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Übergewicht ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für kardiovaskuläre und metabolische
Erkrankungen. Vor allem eine vermehrte Akkumulation von viszeralem Fettgewebe (VAT) im
Vergleich zu subkutanem Fettgewebe (SAT) wird als Hauptursache für Adipositas-assoziierte
Erkrankungen vermutet. In der vorliegenden Arbeit wurden ungerichtete metabolische
Analysen (Metabolomics) verwendet, um metabolische Stoffwechselwege und kleinste
Moleküle zu identifizieren, die mit einer Akkumulation von VAT oder SAT assoziiert sind.
Die Studienpopulation bestand aus 491 Proband:innen ohne metabolische Erkrankungen (192
Männer, 299 Frauen), die im Rahmen einer großen populationsbasierten Studie aus dem
Nordosten Deutschlands intensiv untersucht wurden. Mit Hilfe linearer Regressionsmodelle
wurden die Assoziationen zwischen der mittels MRT quantifizierten Menge der
Fettkompartimente VAT und SAT und dem Metabolom im Plasma und Urin untersucht. Die
Metabolite wurden dabei durch massenspektrometrische Verfahren quantifiziert. Insgesamt
zeigte sich, dass VAT mehr Assoziationen zum Metabolom des Plasmas (54 Metabolite) und
Urins (101 Metabolite) aufwies als SAT (20 Plasmametabolite; 29 Urinmetabolite). Letzteres
metabolische Profil wurde fast vollständig von den zu VAT assoziierten Signaturen überlagert.
Geschlechtsspezifische Unterschiede ließen sich nur bei einem geringen Anteil der
untersuchten Assoziationen identifizieren. Signifikante Assoziationen ließen sich vor allem mit
Fettsäure-Abkömmlingen und Zwischenprodukten aus dem Metabolismus von
verzweigtkettigen Aminosäuren beobachten. Außerdem waren Metabolite signifikant
assoziiert, die einen veränderten Kohlenhydrat- und Kortisol-Metabolismus anzeigen. Darüber
hinaus ließen sich Assoziationen mit Markern aus dem Darm-Mikrobiom abbilden, die
vermutlich einen ungünstigen Lebensstil widerspiegeln. Zudem konnte eine neuartige positive
Assoziation zwischen VAT und den im Plasma gemessenen Gehalt des pharmakologischen
Wirkstoffes Piperin nachgewiesen werden. Alles in allem lassen sich Hinweise bezüglich der
Entwicklung von Adipositas-bezogenen Krankheiten liefern. Die vorliegende Studie stellt somit
die Gesundheit des Metaboloms bei „gesunden“ Personen in Frage und bietet die Möglichkeit,
die Entstehung von Adipositas auf molekularer Ebene zu verstehen. Es sind jedoch
weiterführende Untersuchungen notwendig, um diejenigen Menschen zu identifizieren,
deren Metabolom Auffälligkeiten zeigten und so bereits frühzeitig der Entstehung von
Krankheiten entgegenwirken zu können.
Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von zwei putativen Virulenzgenen von Burkholderia pseudomallei. Es wurde ein klassischer LysR-Typ Transkriptionsregulator (BPSL0117) mittels Tn5 Mutagenese als wichtiger Virulenzfaktor gefunden und mit verschiedenen in vitro, in vivo und weiterer molekularer Methoden wie gelfreie Proteomics untersucht. Daneben wurde ein hypothetisches Protein (BPSS1528 = bapA) mit unbekannter Funktion aus einen Typ-III-Sekretionssystem gezielt deletiert und funktionell beschrieben. Diese Mutante wies letztlich keine eingeschränkte Virulenz im Vergleich zum Wildtypstamm aus.
Charakterisierung der Expression und Funktion metabolischer Enzyme im humanen intestinalen Gewebe
(2019)
Bei der Arzneimittelentwicklung liegt der Fokus nicht nur auf der Wirksamkeit und Sicherheit einer pharmakologisch aktiven Substanz, sondern auch auf einer möglichst einfachen, idealerweise oralen Applikation. Um die benötigten Wirkstoffkonzentrationen im Zielorgan zu erreichen, wird die einzunehmende Dosis eines Medikaments in Abhängigkeit der präsystemischen Elimination ermittelt. Inzwischen ist bekannt, dass nicht ausschließlich der hepatische, sondern auch der intestinale Stoffwechsel die orale Bioverfügbarkeit eines Medikaments wesentlich beeinflussen kann. Arzneistoffe, die während der Darmpassage einer starken Metabolisierung unterliegen, sind zudem prädestiniert für unerwünschte Interaktionen mit anderen Substanzen, welche die entsprechenden Stoffwechselenzyme hemmen oder induzieren. Für die Abschätzung pharmakokinetischer Parameter eines neuen Wirkstoffs sind daher Kenntnisse zur Expression sowie Funktion klinisch relevanter intestinaler Stoffwechselenzyme von Bedeutung.
