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In den letzten Jahren erhöhte sich die Inzidenz des humanen hepatozellulären Karzinoms in nicht-zirrhotischen Lebern bei gleichzeitigem Diabetes mellitus Typ 2 deutlich. Im Hepatokarzinogenesemodell nach intraportaler Pankreasinseltransplantation in der diabetischen Ratte konnte Prof. Dr. F. Dombrowski durch eine kombinierte Hyperinsulinämie und Hyperglykämie glykogen- und lipidreiche, klarzellige Herde induzieren, sogenannte clear cell foci (CCF), die sich in Langzeitexperimenten zu hepatozellulären Adenomen und Karzinomen entwickelten. Sowohl in den CCF als auch in humanen und rodenten hepatozellulären Karzinomen fand sich eine Heraufregulation des Transkriptionsfaktors carbohydrat-responsive element-binding proteins (ChREBP), der glukoseabhängig und insulinunabhängig Enzyme der Glykolyse und Lipogenese reguliert. Das Inseltransplantationsmodell wurde anschließend auf die Maus unter Verwendung von 70 transplantierten Inseln übertragen, wobei die Frequenz der CCF sehr niedrig und die Anzahl thrombosebedingten Leberzellnekrosen hoch war. Das primäre Ziel meiner Doktorarbeit war es, die Frequenz der CCF am Modelltier Maus zu steigern. Mit der These, eine erhöhte transplantierte Inselanzahl führt zu einer höheren Frequenz der CCF, modifizierte ich die Inselisolationsprozesse systematisch, um qualitativ hochwertige und vom exokrinen Pankreasgewebe bereinigte Inseln zu erhalten. Anschließend schloss ich anhand immunhistochemischer Reaktionen und Vitalitätstests mögliche schädliche Einflüsse der Isolation aus. Ich konnte somit die Anzahl auf 120 und 200 Inseln erhöhen, die Streptozotocin-diabetischen Wildtyp (WT) - und ChREBP-Knockout-Mäusen intraportal transplantiert wurden, ohne Leberzellnekrosen zu induzieren. Nicht-transplantierte Kontrollgruppen blieben vier Wochen lang hyperglykämisch. Nach einer und nach vier Wochen konnte ich klarzellige Leberherde in transplantierten WT-Mäusen histologisch, immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch nachweisen, die den klassischen CCF entsprachen. Durch Erhöhung der Inselzahl konnte ich eine tendenziell jedoch nicht signifikant erhöhte Frequenz der CCF erreichen. Nach vier Wochen kam es bei diabetischen transplantierten ChREBP-Knockoutmäusen ebenfalls zur Induktion klarzelliger Herde, die sich durch eine enorme Glykogenakkumulation, fehlende Lipidspeicherung und eine erniedrigte Proliferationsaktivität von den WT-CCF unterschieden. Durch diese Ergebnisse konnte ChREBP als Vermittler zwischen proliferationsärmeren, glykogenreichen und proliferationsaktiveren, lipidreicheren hepatischen Läsionen charakterisieren. Das primäre Ziel meiner Doktorarbeit, die Frequenz der CCF signifikant zu erhöhen, konnte nicht erreicht werden, jedoch durch ein verringertes Transplantatvolumen der Weg für Folgeexperimente mit erhöhter Inselzahl sowie für Langzeitexperimente geebnet werden.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss des Transkriptionsfaktors Carbohydrate responsive element binding protein (ChREBP) auf die experimentelle Hepatokarzinogenese untersucht, der eine wichtige Rolle in der protoonkogenen AKT/mTOR-vermittelten Karzinogenese der Leber spielen soll.
Dazu diente das Pankreasinseltransplantationsmodell bei diabetischen C57Bl/6J- Wildtyp- (WT; n = 180) und ChREBP-Knockout-Mäusen (KO; n = 143). Es erfolgten histologische, proliferationskinetische, immunhistochemische und Western-Blot- Analysen.
Das Hauptergebnis dieser Arbeit stellt die Hyperproliferation im Lebergewebe der diabetischen, transplantierten Mäuse dar, aus der sich klarzellige Leberherde (CCF) und im weiteren Verlauf auch hepatozelluläre Adenome (HCA) und Karzinome (HCC) entwickelten. Die Proliferationsaktivität lag in den Herden der Knockout- Mäuse bei 21,77 ± 3,38 % (Mittelwert ± S.E.M.), in denen der Wildtyp-Mäuse bei 29,04 ± 11,97 %. Die Leberherde unterschieden sich in ihrer Morphologie: Die Herde der KO-Mäuse waren kleiner und sie zeigten nur eine starke Glykogenspeicherung, während die Herde der Wildtyp-Mäuse neben dem Glykogen auch viel Fett speicherten.
