Ratten mit einer Substanz, die NADPH-Oxidase-hemmende Eigenschaften hat, eine langfristige Blutdrucksenkung und eine Verbesserung der endothelvermittelten Vasodilatation zu erreichen. Dazu wurde eine Gruppe von 8 SHR ĂŒber das Trinkwasser mit dem NADPH-Oxidase-Hemmer Apocynin behandelt und mit Hilfe der Radiotelemetrie der systolische, diastolische Blutdruck sowie die Herzfrequenz registriert. Die Apocynin-behandelten SHR wurden mit einer Gruppe von 6 unbehandelten SHR-Kontrolltieren verglichen. Neben diesen Experimenten wurden Untersuchungen zur Endothelfunktion Apocynin-behandelter SHR an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien und zur vasodilatierenden Wirkung von Apocynin an Interlobar- und Koronararterien von F344 Ratten mit einem Small-Vessel-Myographen durchgefĂŒhrt. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass die Behandlung der SHR mit Apocynin bis zur 8. Lebenswoche keine langfristige Blutdrucksenkung zur Folge hatte. Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich der BlutdrĂŒcke ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied. Die Untersuchungen zur endothelvermittelten Vasodilatation mit Acetylcholin an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien Apocynin-behandelter und unbehandelter SHR zeigten, dass durch die Behandlung der SHR mit Apocynin keine Verbesserung der renalen und koronaren Endothelfunktion im Vergleich zu den Kontrollen resultierte. Die Experimente zur KlĂ€rung der Mechanismen, die die vasodilatierende Wirkung von Apocynin vermitteln ergaben, dass durch die Hemmung der NADPH-Oxidase-abhĂ€ngigen Sauerstoffradikale, durch die Abwesenheit von extrazellulĂ€rem Kalzium, durch Kalium und durch die Inhibition der Proteinkinase A und G die Apocynin-induzierte Vasodilatation nicht signifikant gehemmt wurde. Durch die Inkubation der Arteriensegmente mit dem Rho-Kinase-Hemmer Y-27632 wurde die Vasopressin-induzierte Vasokonstriktion signifikant abgeschwĂ€cht und die kumulative Zugabe von Apocynin zeigte keine zusĂ€tzliche Wirkung auf die Wandspannung. Diese Ergebnisse belegen, dass die renalen Interlobar- und Koronararterien von SHR und F344 Ratten auf Apocynin mit einem ausgeprĂ€gten Dilatationsverhalten reagierten, die Vasodilatation jedoch nicht ĂŒber eine Hemmung der NADPH-Oxidase, vermutlich aber ĂŒber eine Hemmung der Rho-Kinase vermittelt wird.
Neue Erkenntnisse zum Diabetes – protektiven Locus IDDM4 der SH Ratte: Charakterisierung einer neuen kongenen BB.6S f Rattenlinie. (2011)
Lutze, Philipp
Beim Typ-1 Diabetes handelt es sich um eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die auf dem Zusammenspiel genetischer, immunologischer und umweltbedingter Faktoren beruht. Hilfreich bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Genloci sind diverse Tiermodelle, bei denen durch Kreuzungsstudien kongene Linien mit spontanen Rekombinationen im Bereich diabetes-suszeptibler oder diabetes-resistenter Genloci entstehen. Ein „Produkt“ solcher Kreuzungen ist die homozygote BB.6S m Rattenlinie, die obwohl TrĂ€ger der diabetogenen Iddm1 und Iddm2 Genloci, nur eine T1D-Inzidenz von 10 % aufwies. Ursache fĂŒr den diabetes-protektive Effekt war der alleinige chromosomale Austausch des diabetogenen Iddm4 Bereiches auf Chromosomen 6 der BB/OK Ratte durch den einer mĂ€nnlichen, diabetes-resistenten SH Ratte. Innerhalb dieser Arbeit sollten daher folgende Fragestellungen geklĂ€rt werden. 