Bisher publizierte Daten basieren größtenteils auf der Genexpression, obwohl aufgrund posttranskriptionaler Prozesse nicht zwingend Aussagen zur resultierenden Proteinmenge getroffen werden können. Die verfügbaren Daten zum intestinalen Proteingehalt wurden mittels immunologischer Methoden erhoben, die erhebliche Limitationen in Bezug auf Spezifität, Reproduzierbarkeit und Robustheit aufweisen. Diese Aspekte finden bei den inzwischen etablierten LC-MS/MS-basierten Targeted-Proteomics-Methoden Berücksichtigung. Dazu werden die Proteine einer Messprobe enzymatisch gespalten, um entstehende proteospezifische Peptide zur Quantifizierung der Proteine von Interesse zu nutzen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung und Validierung einer entsprechenden Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 sowie UGT2B15 in biologischen Matrices, welche die aktuell gültigen Leitlinien in Bezug auf Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision und Stabilität erfüllt. Bereits bei der ersten Anwendung der Methode zur Quantifizierung der Enzyme in kommerziell erhältlichen und selbst isolierten Mikrosomen zeigte sich, welchen erheblichen Einfluss die Probenvorbereitung auf die ermittelten Proteingehalte hat.
Diese Erkenntnis wurde im Rahmen eines internationalen Projektes bestätigt, bei dem humane Leberproben desselben Ursprungs in diversen Laboren mit den dort etablierten Methoden prozessiert worden sind. Bezogen auf die eingesetzte Gewebemenge ergaben sich bei der Messung der Mikrosomen 6 - 30-fach geringere Enzymgehalte als bei der Analyse des nicht-fraktionierten Gewebes, da die subzelluläre Aufspaltung einer Probe mit erheblichen Proteinverlusten einhergeht. Folglich wurden alle weiteren Untersuchungen zur absoluten Enzymquantifizierung unter Verwendung von filterbasierten Zentrifugaleinheiten (filter aided sample preparation; FASP) mit Gesamtgewebelysatproben durchgeführt. Sowohl die optimierte Probenaufarbeitung als auch die validierte Targeted-Proteomics-Methode fanden bei der Untersuchung der Darmsegmente von 9 Spendern Anwendung, wobei jeweils Gewebe aus dem Duodenum, oberen und unteren Jejunum, Ileum sowie Colon zur Verfügung stand. Von den 13 untersuchten Enzymen wurden in allen Dünndarmabschnitten nur CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3 und UGT2B7 nachgewiesen, deren Gehalt im Jejunum am höchsten war. Im Colon wurde auf Proteinebene keines der Metabolisierungsenzyme detektiert. Die entsprechenden Genexpressionsdaten dieser 8 Enzyme korrelieren signifikant mit den ermittelten Proteinwerten. Korrespondierend zur fehlenden Nachweisbarkeit der übrigen 5 Enzyme auf Proteinebene waren die Gene CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 sowie UGT2B15 nur sehr geringfügig und CYP1A2 gar nicht exprimiert.
Zur Charakterisierung der metabolischen Aktivität der intestinalen Enzyme wurde eine weitere LC-MS/MS-basierte Methode entwickelt und validiert. Als Modellsubstrate fungierten Diclofenac (CYP2C9), Omeprazol (CYP2C19), Dextromethorphan (CYP2D6), Midazolam (CYP3A), Ezetimib (UGT1A) und Naloxon (UGT2B7). Die begrenzte Verfügbarkeit des intestinalen Gewebes sowie dessen sehr geringer mikrosomaler Proteingehalt stellten besondere Anforderungen an die Sensitivität der Methode. Ihre Eignung zur Charakterisierung der intestinalen Metabolisierungsaktivität wurde bei der Anwendung auf ein jejunales Mikrosomen-Gemisch gezeigt.
Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten zur Expression klinisch bedeutsamer Metabolisierungsenzyme entlang des humanen Darms tragen zu einem besseren Verständnis des intestinalen First-Pass-Metabolismus bei. Diese Kenntnisse können sowohl bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe als auch für die Erstellung von Physiologie-basierten pharmakokinetischen Modellen (PBPK-Modellen) nützlich sein, um die orale Bioverfügbarkeit sowie das Interaktionspotential pharmakologisch aktiver Substanzen abzuschätzen.
Trotz allen wissenschaftlichen Fortschritts und verbesserter Therapien bleibt das Pankreaskarzinom
eine äußerst schwerwiegende Erkrankung und ist gekennzeichnet durch eine späte Diagnosestellung,
eine - sofern noch möglich - anspruchsvolle und risikoreiche Operation zur Resektion und eine trotz
aller Bemühungen niedrige Überlebensrate.
Die körpereigene Tumorabwehr umfasst eine Vielzahl an ineinandergreifenden immunologischen
Prozessen und unterliegt der Beeinflussung durch zahlreiche Faktoren. Gerade für den Verlauf nach
einer ausgedehnten Operation ist ein intaktes Immunsystem von ganz besonderer Bedeutung.
