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Die Regulation der Phospholipid-Biosynthesegene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erfolgt über die Verfügbarkeit der Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC). Bei ICMangelbedingungen wird die Transkription der Strukturgene stimuliert und bei IC-Überschuss im Medium reprimiert. Im Promotorbereich dieser Gene befinden sich spezifische UAS-Elemente („inositol/choline-responsive element“, ICRE-Motive), welche von den Aktivatoren Ino2 und Ino4 gebunden werden. Bei IC-Mangel kommt es zu einer Anhäufung des Intermediats Phosphatidsäure, wodurch der Repressor Opi1 durch die Interaktion mit Scs2 außerhalb des Zellkerns am endoplasmatischen Reticulum gebunden wird. Wenn ausreichend IC im Medium vorhanden ist, kann der Repressor Opi1 in den Zellkern einwandern und den Aktivator Ino2 binden. Ferner kann Opi1 über seine Opi1-Sin3-Interaktionsdomäne (OSID) mit der PAH1 („paired amphipathic helix“) des Corepressors Sin3 interagieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ausgewählte Aminosäuren in der OSID durch gerichtete Mutagenese gegen Alanin auszutauschen und die erhaltenen Opi1-Varianten auf ihre Repressorfunktion hin zu untersuchen. Die Substitution einzelner Aminosäuren innerhalb der OSID offenbarte die Notwendigkeit der Aminosäuren L56, V59 und V67 für die Opi1-Sin3 Bindung. Die Ergebnisse legten außerdem nahe, dass die Repression nicht allein über Sin3 vermittelt wird. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die innerhalb der OSID von Opi1 kritischen Aminosäuren der Opi1-Sin3 Bindung (L56, V59 und V67) auch für die Interaktion von Opi1 mit Cyc8 wichtig sind. Dementsprechend rekrutiert Opi1 mit Hilfe der OSID zwei pleiotrope Corepressoren. Sin3 bindet über die PAH1 an die OSID, während die Opi1-Cyc8- Bindung über die TPR-Motive im Cyc8 vermittelt wird. Desweiteren zeigte sich, dass die sin3 cyc8 Doppelmutante synthetisch letal ist. Sin3 ist eine Untereinheit in mehreren Komplexen der Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 und fungiert als Plattform für viele Protein-Protein Wechselwirkungen. Innerhalb des Sin3/Rpd3LKomplexes wurde der Einfluss mehrerer Untereinheiten (Pho23, Sap30, Sds3, Ume1 und Dep1) untersucht. Hier zeigte sich, dass Pho23 einen entscheidenden Einfluss auf die Regulation ICRE-abhängiger Gene hat. In den sich anschließenden Interaktionsanalysen konnte eine Bindung von Pho23, Sds3 und Sap30 an Sin3 gezeigt werden. Eine genauere Kartierung der Pho23-Sin3 Bindung zeigte, dass Pho23 über zwei voneinander unabhängige Domänen (Pho23-Sin3-Interaktionsdomäne; PSID1 und PSID2) mit Sin3 wechselwirkt, wobei die Interaktion der PSID1 und der PSID2 mit der HID (HDAC-Interaktionsdomäne) im Sin3 erfolgt. Die katalytische Aktivität innerhalb der Sin3/Rpd3-Komplexe ist durch die HDAC Rpd3 gegeben. Durch Untersuchungen der HDACs der Klasse I (Rpd3, Hos1 und Hos2) bzw. der Klasse II (Hda1 und Hos3) konnte für ICRE-abhängige Genorte gezeigt werden, dass eine rpd3 hda1 hos1 Dreifachmutante ähnlich dereguliert ist wie eine sin3 Mutante. Bei Interaktionsstudien der HDACs Rpd3, Hda1 und Hos1 mit Sin3 konnten neben der bereits bekannten HID im Sin3 (aa 801-1100) zwei neue HIDs (HID2: aa 473-600, HID3: aa 1100- 1210) identifiziert werden. Die Histondeacetylase Rpd3 bindet an die HID1 und an die HID3, während Hda1 und Hos1 jeweils an HID2 und HID3 binden. Interessanterweise stellte sich heraus, dass die Bindedomäne für die Sin3-Bindung innerhalb der Deacetylase-Domäne (DAC) aller drei HDACs liegt. Für Hos1 konnte die Sin3 Bindedomäne auf einen Aminosäurebereich von 236-400 eingegrenzt werden. Für die Hda1- Sin3 Bindung konnten zwei voneinander unabhängig interagierende Bereiche im Hda1 (aa 201-250 und aa 251-300) beschrieben werden. Neben der Deacetylierung wurde der regulative Einfluss einer weiteren kovalenten Histonmodifizierung, nämlich der der Methylierung durch Histonmethyltransferasen (HMT; Set1, Set2 und Dot1) und der Demethylierung durch Histondemethylasen (HDM; Jhd1, Jhd2, Ecm5, Gis1 und Rph1) auf die Genexpression der Phospholipid-Biosynthesegene untersucht. Hier konnte für die HMT Set2 (spezifisch für Lysin-36 im Histon H3) ein großer Einfluss auf die ICRE-abhängige Genexpression gezeigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, das Set2 direkt an Ino2 bindet. Die Kartierung der Interaktionsdomäne offenbarte, dass die katalytische SET Domäne im Set2 mit der DNA-bindenden bHLHDomäne von Ino2 wechselwirkt.
Als Mitglieder der Ordnung Lactobacillales ist das Hauptkatabolit der Pneumokokken sowohl unter aerober wie auch microaerophiler Atmosphäre Lactat. Des Weiteren synthetisiert S. pneumoniae eine große Bandbreite an ABC-Transportersystemen, die an der Assimilation und an dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, löslichen Verbindungen und Aminosäuren beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde der Kohlenstoffmetabolismus mittels 13C-Isotopologen Verteilung nach Wachstum der Pneumokokkenkultur in chemisch definiertem Medium (CDM) mit [U-13C6]Glucose, [1,2-13C2]Glucose oder [U-13C2]Glycin analysiert. GC/MS-Analysen zeigten ein Muster an schwer-markierten und unmarkierten Kohlenstoffatomen in den Aminosäuren. Die Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass Pneumokokken sowohl einzelne Aminosäuren aufnehmen, wie auch über klassische oder nicht-klassische Biosynthesewege de novo synthetisieren können. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro und Gly blieben im Isotopolog Profiling unmarkiert, was ein Hinweis auf das Fehlen von Biosynthesewegen oder ihrer Regulation unter bestimmten Umweltbedingungen sein könnte. Obwohl die genetische Information für die Biosynthese der essentiellen verzweigtkettigen Aminosäuren (BAA; Ile, Leu und Val) in S. pneumoniae vorhanden ist, ergaben die 13C-Markierungsversuche keine de novo Synthese. Jedoch konnte durch Langzeit-1H-NMR (LT-NMR) Analysen eine aktive Aufnahme dieser Aminosäuren nachgewiesen werden. Darüber hinaus wird Aspartat nicht über den allgemeinen Stoffwechselweg mit Pyruvat und Acetyl-CoA synthetisiert. Die Aspartat-Synthese erfolgt im ersten Schritt durch die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und CO2 zu Oxalacetat. Im zweiten Schritt wird Oxalacetat dann in Aspartat mit der Nebenreaktion Glutamat zu alpha-Ketoglutarat durch die Aspartat-Transaminase metabolisiert. GC/MS Analysen ergaben weiterhin, dass komplett markierte aromatische Aminosäuren aus Erythrose-4-Phosphat und zwei Molekülen PEP über das Intermediat Chorismat synthetisiert wurden. Es zeigte sich außerdem, dass [M+1] markiertes Serin durch die Hydroxymethylierung von unmarkiertem Glycin über 5,10-Methylentetrahydrofolat als Teil des C1-Pools hergestellt wurde. Weiterhin wurden In LT-NMR-Untersuchungen Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metabolite quantifizert. Die homofermentative Milchsäuregärung konnte in Pneumokokken durch einen extrazellulären Anstieg der Lactatkonzentration nachgewiesen werden. Als essentielle