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Ziel der Arbeit war es, Mono-Dithiolen-Vanadiumkomplexe zu synthetisieren, die als Katalysatoren in Oxidationsreaktion von prochiralen Sulfiden zu chiralen Sulfoxiden getestet werden sollten.
Es konnten verschiedene Ansätze entwickelt werden, die vielversprechend waren, um durch weitere Forschung Mono-Dithiolen-Vanadiumkomplexen erhalten zu können.
Insbesondere konnte eine universell anwendbare Syntheseroute für die Verwendung von aliphatischen Dithiolenen in der Komplexsynthese erfolgreich gezeigt werden. Außerdem wurden neue Kristallstrukturen verschiedener Dithiolen-Vanadiumkomplexe erhalten.
Die Dissertation beschreibt die Synthese verschiedener Nukleosidanaloga mit den notwendigen Modifizierungen und Funktionalitäten für einen Einsatz in der Phosphoramidit-basierten chemischen Oligonukleotidsynthese an fester Phase. Im Rahmen der Arbeit wurde ein nicht-kanonisches Desoxyadenosinderivat ausgehend von Allopurinol hergestellt. Außerdem wurden verschiedene Azid-modifizierte Nukleoside synthetisiert und Untersuchungen zur Herstellung eines Borono-modifizierten Adenosinderivats durchgeführt. Des Weiteren wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Stabilität der Azidogruppe unter Standardbedingungen der Phosphoramidit-basierten chemischen Oligonukleotidsynthese demonstriert.
Monodithiolenkomplexe des Wolframs und des Molybdäns des Typs [M(CO)2(dt)(PP)] (M= Mo, W; dt= Dithiolen; PP= Bisphosphan) waren bisher nur wenig zugänglich und entsprechend kaum untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse Variationen an Dithiolen- und Phosphan-Liganden eingeführt und die erhaltenen Komplexe umfassend charakterisiert. Ein besonderer Fokus wurde hierfür auf die redoxbasierte Reaktivität dieser spannenden Komplexklasse gelegt, sodass eine Aktivierung von molekularem Stickstoff im Rahmen einer Kleinmolekülaktivierung ermöglicht werden sollte. Während der Untersuchungen konnte ein erstes Beispiel für die Generierung eines Dithiolen-Sulfonium-Liganden basierend auf einer Reaktivität gegenüber dem Kleinmolekül Dichlormethan erhalten werden.
In dieser Doktorarbeit konnte in zwei verschiedenen experimentellen Modellen der chronischen Pankreatitis in C57BL/6 Mäusen gezeigt werden, dass die chronische Pankreatitis mit einem Gewichtsverlust und einer Verminderung der muskuloskelettalen Kraft assoziiert sind. Untersuchungen im Kleintier-MRT belegten eine signifikante Verminderung des Durchmessers des Quadrizepsmuskels in beiden Modellen. Auf Proteinebene fanden sich im Skelettmuskel von Mäusen mit chronischer Pankreatitis Expressionssteigerungen von growth differentiation factor 8 (GDF8) und Muscle RING-finger protein-1 (MuRF1). Auf mRNA Ebene konnten wir zeigen, dass Activin A und das transforming growth factor β (TGFβ) in beiden Modellen erhöht waren, wohingegen Follistatin und teilweise auch Inhibin A vermindert waren. Die Anzahl apoptotischer Zellen stieg im Quadrizepsmuskel in beiden Modellen signifikant an, was darauf schließen lässt, dass die Apoptose beim Muskelabbau eine Rolle spielt. Des Weiteren fanden sich in Mäusen mit chronischer Pankreatitis und Sarkopenie Veränderungen des Serummetaboloms und des Stuhlmikrobioms, die jedoch in Abhängigkeit des verwendeten Modells stark variierten. Modellübergreifend war eine Vermehrung von Akkermansia spp. in der chronischen Pankreatitis nachweisbar.
Enzymes, the driving biocatalysts in living organisms, are typically not suited for large-scale industrial use. In the last decade, enzyme engineering has evolved into the key technology to design tailor-made enzymes for chemical and pharmaceutical applications. We highlight current trends in enzyme engineering and biocatalysis based on outstanding examples from the pharmaceutical industry.
Die akute Pankreatitis ist eine der häufigsten nicht malignen gastrointestinalen Erkrankungen, die zu Krankenhausaufenthalten führt. Sie ist als Selbstverdau des Pankreas durch seine eigenen Proteasen wie z.B. Trypsin, Elastase und Chymotrypsin definiert. Als Ursprung der Erkrankung wird die frühzeitige intrazelluläre Aktivierung dieser Verdauungsenzyme angesehen. Dies führt zum Zelltod der Azinuszellen und zur Schädigung des Gewebes.
Während der akuten Pankreatitis kommt es in 20% der Fälle zu einem schweren Verlauf der Erkrankung, der mit Organversagen in der Lunge und den Nieren assoziiert ist. Es ist bekannt, dass es zu einer Entzündungsreaktion kommt, bei der große Mengen an Zytokinen ausgeschüttet werden. Leukozyten infiltrieren das Pankreas und verstärken den Gewebeschaden. Es kommt zur Freisetzung von DAMPs, die das angeborene und adaptive Immunsystem aktivieren. Bislang ist nicht gut untersucht, wie das Immunsystem den schweren Verlauf der akuten Pankreatitis beeinflusst und es gibt wenig Theorien über den Organschaden in der Lunge und den Nieren.
In dieser Arbeit lag der Fokus auf dem Organschaden in Lunge und Niere und die Wirkung von Interleukin 33 (IL33) auf die Zellen des angeborenen Immunsystems und deren Einwanderung in verschiedene Organe während der schweren akuten Pankreatitis im Mausmodell. Die schwere akute Pankreatitis wurde mittels Gangligatur und einmaliger Gabe von Caerulein an Tag 2 nach Gangligatur induziert. An Tag 3 nach Induktion wurden die Mäuse getötet und die Organe wurden für weitere Analysen entnommen.