1. Ist die Iddm4 vermittelte Reduktion der Diabetesinzidenz auf die Expression eines oder mehrere potentieller diabetes-protektiver Gene zurĂŒckzufĂŒhren? 2. Wird das T1D Risiko durch den in diesem Bereich liegenden Imprintinglokus Dlk1-Dio3 beeinflusst? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine zweite kongene Rattenlinie generiert. Die BB.6S f Linie, deren Iddm4 Genlocus von weiblichen SH Ratten abstammte, zeichnete sich wie die BB.6S m durch eine massive Reduktion der T1D Inzidenz aus. Nur 13 % der BB.6S f Ratten entwickelten einen T1D. Bei der Analyse der Expression von Strukturgenen konnten keine einheitlichen Muster zwischen BB.6S m und BB.6S f Ratten im Bezug zu BB/OK Ratten detektiert werden. Erst die Analyse des Expressionsmusters von mikroRNAs, deren Gene im Iddm4 Bereich und hier insbesondere im Dlk1-Dio3 Gencluster lokalisiert sind, ergaben sich Hinweise auf die mikroRNAs mir-337, mir-345 und mir-299 als potenzielle Kandidaten fĂŒr einen T1D Schutz. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklĂ€rt werden, ob die T1D Inzidenz durch genomische PrĂ€gung der Gene des Dlk1-Dio3 Imprintingclusters beeinflusst wird: So sind auf dem vĂ€terlich vererbten Allel unter anderem die Gene Dlk1, Rtl1 und Dio3 aktiviert, wĂ€hrend bei mĂŒtterlicher Abstammung Gtl2 und mikroRNAs exprimiert werden. Zur KlĂ€rung dieser Fragestellung wurden heterozygote F1 Hybride aus den Kreuzungen (BB/OK x BB.6S m) und (BB.6S m x BB/OK) generiert. Die phĂ€notypischen Daten belegen, dass die heterozygoten Tiere in der Regel eine höhere T1D Inzidenz aufwiesen, die zusĂ€tzlich in AbhĂ€ngigkeit vom Geschlecht der Nachkommen und dem Vererbungsmuster zwischen 21 und 74 % variierte. Generell waren weibliche Nachkommen besser vor einem T1D geschĂŒtzt als mĂ€nnlichen Nachkommen. Außerdem zeigte sich, dass die T1D Inzidenz niedriger war, wenn das SHR Allels vĂ€terlicherseits vererbt wurde. Diese Sachverhalte deuten einerseits auf eine Interaktion des Iddm4 Bereichs von Chromosom 6 mit dem biallelischen X-Chromosom hin. Eine weitere Analyse der Dlk1 Expression belegt, dass es beim Fehlen des paternalen SHR Allels ĂŒberraschenderweise zu einer biallelischen Expression des Dlk1 Genes kommt. Dieser Effekt ist assoziiert mit dem Verlust der Iddm4 vermittelten T1D Protektion. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen zusammenfassend drei Aussagen zu. I. Es konnte unter Einsatz der beiden kongenen BB.6S Rattenlinien kein Gen identifiziert werden, das den durch den Iddm4 Bereich der SH Ratte vermittelten Diabetesschutz bewirkt. II. Die Diabetesinzidenz wird offensichtlich durch Interaktion zwischen Chromosom 6 und dem biallelischen X-Chromosom beeinflusst. III. Hier konnte erstmals tierexperimentell bestĂ€tigt werden, dass die Manifestation eines T1D durch Imprinting geprĂ€gt wird.