Die Entstehung manifester Tumoren setzte im Knockout-Stamm später ein und die Tumoren wiesen auch ein langsameres Wachstum auf. Tumoren entstanden nicht nur in diabetischen, transplantierten Mäusen (WT-HCC n = 3; KO-HCC n = 1; KO-HCA n = 2), sondern auch in diabetischen Wildtyp-Kontrollmäusen (n = 4), aber nicht bei diabetischen KO-Tieren. Immunhistochemisch konnte in den Tumoren des KO- Stamms eine verminderte Glykolyse und de novo Lipogenese sowie ein herunterregulierter AKT/mTOR-Signalweg nachgewiesen werden.
Diese Ergebnisse weisen auf einen protoonkogenen Charakter von ChREBP zum einen in der hormonell-induzierten Hepatokarzinogenese, aber auch in einem metabolischen Karzinogeneseprozess im Rahmen eines Insulinmangeldiabetes hin. Der Einfluss von ChREBP auf den Energiestoffwechsel der Zelle und auf den metabolischen Switch vom glykogenotischen zum lipogenen Phänotyp in der experimentellen Hepatokarzinogenese-Sequenz scheint essentiell zu sein. Der Knockout von ChREBP reduziert dementsprechend die Proliferation im Lebergewebe und scheint die Hepatokarzinogenese in diesem Modell zu verzögern.
In dieser Arbeit wurde erstmalig das zuvor an Ratten etablierte insulin-vermittelte Hepatokarzinogenesemodel mit der intraportalen Pankreasinseltransplantation auf die Maus übertragen und sowohl an einem Wildtyp -als auch einem Carbohydrate responsive-element bindung protein (ChREBP)-knockout-Stamm durchgeführt. CHREBP ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor des Glukose- und Lipidmetabolismus, welcher auch bei der Entstehung des Diabetes mellitus Typ 2 bzw. des metabolischen Syndroms involviert ist. Bei Streptozotozin-induzierter diabetischer Stoffwechsellage erfolgte nach 5 Tagen die intraportale Transplantation von 70, zuvor isolierten, isologen Pankreasinseln. Zur Darstellung der Hepatozytenproliferation erhielten die Tiere das Basenanalogon Bromodesoxyuridin (BrdU), welches zum Teil über eine subkutan- implantierte osmotische Minipumpe bzw. über dreimalige Injektionen appliziert wurde. Mit dem BrdU-Labeling-Index konnte die Proliferationsaktivität der im Abstromgebiet der Pankreasinseln entstandenen hepatozytären Wildtyp- und ChREBP-Knockout-Herde ermittelt und mit dem jeweiligen unveränderten Lebergewebe verglichen werden. Nach einer Versuchsdauer von 1 Woche bzw. 4 Wochen erfolgte die Tötung im Rahmen der retrograden Organperfusion und gleichzeitiger Organfixation in Narkose. In direkter Transplantatumgebung entstanden in beiden diabetischen Genotypen klarzellige Hepatozytenherde, welche sich jedoch in Morphologie, im Glykogen- und Lipidgehalt, in der Proliferationsaktivität und der Frequenz und der Verteilung im Leberparenchym unterscheiden. So entsprachen die klarzelligen Herde der diabetischen Wildtyp- Maus denen des Rattenmodels und den humanen Herden, welche durch einen gesteigerten Glykogen- und Lipidgehalt, vergrößerten Zellkernen sowie einer nach 4 Wochen vierfach gesteigerten Proliferationsaktivität (Herd vs. unverändertes Lebergewebe: 11,34 ± 2,24 MW ± S.E.M vs. 2,4 ± 0,71 MW ± S.E.M.; p = 0,006) charakterisiert sind und somit auch bei der Maus als präneoplastische Läsionen einzustufen sind. Die hier erstmals beschriebenen Herde der diabetischen ChREBP-KO-Maus zeichnen sich hingegen durch große, balloniert erscheinende Hepatozyten mit einem exzessiven Glykogen- und nur minimalen Lipidgehalt, einem kleineren Zellkern, einem konfluierenden Verteilungsmuster und einer geringeren Proliferationsaktivität (Herd vs. unverändertes Lebergewebe: 6,08 ± 0,7 MW ±S.E.M. vs. 1,91 ± 0,02 MW ± S.E.M.; p = 0,0002), als die der Wildtyp-Herde, aus. Diese Resultate unterstützen die Annahme, dass ChREBP einen wesentlichen Einfluss auf den hepatischen Glukose-und Lipidmetabolismus hat und weiterhin einen protoonkogenen Faktor in der insulin-vermittelten Hepatokarzinogenese darstellt.