Am dritten Tag nach Induktion der Pankreatitis kam es zu einem Organschaden in der Lunge und den Nieren. In der Lunge fand sich eine Verdickung der Alveolarsepten und eine Verdichtung des Gewebes sowie eine Infiltration von Leukozyten und ein Ödem. In der Niere waren ebenfalls strukturelle Veränderungen zu finden und eine Infiltration von Leukozyten war zu beobachten. In durchflusszytometrischen Analysen der Lunge konnte beobachtet werden, dass CD11b+CD62L+ Monozyten während der akuten Pankreatitis signifikant anstiegen. Mittels RT-DC wurde gezeigt, dass diese Monozyten an Tag 3 signifikant an Größe zugenommen hatten. Mit einer CD11b Färbungen von Lungen und Nieren konnte die Infiltration durch Monozyten bestätigt werden. Unter einer Blockade von Monozyten durch systemische Gabe von anti-CCR2-Antikörpern verringerte sich die Schädigung in Lunge und Niere während der Pankreatitis signifikant.
Diese Daten legen nahe, dass der Organschaden in der schweren akuten Pankreatitis durch infiltrierende Monozyten verursacht wird, die über CD62L (L-Selektin) an die Gefäßwände binden und über ihre Größe Gefäße verstopfen, was in den Kapillaren zur Ischämie führt.
In vitro sezernierten Makrophagen, die mit CCK stimulierten Azinuszellen co-inkubiert wurden, IL33. Im Mausmodell wurde IL33 mittels sST2 blockiert, was die Schädigung des Pankreas in der Pankreatitis reduzierte. In IL33-depletierten Tieren fand sich im Vergleich zum Wildtyp ein geringerer Lungenschaden aber eine unveränderte Nierenschädigung. Somit scheint IL33 eine Rolle bei der Monozyten-vermittelten Organschädigung in der Pankreatitis zu spielen, die sich auf Grund von kompensatorischen Regulationsmechanismen im globalen IL33 Knock-out weniger gut belegen lässt als nach IL33 Inhibition. Die Hemmung von IL33 zur Behandlung der akuten Pankreatitis stellt somit ein vielversprechendes Therapieprinzip dar.
Unter promiskuitiver Acyltransferase-Aktivität versteht man die Eigenschaft bestimmter Hydrolasen, in wässriger Lösung bevorzugt Acyltransfer statt Hydrolyse zu katalysieren. Bis vor Kurzem waren nur wenige promiskuitive Acyltransferasen literaturbekannt. Dies führte zu der allgemeinen Annahme, dass diese Aktivität ein seltenes Phänomen in Hydrolasen ist. Diese Arbeit zeigt jedoch, dass promiskuitive Acyltransferase-Aktivität in der Familie der bakteriellen hormonsensitiven Lipasen und Carboxylesterasen der Familie VIII weit verbreitet ist. Detaillierte Struktur-Funktions-Analysen ermöglichen die sequenzbasierte Vorhersage und Optimierung der Acyltransferase-Aktivität in beiden Enzymfamilien. Insbesondere die Carboxylesterasen der Familie VIII überschreiten die Grenzen des bisher für möglich Gehaltenen, indem sie gute Enantioselektivität bei der kinetischen Racematspaltung sekundärer Alkohole zeigen und darüber hinaus die irreversible Bildung von Amiden und Carbamaten in Wasser katalysieren können. Die biokatalytische Acylierung von Zuckern in Wasser galt lange Zeit als unerreichtes Ziel der Biokatalyse. In dieser Arbeit wurde jedoch gezeigt, dass natürlich vorkommende und modifizierte Carboxylesterasen der Familie VIII die regioselektive Acetylierung von Glucose, Maltose und Maltotriose in Wasser mit hoher Effizienz katalysieren können.
Immunogenität von Hautkrebszellen und dem Modellprotein Ovalbumin nach einer Kaltplasma-Behandlung
(2021)
Eine Behandlung von Tumoren mit physikalischem Kaltplasma zeigt eine erhöhte Toxizität und ein reduziertes Tumorwachstum. Zeitgleich werden während einer Behandlung mit Plasma eine Vielzahl an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) generiert, welche Immunzellen stimulieren können. Viele neue Therapieansätze bestreben nicht nur eine Tumortoxizität, sondern auch eine Förderung der körpereigenen, da diese häufig durch Mechanismen der Tumorzellen unterdrückt wird. Zu solchen Therapien zählen checkpoint inhibitoren, Vakzinierungen oder ein adaptiver Zelltransfer mit transgenen oder vor-stimulierten Zellen. Die dadurch geförderte Antitumor-Immunantwort basiert grundlegend auf einem mehrphasigen Prozess. Dieser beginnt mit einer Antigen-unspezifischen frühen Phase, in der das innate Immunsystem aktiviert wird und zu einer Vermehrung und Differenzierung von Antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Da während einer Entzündungsreaktion viele RONS gebildet werden, um Fremdkörper zu eliminieren und Immunzellen zu rekrutieren, ist eine Therapie mit RONS naheliegend. Durch die Anwendung von Kaltplasma können die gebildeten RONS zum Entzündungsgeschehen beitragen und Zellen des innaten und adaptiven Immunsystems stimulieren. Eine veränderte Immunogenität von Tumorzellen sowie eine daraus resultierende direkte Aktivierung von Immunzellen im Kontext einer Antitumor-Immunantwort wurden nach einer Behandlung mit Jet-Plasmen bislang nicht untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Kaltplasma-Behandlung von Hautkrebszellen und eines Modellantigens unter Berücksichtigung einer Antitumor-Immunantwort durch natürliche Killerzellen des innaten Immunsystems sowie adaptive Immunzellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kaltplasma zu einer erhöhten Tumortoxizität führt und das Repertoire der Oberflächenmoleküle auf Tumorzellen verändert. In vivo wurde eine vermehrte Infiltration von Immunzellen in das Tumormikromilieu beobachtet, welche mit einer erhöhten Aktivierung von Lymphozyten und Konzentrationen immunstimulatorischer Zytokine einherging. Durch die zeitgleich reduzierten Tumorgrößen, ist eine durch Immunzellen vermittelte Tumortoxizität als Erklärung naheliegend. In zwei Vakzinierungsstudien konnte die Immunogenität von Plasma-behandelter Tumorzellen und einem Tumorassoziierten Modellantigen bestätigt werden.