Kokultur von Kardiomyozyten mit mononukleÀren Zellen zur Simulation molekularer VorgÀnge beim Myokardinfarkt (2011)
Konzack, Silke
Obwohl der Myokardinfarkt eine der hĂ€ufigsten Todesursachen ĂŒberhaupt ist, sind die zellulĂ€ren und molekularbiologischen Pathogenesemechanismen und seine Therapiemöglichkeiten nicht ausreichend untersucht. Es ist bekannt, dass die EntzĂŒndungsreaktion fĂŒr die Folgen eines Myokardinfarkts eine große Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde ein Modell zur nĂ€heren Untersuchung grundlegender intrazellulĂ€rer und interzellulĂ€rer Mechanismen dieser EntzĂŒndungsreaktion entworfen. Es wurde ein in vitro Kokultursystem zwischen mononukleĂ€ren Zellen (MNC) und Kardiomyozyten (H9c2 Zellen) etabliert. Damit konnten nicht nur bisher unbekannte Zellmechanismen aufgezeigt, sondern auch ein Modell zum Screening neuer therapeutischer Substanzen im Rahmen eines Myokardinfarkts entwickelt werden. So können beispielsweise neue Wirkstoffe fĂŒr den Patienten sicherer gestaltet werden. Dieses Modell wurde durch die Simulation vieler bereits in vivo beschriebener Befunde im Rahmen eines Myokardinfarkts verifiziert. Dazu zĂ€hlen die VerstĂ€rkung der Expression von ICAM‑1 auf Herzzellen sowie eine Erhöhung von ICAM‑1 und LFA‑1α auf MNC. Diese Befunde konnten mit dem entwickelten in vitro Kokultur‑Modell in Bezug auf Lymphozytensubpopulationen differenziert werden. ZusĂ€tzlich wurden Aussagen ĂŒber LFA‑1α speziell auf B- und T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen, ĂŒber MHC Klasse I und II auf T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen und ĂŒber den Aktivierungsgrad der T‑Lymphozytensubopulationen getroffen. Durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen kommt es zu VerĂ€nderungen von OberflĂ€chenstrukturen auf beiden Zelltypen. Es kann von einem erhöhten Aktivierungszustand der MNC nach der Kokultur ausgegangen werden, da die Expressionsdichte von Aktivierungsmarkern (IL‑2 Rezeptoren, MHC Klasse II) auf MNC durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen erhöht war. Die verstĂ€rkte Expression von ICAM‑1, LFA‑1α, MHC Klasse I und MHC Klasse II auf H9c2 Zellen sowie die erhöhten prozentualen Anteile an CTL und T‑Helferzellen und die erhöhten Expressionen von LFA‑1α und ICAM‑1 auf MNC durch die Kokultur lassen auf eine Interaktion zwischen mononukleĂ€ren Zellen und Kardiomyozyten schließen. Insbesondere die Ergebnisse aus den an den H9c2 Zellen adhĂ€rierten MNC verstĂ€rken diesen Aspekt. Es gibt verschiedene Interaktionsmöglichkeiten zwischen MNC und H9c2 Zellen. Einerseits ist die Rezeptorbindung zwischen LFA‑1α auf MNC oder H9c2 Zellen und ICAM‑1 auf Kardiomyozyten oder MNC wichtig, andererseits spielt die Rezeptorbindung ĂŒber MHC Klasse I/CD8 beziehungsweise ĂŒber MHC Klasse II/CD4 eine Rolle. Durch die Kokultur wurde die erhöhte Produktion und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und löslichen Mediatoren fĂŒr TNF‑α, IL‑6 und NO gezeigt. Da H9c2 Zellen unter Kontrollbedingungen kein TNF‑α in das Kulturmedium freisetzten, wird deutlich, dass die gemessene erhöhte Menge an TNF‑α nach der Kokultur von MNC stammte. Andererseits konnte nicht geklĂ€rt werden, ob das erhöhte IL‑6 durch die MNC oder durch die H9c2 Zellen produziert wurde, da sowohl MNC als auch H9c2 Zellen in der Kultur unter Kontrollbedingungen geringe Mengen an IL‑6 freisetzten. Es muss davon ausgegangen werden, dass die erhöhte IL‑6 Konzentration aus der infolge der Kokultur vermehrten Produktion beider Zelltypen hervorgegangen ist. Aufgrund dessen, dass besonders IL‑6 fĂŒr die Induktion der Expression von ICAM‑1 verantwortlich ist, scheint