Refine
Document Type
- Article (2)
- Doctoral Thesis (2)
Has Fulltext
- yes (4)
Is part of the Bibliography
- no (4)
Keywords
- protein expression (4) (remove)
Institute
Abstract
The neritid snail Theodoxus fluviatilis has formed regional subgroups in northern Europe, where it appears in both freshwater (FW) and brackish water (BW) in coastal areas of the Baltic Sea. These ecotypes show clear differences in osmotolerance and in the modes of accumulating organic osmolytes under hyperosmotic stress. We reasoned that the expression patterns of soluble proteins in the two ecotypes may differ as well. BW snails have to deal with a higher salinity (up to 20‰) than FW snails (0.5‰) and also cope with frequent fluctuations in environmental salinity that occur after heavy rains or evaporation caused by extended periods of intense sunshine. Therefore, the protein expression patterns of specimens collected at five different FW and BW sites were analyzed using 2D SDS‐PAGE, mass spectrometry, and sequence comparisons based on a transcriptome database for Theodoxus fluviatilis. We identified 89 differentially expressed proteins. The differences in the expression between FW and BW snails may be due to phenotypic plasticity, but may also be determined by local genetic adaptations. Among the differentially expressed proteins, 19 proteins seem to be of special interest as they may be involved in mediating the higher tolerance of BW animals towards environmental change compared with FW animals.
Renal drug transporters such as the organic cation transporters (OCTs), organic anion
transporters (OATs) and multidrug resistance proteins (MRPs) play an important role in the tubular
secretion of many drugs influencing their efficacy and safety. However, only little is known about
the distinct protein abundance of these transporters in human kidneys, and about the impact of
age and gender as potential factors of inter-subject variability in their expression and function.
The aim of this study was to determine the protein abundance of MDR1, MRP1-4, BCRP, OAT1-3,
OCT2-3, MATE1, PEPT1/2, and ORCTL2 by liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based
targeted proteomics in a set of 36 human cortex kidney samples (20 males, 16 females; median age
53 and 55 years, respectively). OAT1 and 3, OCT2 and ORCTL2 were found to be most abundant
renal SLC transporters while MDR1, MRP1 and MRP4 were the dominating ABC transporters.
Only the expression levels of MDR1 and ORCTL2 were significantly higher abundant in older donors.
Moreover, we found several significant correlations between different transporters, which may
indicate their functional interplay in renal vectorial transport processes. Our data may contribute to
a better understanding of the molecular processes determining renal excretion of drugs.
Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste Herzrhythmusstörung im Erwachsenenalter. In den kommenden Jahren und Jahrzehnten werden die Prävalenz und Inzidenz von Vorhofflimmern weiter zunehmen. Die VHF-assoziierten Pathomechanismen sind nicht vollständig geklärt. Derzeitige Therapieansätze sind oft nur zeitlich begrenzt wirksam, mit starken Nebenwirkungen behaftet und können aktuelle Beschwerden der Patienten zwar eindämmen, ein Fortschreiten der Krankheit aber nicht aufhalten. Daher ist es notwendig, weitere Untersuchungen auf Ebene der Zellregulation und Zellkommunikation zu fördern, um das Wissen über Entwicklung, Progression und Reversibilität von VHF-assoziierten Remodeling-Prozessen zu erweitern und neue therapeutische Interventionspunkte zu identifizieren.
VHF-induzierte atriale Remodeling-Prozesse werden maßgeblich und zum Teil ursächlich durch reversible Veränderungen der Protein-Phosphorylierung verursacht. In vorherigen Arbeiten des Labors konnten bereits im Rahmen von Phosphoproteom-Analysen Proteine in HL-1 Zellen detektiert werden, die nach Rapid Pacing (RP) auffällig differentiell reguliert waren. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Analyse und Verifizierung dieser Proteine nach kontinuierlichem und Intervall-RP von HL-1 Zellen auf mRNA- und Proteinebene. Der Vergleich der im HL-1-Modell erhaltenen Daten mit denen, die aus atrialem Gewebe von Patienten in SR und VHF gewonnen wurden, soll Rückschlüsse auf klinisch und therapeutisch potenziell relevante Signalwege und Pathomechanismen bei VHF geben. Es stellte sich heraus, dass RP keinen Einfluss auf die mRNA-Expression von DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2 und eingeschränkt auf JPH2 und GPX1 in HL-1 Zellen hatte. Lediglich nach Intervall-RP war die mRNA-Menge von JPH2 erhöht und von GPX1 reduziert. Sowohl nach kontinuierlichem als auch nach Intervall-RP war die Genexpression der Proteine SNIP1 und SBK2 stark reduziert. Gleichzeitig stellte sich eine ebenso stark reduzierte SBK2 Proteinexpression sowohl in den HL-1 Zellen als auch im humanen Vorhofgewebe bei VHF dar. In der immunhistochemischen Untersuchung atrialer Gewebeschnitte präsentierte sich SBK2 im Zytoplasma, entlang der Zellmembran und vesikelartig im perinukleären Raum der humanen Kardiomyozyten. RP und VHF hatten keinen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression von MARK2 in den HL-1 Zellen und im humanen Vorhofgewebe. In der Untersuchung der Protein-Phosphorylierung von MARK2 an Thr208 ergaben sich allerdings Diskrepanzen zwischen den murinen und humanen Zellen. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde in den humanen Kardiomyozyten für MARK2 eine regelmäßige Anordnung in longitudinaler Ausrichtung und zwischen den Z-Linien nachgewiesen. Eine VHF-abhängige durch Phosphorylierung vermittelte subzelluläre Translokation von MARK2 konnte ausgeschlossen werden. Diese RP-assoziierten Veränderungen im Phosphoproteom sind am atrialen Remodeling, bei der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Aktivierung des TGF-β- und NF-κB-Signalwegs involviert. Des Weiteren wird ein Zusammenhang zwischen MARK2 und dem Wnt-Signalweg vermutet.
In weiterführenden Arbeiten sollten Untersuchungen der spezifischen Effekte von Protein-Phosphorylierungen und der Protein-Protein-Interaktionen erfolgen. Da zu den kardialen Funktionen von SBK2 keine Daten vorliegen, könnten mithilfe des Knock-outs von SBK2 (Knock-out Maus oder CRISPR-Cas9 Knock-out in HL-1 Zellen) grundlegende Aussagen zu dessen Rolle im gesunden Herzen oder bei VHF erhalten werden.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.