Die akute Pankreatitis ist durch eine vorzeitige Aktivierung von Verdauungsenzymen noch innerhalb der Azinuszellen gekennzeichnet. Die lysosomale Hydrolase Cathepsin B (CTSB) spielt hierbei eine entscheidende Rolle, indem sie Trypsinogen zu Trypsin aktiviert. Für die Trypsinogenaktivierung durch CTSB ist eine Co-Lokalisierung beider Enzyme innerhalb desselben subzellulären Kompartiments erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation der CTSB-Aktivität durch den Cysteinprotease-Inhibitor Cystatin C im Verlauf der akuten und chronischen Pankreatitis näher zu untersuchen.
Subzelluläre Fraktionierungsexperimente zeigten eine deutliche Lokalisation von Cystatin C und aktiven Cathepsin B im sekretorischen Kompartiment muriner Azinuszellen. Immunofluoreszenzfärbungen zeigten ebenfalls, dass Cystatin C zusammen mit der pankreatischen Amylase im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen lokalisiert ist. Auch in humanen Probenmaterial konnten wir zeigen, dass Cystatin C im sekretorischen Kompartiment lokalisiert ist und auch sekretiert wird. Experimente mit rekombinanten Proteinen zeigten eine deutliche pH-abhängige inhibitorische Wirkung von Cystatin C auf Cathepsin B. Unter sauren pH Bedingungen dimerisiert Cystatin C und ist somit nicht mehr in der Lage die Aktivität von CTSB zu inhibieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass aktives Trypsin Cystatin C prozessiert. Bei dieser Spaltung entsteht ein Cystatin C-Fragment, welches nicht mehr in der Lage ist, CTSB zu inhibieren, sondern vielmehr die auto-inhibitorische Kapazität von Cathepsin B unterbindet und somit die Aktivität stabilisiert. Neben Cystatin C wird in Azinuszellen auch Cystatin B exprimiert, ein weiterer Inhibitor der Cystein-Proteasen. Im Gegensatz zu Cystatin C ist Cystatin B exklusiv im cytosolischen Kompartiment der Azinuszelle lokalisiert. Dies ist wahrscheinlich ein Schutzmechanismus, welcher die Zelle vor einer cytosolischen Cathepsin-Aktivität schützen soll. Die genetische Deletion von Cystatin C im Mausmodell der akuten Pankreatitis führte zu einer erhöhten Aktivität sekretorischer Proteasen in Azinuszellen, sowie im Gesamthomogenat und in subzellulären Fraktionen. Dementsprechend zeigte sich auch ein deutlich erhöhter Schweregrad in der akuten und chronischen Pankreatitis.
Unsere Experimente lassen vermuten, dass die Aktivität von Cathepsin B unter physiologischen Bedingungen durch Cystatin C unterbunden wird, um so eine verfrühte Aktivierung des Trypsinogens zu verhindern. Im Verlauf der Pankreatitis wird dieser protektive Mechanismus jedoch überwunden. Die Aktivität von Cathepsin B steigt deutlich in der schweren Zymogengranula-Fraktion an, trotz der Präsenz von Cystatin C.
Zusammenfassend lassen unsere Ergebnisse vermuten, dass prozessiertes (aktives) Cathepsin B selbst unter physiologischen Bedingungen im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen bereits vorhanden ist. Seine Aktivität wird dort durch Cystatin C inhibiert, wodurch eine vorzeitige, durch CTSB induzierte Trypsinogenaktivierung verhindert wird. Die Ansäuerung der sekretorischen Vesikel, wie bei der Pankreatitis, verringert die CTSB-Hemmung durch Cystatin C, während es gleichzeitig zu einer Cystatin C-Degradation durch Trypsin kommt. Dies ermöglicht eine verlängerte und pH-unempfindliche Protease-Aktivierung über CTSB in der Anfangsphase der Pankreatitis. Cystatin C spielt somit eine wesentliche Rolle für die Regulation der CTSB-Aktivität im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen und stellt damit einen entscheidenden pathophysiologisch relevanten Mechanismus für die akute und chronische Pankreatitis dar.
Die Pankreatitis ist eine relativ häufige gastrointestinale Erkrankung deren Pathomechanismus bisher nicht vollständig geklärt wurde. Besonders die Rolle des Immunsystems scheint einen wichtigen Einfluss auf den Verlauf dieser Erkrankung zu haben. Gut charakterisiert ist bereits die initiale lokale Immunantwort. Zerstörte Azinuszellen setzten DAMPs (engl. damage-associated molecular pattern) frei, die wiederum eine Infiltration von Zellen des angeborenen Immunsystems in das Pankreasgewebe induzieren und aktivieren. Zu diesen Zellen gehören Makrophagen und Neutrophile. T-Zellen, welche zum adaptiven Immunsystem gehören, wandern nicht in das Pankreas ein, sie werden jedoch systemisch aktiviert. Vor allem Th2-Zellen (T-Helferzellen Typ2) und Tregs (regulatorische T-Zellen) werden im Verlauf einer Pankreatitis induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Tregs während einer Pankreatitis nicht nur aktiviert werden, sondern ebenfalls eine höhere suppressive Kapazität besitzen.
Die genaue Rolle dieser antiinflammatorischen Immunantwort und im speziellen der Einfluss von Tregs sollte in dieser Arbeit mit Hilfe von DEREG Mäusen (engl. depletion of regulatory T cells) genauer charakterisiert werden. Durch gezielte Depletion von Tregs mittels DT (Diphtheria Toxin) kann die Auswirkung der Abwesenheit von Tregs im Pankreatitis-Mausmodell untersucht werden. Im akuten Modell kommt es zu einem systemischen Anstieg der T-Effektor-Immunantwort. Die Depletion von Tregs hat zudem eine Auswirkung auf den Schweregrad der Erkrankung. Unter Abwesenheit von Tregs sinkt im akuten Pankreatitis-Modell der pankreatische Schaden. Als eine mögliche Ursache konnte die Dysbalance der Treg/Th17 regulierten intestinalen Immunantwort identifiziert werden, welche zu einer Zerstörung der Darmbarriere führt und eine Translokation kommensaler Mikroorganismen ins nekrotische Pankreasgewebe initiiert.