eine Signaltransduktion zwischen MNC und H9c2 Zellen von TNF‑α ĂŒber IL‑6 und ICAM‑1 wahrscheinlich. H9c2 Zellen sowie MNC sezernieren unabhĂ€ngig von der Kulturzeit eine geringe NO Menge, die durch die Kokultur gesteigert wurde. Durch eine lĂ€ngere Kokulturzeit wurde quantitativ nicht mehr NO sezerniert als bereits nach 24 Stunden, sodass geschlussfolgert werden kann, dass die NO Freisetzung besonders in der frĂŒhen Inflammationsphase eine Rolle spielt. Da IL‑6 erst verzögert nach 48 Stunden Kokultur verstĂ€rkt freigesetzt wird, TNF‑α aber bereits nach 24 Stunden ein Maximum im KulturĂŒberstand erreichte, wird die Induktion der NO Freisetzung eher auf TNF‑α oder andere proinflammatorische Zytokine, nicht aber auf IL‑6 zurĂŒckzufĂŒhren sein. Es ist nicht bekannt, ob NO durch IL‑6 induziert werden kann. Mit Hilfe durchflusszytometrischer und molekularbiologischer Auswertung konnte ein lokales RAS in den MNC nachgewiesen werden. In der mRNA Analyse wurden sowohl AT1AR als auch AT1BR detektiert. Ebenso wurde in den MNC der F344 Ratten mRNA fĂŒr Angiotensinogen, AT2 Rezeptoren, ACE, Renin und Exon 1A Renin nachgewiesen. Renin, AOGEN und ACE von sMNC, die mit Hilfe einer quantitativen PCR untersucht wurden, werden durch die Kokultur von MNC und H9c2 Zellen signifikant vermindert. Der Anteil AT1R positiver Zellen verminderte sich durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen und die AT2 Rezeptordichte auf sMNC und speziell auf T‑Lymphozyten erhöht sich. Jedoch spiegelt die Kokultur nicht in allen Parametern die Aktivierung des lokalen RAS innerhalb der nicht adhĂ€rierten MNC wieder. Die adhĂ€rierten MNC waren fĂŒr die PCR Untersuchung nicht zugĂ€nglich. Es bleibt offen, inwieweit es zur Aktivierung des lokalen RAS in MNC durch die Kokultur kommt. Da sowohl sMNC als auch PBMC ĂŒber alle RAS-Komponenten zur Generierung von ANG II verfĂŒgen, kann geschlussfolgert werden, dass sie ein lokales Renin‑Angiotensin‑System besitzen. Es können durch die Kokultur bedingte VerĂ€nderungen hinsichtlich der OberflĂ€chenexpression einiger Strukturen durch den Einsatz von spezifischen Hemmstoffen des RAS vermindert oder aufgehoben werden. Dieser Effekt ist ein Indikator dafĂŒr, dass das lokale RAS in der Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen eine wichtige Rolle spielt. Beispielsweise verminderte der AT1 Rezeptorblocker DUP753 signifikant den prozentualen Anteil an LFA‑1α und ICAM‑1 exprimierenden T‑Lymphozyten. ZusĂ€tzlich kam es zur Verminderung der Dichte von MHC Klasse II OberflĂ€chenmolekĂŒlen auf T‑Lymphozyten und der IL‑2 Rezeptordichte auf CTL gegenĂŒber den ohne Inhibitor kokultivierten Zellen. Diese Befunde lassen auf einen geringeren AktivitĂ€tszustand der MNC und auf eine schwĂ€chere Interaktion zwischen MNC und H9c2 Zellen durch Behandlung mit einem AT1 Rezeptorblocker schließen. Dies ist ein Indiz dafĂŒr, dass das lokale RAS der MNC in der Kokultur von MNC und H9c2 Zellen aktiviert wird. Im Gegensatz dazu lĂ€sst sich die durch die Kokultur bei H9c2 Zellen induzierte Apoptose und Nekrose durch AT1R und AT2R Blockade nicht verhindern. Dieses Modell ist geeignet, zellulĂ€re und molekulare Prozesse des Myokardinfarkts zu simulieren. Es könnte kĂŒnftig ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelscreenings der Herzinfarkttherapie darstellen und als Grundlage fĂŒr weitere Studien in der Behandlung des Myokardinfarktes dienen. Zur Optimierung dieses Modells sollte eine Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die adhĂ€rierten MNC von den H9c2 Zellen zu trennen, um sie molekularbiologisch untersuchen zu können.
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