Kandidaten wurden Glutamin und Uracil identifiziert, die das Pneumokokkenwachstum bei Mangel einschränken. Diese Ergebnisse zeigen die Vielzahl von Aminosäuren-Synthesewegen in Pneumkokken und die notwendige Rolle der Transportersysteme in Pneumokokken für die bakterielle Fitness und für die Adaption an verschiedene Wirtsnischen. Sechs mögliche Glutamin-Aufnahmesysteme konnten durch Genomanalysen von Streptococcus pneumoniae Stämmen identifiziert werden. Die Reverse Transkriptions-PCR haben gezeigt, dass die sechs gln-Operons unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Vier der gln-Gencluster bestehen aus den Genen glnQPH, während in zwei Regionen das Gen glnH, welches für eine lösliche Glutamin-Bindungsdomäne kodiert, fehlt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss zwei dieser Glutamin-ABC-Transporter, mit den Operons glnQPH0411/0412 und glnQPH1098/1099, in S. pneumoniae D39 auf Virulenz und Phagozytose untersucht. Die zwei charakterisierten Transportersysteme bestehen jeweils aus der ATPase GlnQ und einem translatorischem Fusionsprotein aus der Permease GlnP und dem Bindungsprotein GlnH. Für die Untersuchungen wurden diese beiden Transporter mittels Insertations-Deletions-Mutagenese inaktiviert. CD-1 Mäuse, die intranasal mit biolumineszierenden D39delgln0411/0412 infiziert wurden, zeigten in Echtzeit eine signifikant erhöhte Überlebenszeit und eine Attenuierung bei der Ausprägung einer Pneumonie im Vergleich zu biolumineszierenden Wildtyp D39 Pneumokokken. Im murinen Sepsismodell mit der D39delgln0411/0412-Mutante zeigte sich eine gemäßigte, aber signifikante Abschwächung der Pathogenese. Im Gegensatz dazu war die D39delgln1098/1099 Mutante sowohl im murinen Pneumonie- wie auch Sepsismodell massiv attenuiert. Es war eine 100- bis 10000- fach höhere Infektionsdosis erforderlich, um mit der D39delgln1098/1099-Mutante eine vergleichbare Pathogenese der Pneumonie oder Sepsis wie beim Wildtypstamm D39 hervorzurufen. Im experimentellen Meningitismodell zeigten sich bei der D39delgln1098/1099-Mutante eine erniedrigte Anzahl an Leukozyten im Liquor und ein reduzierter Bakterientiter im Blut im Vergleich zu D39 und D39delgln0411/0412. Auch die Phagozytose-Experimente bestätigten eine signifikante verminderte Überlebensrate der beiden gln-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae D39, was auf den Einfluss der bakteriellen Fitness auf den Schutz gegen oxidativen Stress hinweist. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass beide Glutamin-Aufnahmesysteme für die vollständige Virulenz der Pneumokokken essentiell sind, aber verschiedene Auswirkungen auf die Pathogenese der Bakterien unter in vivo Bedingungen haben. Das Zelloberflächenprotein PavA der Pneumokokken ist ein Virulenzfaktor, der für invasive Erkrankungen wichtig ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PavA essentiell für die in vivo Besiedlung von Streptococcus pneumoniae D39 in den oberen Atemwegen von Mäusen ist. In dem murinen Pneumoniemodell wurden pavA-Mutanten nicht aus den infizierten Mauslungen eliminiert, sondern persistierten und lösten somit eine chronische Infektion aus, während Wildtyp-Pneumokokken systemische Erkrankungen verursachten. PavA-defiziente Pneumokokken konnten unter experimentellen Bedingungen nicht aus der Lunge in die Blutbahn streuen. Diese Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass PavA an der erfolgreichen Kolonisation der Schleimhautoberflächen und an der Translokation der Pneumokokken durch Wirtsbarrieren beteiligt ist.