Im chronischen Pankreatitis-Modell konnte gezeigt werden, dass die T-Zelldifferenzierung einen wichtigen Einfluss auf die Makrophagenpolarisation hat und dadurch den Verlauf der Chronifizierung der Pankreatitis mitbestimmt. Eine Depletion von Tregs in der chronischen Pankreatitis führt zu einer ungebremsten Th2-Antwort. Über die freigesetzten Zytokine, wie z.B. IL4, wird die Makrophagenpolarisation in Richtung der antiinflammatorischen Makrophagen verschoben. Diese Makrophagen induzieren über IL10 und TGFβ die Aktivierung ruhender PSCs (pankreatische Sternzelle) und regulieren somit Regenerationsprozesse. Kommt es zu einer Dysregulation dieser Makrophagenpolarisation, kann dieser Regenerationsprozess unkontrolliert erfolgen. Als Folge dessen kommt es nicht nur zu einer gesteigerten Aktivierung von PSCs, sondern auch zu einer exzessiven Kollagenproduktion, welche zu einer pathologische Fibrose führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass Tregs einen entscheidenden Einfluss auf die Gewebeumstrukturierung des Pankreas haben. Eine Depletion von Tregs im chronischen Pankreatitis-Modell induziert über die Aktivierung antiinflammatorischer Makrophagen eine Expression von PSCs. Diese unkontrollierte Induktion führt zu einer gesteigerten Kollagenproduktion und Bildung von fibrotischem Pankreasgewebe unter gleichzeitigem Verlust von Azinuszellen. Diese exzessive Gewebeumstrukturierung resultiert in einem Funktionsverlust des exokrinen Gewebes. Mäuse deren Tregs depletiert wurden verloren im chronischen Pankreatitis-Modell bereits nach 14 Tagen signifikant an Gewicht.
Weitere wichtige Faktoren, die im Regenerationsprozess eine Rolle spielen, sind Wachstumsfaktoren. Genexpressionsanalysen und histologische Färbungen verdeutlichen, dass Tregs die Induktion von Wachstumsfaktoren mitbestimmen.
Zusammengefasst bedeutet dies, dass Tregs im akuten Pankreatitis-Modell die T-Effektor-Immunantwort supprimieren und dadurch den Verlauf der Pankreatitis verschlechtern. Im chronischen Pankreatitis-Modell sorgen Tregs dahingegen für eine Balance der Makrophagenpolarisation, und regulieren den Remodeling-Prozess, indem sie z.B. die Bildung fibrotischem Gewebes limitieren.
Aufgrund der extremen Instabilität des Molybdän Cofaktors (MoCo) ist eine genauere Untersuchung der aktiven Zentren der lebenswichtigen MoCo-abhängigen Enzyme allein durch biochemische Methoden fast unmöglich. Hierfür liefert eine chemische Modellierung des Cofaktors die einzige Möglichkeit einen tieferen Einblick in seine Struktur und Funktion.
Die vorliegende Dissertation ermöglicht einen weitaus tieferen Einblick in Struktur-Funktionsbeziehung des Molybdän-Cofaktors hinsichtlich des zentralen Metalls und des Molybdopterin-Liganden. Zunächst wurde die Rolle des Molybdänzentrums in den Modellverbindungen detailliert analysiert. Hierfür wurde in den synthetisierten Modellen Molybdän mit Rhenium, ausgetauscht. Die erhaltenen Komplexe wurden zuerst umfangreichend durch verschiedene Methoden Kristallstrukturanalyse, IR-, Raman-, NMR-, 2D-NMR-Spektroskopie, temperaturabhängige Elektrochemie und quantenchemischen Berechnungen analysiert und auf Analogien und Unterschiede verglichen. Dabei wurde auf der Suche eines MoCo-Modells, das die richtige Balance zwischen katalytischer Aktivität und Stabilität besitzt, untersucht, ob Rhenium eine potenzielle Alternative zu Molybdän darstellen kann.
Um einen tieferen Einblick in die Chemie des Pterin-Strukturabschnitts von MoCo zu erschaffen, beschäftigt sich diese Arbeit mit der Feinabstimmung von Chinoxalin- und Pterin-Dithiolen-Liganden sowie mit der Entwicklung deren Molybdän-Komplexen. Dazu konnten neuartige Chinoxalin- und Pterin-Dithiolen-Liganden synthetisiert werden, die als Modell-Liganden für die Erforschung der Biosynthese des MoCos fungieren können. Hierin wird die Synthese und die vollständige Charakterisierung eines neuartigen Oxo-Bis(pterin)dithiolen-Molybdän-Komplexes beschrieben. Durch 2D-NMR Spektroskopie konnte die Struktur des erhaltenen Komplexes in Lösung detailliert analysiert werden. Schließlich wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals durchgeführte Untersuchungen zur Bindung von chemisch synthetisierten MoCo-Modellen mit dem Apoenzym der Trimethylamin-N-Oxid-Reduktase unternommen. Dabei konnte die essenzielle Rolle des Pterin-Gerüstes für die richtige Platzierung des Cofaktors in der Bindungstasche des Apoenzyms etwas näher aufgeklärt werden. Zukünftig könnten noch strukturell genauere MoCo-Modelle den Weg für die Synthese einer semi-artifiziellen Sulfitoxidase, die als eine Behandlungsmöglichkeit der Molybdän-Cofaktor-Defizienz (MoCoD) und der isolierten Sulfitoxidase-Defizienz (iSOD) eingesetzt werden, eröffnen.
Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist eine von vielen Krebserkrankungen. Viele Patienten weisen eine Mutation im Von-Hippel-Lindau-Gen (VHL) auf und/ oder zeigen eine Überexpression des Enzyms Nicotinamid-N-Metyltransferase (NNMT).