So ist es unabdingbar, die Kenntnisse über den Einfluss einer operativ ausgelösten Immundysfunktion
auf den Verlauf des Pankreaskarzinoms zu erweitern und die Mechanismen dezidiert zu untersuchen.
Die Kombination beider Mausmodelle stellt dafür eine ausgezeichnete Möglichkeit dar.
Die Kombination von Tumor und SID löst eine starke Aktivierung des Immunsystems aus. In Blut und
Milz konnte eine ausgeprägte Verschiebung der zellulären Zusammensetzung zugunsten der
Neutrophilen Granulozyten und der Monozyten beobachtet werden. T-Helfer- und Zytotoxische TZellen
zeigten eine verstärkte Aktivierung. Sowohl pro- (z.B. IL-6, IL-1β, TNF) als auch
antiinflammatorische (z.B. IL-10) Zytokine waren im Serum bzw. im Splenozytenüberstand in
erhöhter Konzentration messbar. Dies unterstreicht die Vermutung, dass die Kombination beider
Stressoren (Tumor + SID) zu einer verstärkten und möglicherweise prolongierten sowie
dysregulierten Aktivierung des Immunsystems führt. Wesentliche Ergebnisse dieses Teils der Arbeit
wurden im August 2022 im Cancers (Basel) veröffentlicht.
Zusätzlich konnte durch die Bestimmung verschiedenster Metabolite gezeigt werden, dass die
Kombination von Tumor und SID einen katabolen Stoffwechsel hervorruft. Viele Metabolite, wie
Spermin, Spermidin oder Carnosin, die das Tumorwachstum beeinflussende Eigenschaften
aufweisen, zeigten sich durch die Kombination der beiden Stressoren signifikant verändert. Nicht
zuletzt wurde der Einfluss von Tumor und SID sogar auf den Stoffwechsel von
Plasmamembranbestandteilen sichtbar.
Die Kombination dieser beiden Modelle bietet viel Potential für wichtige Erkenntnisse in Bezug auf
den Einfluss der postoperativen Immundysfunktion auf den Verlauf des Pankreaskarzinoms und kann
einen bedeutenden Beitrag zum Verständnis der immunologischen wie metabolischen Mechanismen
leisten. Nur so besteht die Möglichkeit, in Zukunft vielversprechende Therapieansätze entwickeln zu
können.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.
BTM-Konzentrationen erlauben die Abschätzung der Aktivität des Knochenstoffwechsels und können daher zur Erfolgskontrolle der Osteoporosetherapie genutzt werden. Um wiederum die Serumkonzentrationen der BTM einordnen zu können, sind alters-, geschlechts-, populations- und methodenspezifische Referenzwerte nötig. In dieser Arbeit wurden Referenzwerte für PINP-, BAP- und CTX-Serumkonzentrationen vorgestellt. Die Daten stammen aus einer gesunden Referenzpopulation von 1107 Männern, 382 prämenopausalen und 450 postmenopausalen Frauen, die an SHIP-1 teilnahmen. Gemessen wurden die BTM-Spiegel mit dem automatisierten IDS-iSYS Multi-Discipline Analyser (Immunodiagnostic Systems Limited, Frankfurt am Main). Der Referenzbereich wurde als mittleres 95%-Intervall festgelegt. Die resultierenden Referenzwerte der PINP- und CTXSerumkonzentrationen für Männer wurden mittels quantiler Regression bestimmt, sie sind altersabhängig und sinken mit steigendem Alter. So fallen sie bei PINP von 29,2–93,0 ng/ml auf 15,2–68,2 ng/ml und bei CTX von 0,12–0,82 ng/ml auf 0,05–0,61 ng/ml im Altersbereich zwischen 25 und 79 Jahren. Die BAP-Referenzwertbereiche für Männer verengen sich dezent mit steigendem Alter von 7,4–27,5 ng/ml auf 7,6–24,8 ng/ml im Altersbereich zwischen 25 und 79 Jahren. Die Referenzwerte für die Frauen sind altersunabhängig. Der Referenzwertbereich für die 30- bis 54-jährigen prämenopausalen Frauen beträgt für PINP 19,3–76,3 ng/ml, für BAP 6,0–22,7 ng/ml und für CTX 0,05–0,67 ng/ml. Für die 50- bis 79-jährigen postmenopausalen Frauen erstrecken sich die Referenzwertgrenzen für PINP von 18,2–102,3 ng/ml, für BAP von 8,1–31,6 ng/ml und für CTX von 0,09–1,05 ng/ml. Die enorm große und überdies sehr detailliert charakterisierte Referenzpopulation ermöglichte die Etablierung von robusten und aussagekräftigen Referenzwerten für BTM-Serumkonzentrationen. Diese können künftig bei der Einschätzung der aktuellen Knochenstoffwechselaktivität bei Männern und prä- sowie postmenopausalen Frauen zu Rate gezogen werden.