Es wurden insgesamt fünf etablierte Zelllinien verwendet, die embryonale Nierenzelllinie HEK-293 und vier ccRCC-Zelllinien (Caki-1, Caki-2, 769-P, 786-O), welche sich in ihrer Expression der Proteine NNMT und VHL unterscheiden.
Zudem wurde eine stabile Zelllinie aus den Caki-2 Zellen generiert, die durch ein Doxycyclin induzierbares Tet-On-System NNMT vermehrt exprimiert (C2NNMTs).
Es wurden sowohl molekularbiologische als auch biochemische Methoden zur Analyse angewendet.
Die Zelllinien wurden für Transfektionsstudien zur Überexpression oder zum Knockdown von NNMT genutzt, um die Einflussnahme auf die Enzyme Nikotinamid-phosphoribosyltransferase (NAMPT), Sirtuin 1 (SIRT1), Methioninadenosyltransferase-2 β-Untereinheit (MAT2B) und Aldehydoxidase (AOX1) zu analysieren.
Da SAM (S-Adenosylmethionin) der Methyldonor von NNMT ist, wurde auch der Einfluss der Methioninkonzentration betrachtet. Viele der bisherigen publizierten Versuche wurden bei 100 µM Methionin durchgeführt, was jedoch nicht der humanen Serumkonzentration entspricht, welche bei 20 µM Methionin liegt.
Umfangreiche massenspektrometrische Analysen führten zur Identifizierung weiterer Proteine, welche durch die NNMT-Modulation beeinflusst wurden. Die Identifikation einer Vielzahl veränderter Targets verdeutlichte den Einfluss auf den Energiemetabolismus bis hin zur Apoptose. Es zeigten sich unterschiedliche Regulationen von Glykolyse-, Respirations-, Citratzyklus-, Pentosephosphatweg- und Lipidsyntheseproteinen. Insgesamt ergaben sich individuelle, zellspezifische Regulierungen, welche auf die Sirtuine zurückzuführen sind.
Weiterhin wurden Untersuchungen zur erhöhten Expression von NNMT unter Einfluss von Nikotinamid (NAM) sowie Interleukin-6 (IL-6) durchgeführt. Die Analysen zeigten, dass zwischen der Pseudohypoxie und der Erhöhung der NNMT-Expression ein Zusammenhang besteht, denn IL-6 phosphoryliert ERK (engl. Extracellular-signal Regulated Kinases) und STAT3 (engl. Signal transducer and activator of transcription 3), welche beide benötigt werden, um die Transkription des NNMT-Gens zu beeinflussen und die NNMT-Proteinexpression zu fördern.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen dazu dienen, die biochemischen Zusammenhänge einer veränderten Expression von NNMT besser zu verstehen und damit neue diagnostische Ansätze zu ermöglichen.
Polykristallines Gold wurde bereits seit dem Ende des 19. Jahrhunderts elektrochemisch charakterisiert und seit Anfang des 20. Jahrhunderts regelmäßig als Arbeitselektrode in der elektrochemischen Analytik genutzt. Fälschlicherweise und trotz erster gegenteiliger Indizien, dominierte die Annahme, dass mechanisches Polieren die einzelnen Einkristallflächen des polykristallinen Materials freilegen würde, und dass deren statistisch gewichtetes elektrochemisches Verhalten reproduzierbar abgebildet werden könne. Mit dem Aufkommen neuer und verbesserter Verfahren zur Erzeugung hochwertiger Einkristallflächen parallel zur Entwicklung und Verbreitung leistungsstarker Techniken zur Oberflächenanalyse, konzentrierte sich die Goldforschung ab der Mitte des 20. Jahrhunderts auf die Charakterisierung der Einkristallflächen, ohne jedoch die neugewonnenen Erkenntnisse für die Interpretation des polykristallinen Materials zu nutzen. Gegenstand dieser Arbeit war daher die Kombination elektrochemischer Methoden (lineare und zyklische Voltammetrie) mit modernen Oberflächenanalysetechniken (Röntgendiffraktion, elektrochemische Unterpotentialabscheidung von Blei-Ionen) und bildgebenden Verfahren (AFM, STM, REM) zur Charakterisierung verschieden vorbehandelter polykristalliner Goldelektroden. Zudem sollte das elektrochemische Verhalten dieser Elektroden basierend auf dem bisherigen Wissen über das Verhalten der Einkristallflächen interpretiert werden. Der Großteil der erzielten Ergebnisse wurden in den drei Publikationen veröffentlicht, die den Hauptteil dieser Dissertation bilden. Zunächst konnte eine temporäre Aktivierung mittels mechanischer oder elektrochemischer Bearbeitung sowie eine Inaktivierung durch chemisches Ätzen in sauerstoffgesättigter Kaliumcyanidlösung, bezüglich der Sauerstoffreduktion als Referenzreaktion nachgewiesen werden, wobei Aktivierung und Inaktivierung relativ sind und im Zusammenhang mit der Anzahl sogenannter aktiver Zentren auf der Elektrodenoberfläche stehen (Publikation 1). Darüber hinaus erwiesen sich kontinuierliche Oxidations- und Reduktionszyklen an polierten polykristallinen Goldelektroden in schwefelsaurer Lösung als eine neue, Zusatzstoff freie Methode für die Goldnanopartikelsynthese, da diese wohldefinierte und immobilisierte Goldkristallite auf den Elektrodenoberflächen erzeugt (Publikation 2). Die sequenzielle Kombination aus Argon-Ionenstrahlätzen und thermischem Ausheizen hat sich hingegen als effiziente Methode zur Erzeugung sauberer und glatter Elektrodenoberflächen mit hoher atomarer Ordnung erwiesen (Publikation 3). Zugleich konnte gezeigt werden, dass polykristallines Gold ein eigenständiges Material ist, dessen Eigenschaften und Verhaltensweisen nicht ausschließlich auf das statistisch gewichtete elektrochemische Verhalten der einzelnen Einkristallflächen zurückzuführen sind, sondern auch von anderen energetischen Aspekten, wie beispielsweise der Koordination der Oberflächenatome im Kristallgitter, bedingt werden (Publikation 2 und 3).
Vor dem Hintergrund des noch wenig erforschten RNA-Ladungstransfers, lag der Fokus der Arbeit auf die Etablierung eines Ladungstranfers innerhalb einer funktionellen RNA. Als Modellsystem diente dazu das HPAR2, ein FMN-abhängiges Aptazym, dessen strukturdynamische Funktionsweise noch nicht komplett verstanden ist. Dabei galt es zum einen innerhalb der funktionellen Aptamerdomäne einen Ladungstransport zu etablieren. Zum anderen musste eine geeignete Position innerhalb der Aptamerstruktur für die Einführung eines nukleophilen Linkers identifiziert und verifiziert werden, um postsynthetisch die Verknüpfung mit dem FMN zu ermöglichen. Zusätzlich wurde durch die Synthese verschiedener nukleosidischer Sonden die Anwendung spektroskopischer Methoden zur Untersuchung dynamische RNA-Funktionen ermöglicht. Dabei gelang es eine neue Strategie zur Einführung einer Spin-Sonde in eine RNA zu entwickeln. Des Weiteren gelang die Darstellung einer nukleosidischen PHIP-Sonde, die eine außergewöhnlich hohe Signalverstärkung zeigte. Um die Funktionskontrolle des Modellsystems über einen intramolekularen Elektronentransport zu ermöglichen, musste zunächst die Synthese eines dementsprechend Linker-modifizierten Adenosins erfolgen. Der Einbau dieses Linker-modifizierten Adenosins durch chemische Festphasensynthese lieferte zwei RNAs, die durch Hybridisierung mit entsprechenden Gegensträngen das FMN-Aptamer und das FMN-abhängige Modellsystem HPAR2 bilden. Der zweite Teil dieser Arbeit, der Vorbereitung eines Elektronentransfer-sensitiven Aptazyms, setzte die Bereitstellung eines nukleosidischen Elektronendonors voraus. Dafür erfolgte die Synthese und Charakterisierung zweier Pyren-modifizierte Uridinderivate. Die Charakterisierung beider Elektronendonoren durch optische Spektroskopie (Fluoreszenz und UV/Vis) resultierte in vielversprechenden Hinweisen, dass die Erzeugung eines Überschusselektrons nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge gelang. Der erfolgreiche Einbau des substituierten Pyren-Nukleosidderivates in fünf verschiedene Duplex- und sechs verschiedene Aptamerstrukturen und deren spektroskopische Charakterisierung erlaubte die Untersuchung des RNA-Ladungstransports. Der Nachweis eines Ladungstransfers gelang für beide Systeme über zwei unterschiedliche Methoden. Einerseits konnte der Ladungstransfer über Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen werden und andererseits gelang der Nachweis über die Degradierung des eingebauten Akzeptors. Diese Ergebnisse stellen den ersten Ladungstransfers durch eine nicht Watson-Crick gepaarte Nukleinsäurestruktur dar. Zudem ist dies die erste Demonstration eines Sequenz-abhängigen Ladungstransportes innerhalb einer RNA.
β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von großem Interesse insbesondere für die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungsverfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringfügig untersucht worden und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib noch nicht in großtechnischem Maßstab eingesetzt. Wünschenswert ist die Etablierung einer Synthese, welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden Enantiomere jeweils die höhere biologische Wirksamkeit aufweisen.
Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen für β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase.
Zunächst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale Analytik für die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch für 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss über die Konzentration und den Enantiomerenüberschuss gab.
Die vier zur Verfügung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivitäten in einem photometrischen NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von ca. 150 Amintransaminasen wurde bezüglich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden für Pregabalin sechs und für Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Umsätze bis zu 90% bei 99%ee (R) mit IMAC-gereinigter 3FCR_5M erzielt werden.
Um Kosten für ein späteres großtechnisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion ebenfalls für den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass geringere Enantiomerenüberschüsse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der Substratverbrauch höher als die Produktbildung war. Als mögliche Ursachen wurden der Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivität durch die veränderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gewünschten Substrat-Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Phänomen konnte durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung jedoch erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden.
Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine höhere Substratkonzentration nicht einen proportional höheren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzymlösung gesteigert werden, sodass ein Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe erfordern würde. Praktikabel wäre einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erhöhung der Enzymstabilität durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR_5M im größeren Maßstab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von 30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivität im Vergleich zur Expression im Schüttelkolben erzeugt werden.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage für die Transaminase-vermittelte Synthese von (R)-Baclofen geschaffen wurde. In zukünftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in großem Maßstab im Fokus stehen.
Die Hälfte der globalen Primarproduktion wird in den Ozeanen realisiert und dabei wird ein großer Anteil des fixierten CO2 genutzt, um Algenpolysaccharide zu synthetisieren. Diese Kohlenhydrate dienen als wichtige Kohlenstoff- und Energiequelle für marine Nahrungsnetze, wobei sie von kohlenhydrataktiven Enzymen zu monomeren Zuckern umgesetzt werden. Da bisher wenig über den enzymatischen Abbau von Algenpolysacchariden in den Ozeanen bekannt ist, war es das Ziel dieser Arbeit, zu einem tieferen Verständnis dieser Prozesse beizutragen.
O-Methylierungen stellen stabile Modifikationen an Zuckern in marinen und terrestrischen Polysacchariden dar. Es wurde in Artikel I gezeigt, dass Cytochrom P450 Monooxygenasen eine wichtige Funktion in enzymatischen Abbausystemen aus marinen Bakterien für Agar haben, wobei diese Enzyme die oxidative Demethylierung von 6-O-Methyl-D-galaktose, einem Monomer aus Rotalgenpolysacchariden, katalysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der P450-Subfamilie CYP236A um die zweite beschriebene Gruppe von kohlenhydrataktiven Monooxygenasen handelt. Die charakterisierten P450s sind hochspezifisch für 6-O-Methyl-D-galaktose und akzeptieren keine typischen P450-Substrate. Um die molekularen Faktoren für den spezifischen Umsatz dieses polaren Substrates aufzuklären, wurde Proteinkristallografie genutzt (Artikel II). Die Kristallstruktur der P450 Monooxygenase aus Z. galactanivorans mit gebundenem Substratmolekül zeigt, dass sowohl Wasserstoffbrückenbindungen als auch hydrophobe Interaktionen an der Substraterkennung beteiligt sind, was zusätzlich durch ITC sowie Mutationsstudien bestätigt wurde.
Schnellwachsende Grünalgen der Gattung Ulva führen weltweit zu gefährlichen Algenblüten. Ein Hauptbestandteil der gebildeten Biomasse stellt das anionische Polysaccharid Ulvan dar. Bisher war der enzymatische Ulvanabbau kaum verstanden, was die sinnvolle Nutzung von Ulva-Biomasse erschwerte. Die detaillierte biochemische Charakterisierung einer Ulvanlyase auf F. agariphila wird in Artikel III gezeigt. Dieses Enzym katalysiert den ersten Schritt im Ulvanabbau und die biochemischen Parameter stimmen mit den Umweltbedingungen in Küstenbereichen des gemäßigten Ozeans überein, dem Habitat, aus dem dieses Bakterium isoliert wurde. Alle nachfolgenden Schritte im kompletten enzymatischen Ulvanabbau wurden aufgeklärt und sind in Artikel IV zum ersten Mal beschrieben. Insgesamt 13 Enzyme aus den Klassen der Polysaccharidlyasen, Glykosidhydrolasen sowie Sulfatasen agieren in einer komplexen Kaskade zusammen, um schlussendlich monomere Zucker aus Ulvan bereitzustellen.
Die gezeigten Identifizierungen und Charakterisierungen von neuen kohlenhydrataktiven Enzymen tragen nicht nur zu einem besseren Verständnis der Vorgänge im marinen Kohlenstoffkreislauf bei, sondern bilden zudem die Grundlage für zukünftige biotechnologische Prozesse. Eine effiziente enzymatische Depolymerisation der Algenpolysaccharide ist nötig, um Bioraffineriekonzepte basierend auf Algenkohlenhydraten zu realisieren. Dabei können über mikrobielle Fermentation Biokraftstoffe der zweiten Generation oder andere nützliche Produkte hergestellt werden.
Die akute Pankreatitis ist durch eine vorzeitige intraazinäre Proteasen-Aktivierung gekennzeichnet, wobei diese im Verlauf der Erkrankung durch eine zunehmende Immunantwort mit in das Pankreas infiltrierenden Immunzellen ergänzt wird. Eine besondere Bedeutung hat die intrazelluläre Aktivierung der Serinprotease Trypsinogen, die in Abhängigkeit der lysosomalen Hydrolase Cathepsin B (CTSB) verläuft.
Wir konnten zeigen, dass verschiedene lysosomale Proteine (Cathepsin D (CTSD), Cathepsin C (CTSC)) nach pathologischem Stimulus in das sekretorische Kompartiment (Zymogengranula) umverteilt werden. Cathepsin D ist in der Lage, das Schlüsselenzym Cathepsin B zu aktivieren, indem es das Pro-Enzym zu aktivem Enzym spaltet. Der Ort dieser proteolytischen Aktivierung sind die sekretorischen Vesikel. Eine pharmakologisch induzierte Permeabilisierung der Lysosomen mit nachfolgendem Ausbleiben der Umverteilung der Enzyme in das sekretorische Kompartiment zeigte, dass die vorzeitige Zymogen-Aktivierung in der Frühphase der Pankreatitis erhalten geblieben ist und unabhängig vom Lysosom verläuft. Eine CTSB-Abhängigkeit bleibt jedoch bestehen. Ein Fehlen von CTSD in den Azinuszellen führt zu einem nur transient milderen Verlauf der akuten Pankreatitis, wie anhand von CTSDf/f/p48Cre/+ Mäusen demonstiert werden konnte, die einen Pankreas-spezifischen CTSD Knockout besitzen. Ein anhaltend milderer Verlauf der Pankreatitis fand sich in CTSD-/- Mäusen, der auf eine verminderte Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine in Immunzellen zurückzuführen ist. Auch bei Defizienz von CTSC war der Schweregrad der akuten Pankreatitis milder, wie in CTSC-/- Mäusen experimentell demonstiert werden konnte. Ursächlich hierfür ist vor allem ein reduziertes Einwandern neutrophiler Granulozyten in das Pankreas und in die extrapankreatischen Organe (Lunge), die auf eine geringere Aktivität der Serinprotease Neutrophilen Elastase und verminderte Spaltung des Zell-Kontakt Moleküls E-Cadherin beruhen. Umgekehrt beeinflusste das Fehlen von CTSC in den Azinuszellen nicht die vorzeitige Proteasen-Aktivierung.
Unsere Arbeit unterstreicht die Bedeutung lysosomaler Enzyme in der akuten Pankreatitis und zeigt, dass diese Enzyme maßgeblichen Einfluss auf die Funktion von Immunzellen haben, die den Verlauf der Erkrankung wesentlich mitbestimmen. Unsere Arbeit zeigt außerdem, dass der primäre Ort der intrazellulären und vorzeitigen Proteasen-Aktivierung alleinig im sekretorischen Kompartiment stattfindet und nicht von einer Fusion mit dem lysosomalen Kompartiment abhängig ist.
Analyse der metabolischen Anpassung von Streptococcus pneumoniae an antimikrobielle Umwelteinflüsse
(2019)
Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae ist ein humanspezifisches Pathogen des oberen Respirationstraktes. Der opportunistische Krankheitserreger kann jedoch mehrere Organe befallen und tiefer in den Körper vordringen, was zu lokalen Entzündungen wie Sinusitis und Otitis media oder zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonie, Meningitis oder Sepsis führen kann. Für das Bakterium S. pneumoniae wurden bisher kaum Metabolom-Daten erhoben. Daher war das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Metaboloms von S. pneumoniae. In dieser Dissertation wurden als analytische Methoden die Gaschromatografie (GC) und Flüssigkeitschromatografie (LC) jeweils gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) sowie die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verwendet, um die Metaboliten zu analysieren. Es sind mehrere Analysetechniken erforderlich, um den Großteil des Metaboloms mit seinen chemisch verschiedenen Metaboliten zu erfassen. Artikel I fasst die Literatur zu Untersuchungen des Metabolismus von S. pneumoniae in den letzten Jahren zusammen. Um eine Momentaufnahme des biologischen Systems zum jeweiligen Zeitpunkt zu erhalten, ist neben dem reproduzierbaren Wachstum während der Kultivierung auch die exakte Probenahme zu beachten. Aus diesem Grund wurde in dieser Dissertation ein Probenahmeprotokoll für das Endometabolom von S. pneumoniae etabliert (Artikel II). Mithilfe des optimierten Protokolls wurde eine umfassende Metabolomanalyse in einem chemisch definierten Medium durchgeführt (Artikel II). Um S. pneumoniae in einer Umgebung ähnlich der im Wirt zu untersuchen, wurde in einem modifizierten Zellkulturmedium kultiviert. Intermediate zentraler Stoffwechselwege von S. pneumoniae wurden analysiert. Das intrazelluläre Stoffwechselprofil wies auf einen hohen glykolytischen Flux hin und bot Einblicke in den Peptidoglykan-Stoffwechsel. Darüber hinaus widerspiegelten die Ergebnisse die biochemische Abhängigkeit von S. pneumoniae von aus dem Wirt stammenden Nährstoffen. Ein umfassendes Verständnis der Stoffwechselwege von Pathogenen ist wichtig, um Erkenntnisse über die Anpassungsstrategien während einer Infektion zu gewinnen und so neue Angriffspunkte für Wirkstoffe zu identifizieren.
Die zunehmende Verbreitung von resistenten S. pneumoniae-Stämmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen. Im Zuge dessen wurde in Artikel III die metabolische Reaktion von S. pneumoniae während des Wachstums unter dem Einfluss antibakterieller Substanzen mit dem Ziel der Identifizierung metabolischer Anpassungsprozesse untersucht. Dabei wurden Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen verwendet, wie die Beeinflussung der Zellwandbiosynthese (Cefotaxim, Teixobactin-Arg10), der Proteinbiosynthese (Azithromycin) sowie Nukleotidsynthese (Moxifloxacin). Es konnten keine Wirkmechanismus-spezifischen Marker-Metaboliten identifiziert werden. Jedes Antibiotikum verursachte weitreichende Veränderungen im gesamten Metabolom von S. pneumoniae. Die Nukleotid- und Zellwandsynthese waren am stärksten betroffen. Besonders vielversprechend sind Antibiotika mit zwei Wirkorten wie Teixobactin-Arg10 und Kombinationen aus zwei Antibiotika. In dieser Dissertation wurde das erste Mal das synthetisch hergestellte Teixobactin-Arg10 mittels einer der modernen OMICS-Techniken untersucht. Die vorliegende umfassende Metabolom-Studie bietet wertvolle Erkenntnisse für Forscher, die an der Identifizierung neuer antibakterieller Substanzen arbeiten.
Insgesamt tragen die Ergebnisse der Dissertation zu einem besseren Verständnis der bakteriellen Physiologie bei.
Synthesen modifizierter Nukleoside zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen
(2019)
Im Fokus dieser Arbeit lagen die Synthesen verschiedener Nukleosidderivate zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen. Es wurden erfolgreich zwei Adenosinderivate synthetisiert und die für die post-synthetische Markierung benötigte Aminofunktion entweder mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung an der Position C2 oder der Heck-Reaktion an der Position C8 eingebaut. Um auch Zugang zu modifizierten Cytidinen zu erhalten, wurde eine Synthesestrategie für ein aktiviertes Uridinderivat entworfen, um dieses nach der chemischen Synthese mittels Phosphoramiditverfahren, während der Reinigung, in das dazugehörige Cytidinderivat umzuwandeln. Hierzu wurden die funktionellen Gruppen erfolgreich für die chemische Oligonukleotidsynthese geschützt, die Modifikation an der Position C5 mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung eingebaut und die Position C4 mit Hilfe von TIPS-Cl (2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid) aktiviert. In Vorversuchen konnte die erfolgreiche Umwandlung in das Cytidinderivat experimentell bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss ausgewählter basenmodifizierter Nukleoside auf den Charakter einer doppelsträngigen RNA untersucht. Dazu wurden die Schmelzkurven und Schmelzpunkte modifizierter und unmodifizierter Oligonukleotide gemessen und ausgewertet. Die erhaltenen Daten lassen darauf schließen, dass der Einbau von basenmodifizierten Nukleosiden zur Senkung des Schmelzpunktes führt, jedoch nicht zur Veränderung des doppelsträngigen Charakters. Eine anschließende Markierung eines modifizierten Oligonukleotids mit dem Farbstoff ATTO 680 scheint nur einen marginalen Einfluss auf den Schmelzpunkt, im Vergleich zu den Schmelzpunkten der modifizierten Oligonukleotide, zu haben. Für die Untersuchung der Funktion und Struktur von größeren RNA-Molekülen, wie zum Beispiel ROSE-Elementen, wurde eine Strategie zu deren Herstellung mit Hilfe der T4 RNA Ligase I entwickelt und ex-perimentell bestätigt. Dazu wurde das ROSE-Element in drei Segmente geteilt, diese chemisch synthetisiert, gereinigt und mit Hilfe der T4 RNA Ligase I zum vollständigen Element ligiert. Dabei konnte das ROSE-Element erfolgreich vom 5´-Terminus aufgebaut werden. Es steht nun eine Methode zur Verfügung, um auch modifizierte Oligonukleotide zu einem ROSE-Element zu ligieren und dieses auf seine Funktion und Struktur hin zu untersuchen. Eine RNA 4-way-junction wurde durch Hybridisierung generiert und für strukturelle Untersuchungen verfügbar gemacht.