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Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Die Kv7-Kaliumkanalöffner Flupirtin und Retigabin waren wertvolle Alternativen bei der Pharmakotherapie von Schmerzen und Epilepsie. Beide Wirkstoffe werden aufgrund von unerwünschten Arzneimittelwirkungen derzeit jedoch nicht mehr eingesetzt. Die Flupirtin-induzierte Hepatotoxizität und die durch Retigabin hervorgerufenen Gewebeverfärbungen scheinen dabei auf den ersten Blick nicht zusammenzuhängen. Gleichwohl lassen sich wahrscheinlich beide Nebenwirkungen auf das gemeinsame oxidationsempfindliche Triaminoaryl-Grundgerüst zurückführen, welches zur Bildung von reaktiven Chinondiimin-Metaboliten neigt. Da hingegen der Wirkungsmechanismus, d. h. die Öffnung der Kv7-Kanäle, nicht an der Toxizität beteiligt zu sein scheint, hatte diese Arbeit zum Ziel, sicherere Alternativen für Flupirtin und Retigabin zu entwickeln. In einem Liganden-basierten Ansatz wurde eine Umgestaltung des Triaminoaryl-Kerns, den beide Wirkstoffe gemeinsam haben, vorgenommen, was zu Carba-Analoga führte, die durch eine erhöhte Oxidationsbeständigkeit sowie ein vernachlässigbares Risiko für die Bildung von chinoiden Metaboliten charakterisiert sind. Zusätzlich zu diesen verbesserten Sicherheitsmerkmalen offenbarten einige der neuartigen Derivate eine überlegene Kv7.2/3-Kanalöffnungsaktivität. Im Vergleich zu Flupirtin konnte die Potenz der Verbindungen um den Faktor 150 gesteigert werden, während die intrinsische Aktivität auf bis zu 176 % verbessert werden konnte, was die betreffenden Carba-Analoga zu vielversprechenden Kandidaten für eine weitergehende Entwicklung macht. Andererseits ermöglichten einige inaktive Verbindungen sowie die insgesamt deutlich abgestuften Kv7.2/3-Aktivitätsdaten die Etablierung von validen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Hypothesen zum Bindungsmodus, die mit Dockingergebnissen und Molekulardynamik-Simulationen korrelierten.
In drei verschiedenen Teilanalysen wurden Erkenntnisse über die Wirksamkeit von Interventionsmaßnahmen gegen das Vorkommen und die Verbreitung von ESBL/AmpC-bildenden E. coli in der Hühnermast gewonnen. Literaturdaten und praktische Laborergebnisse, die teilweise selbst erhoben wurden, flossen in ein mathematisches Modell ein, um die Auswirkungen von Haltungsparametern und konkreten Interventionsmaßnahmen prädiktiv berechnen zu können. Die zusammengefassten Ergebnisse zeigen einen Einfluss der Maßnahmen „Competitive Exclusion“, „Reinigung und Desinfektion“ sowie den Haltungsparametern „Rasse“, „geringe Besatzdichte“ und „erhöhte Einstreumenge“ auf das Vorkommen von bestimmten ESBL/AmpC-bildenden E. coli. Zusätzlich zu den Einzelmaßnahmen wurden im Modell mehrere Kombinationen getestet, wobei zwei unterschiedlichen Szenarien verwendet wurden, entweder der Stall oder die Eintagsküken waren zu Beginn der Mastperiode positiv. Diese Kombinationen ergaben eine deutliche Reduktion der resistenten E. coli in den infizierten Tieren, in deren Ausscheidungen und in der Einstreu. In diesem Zusammenhang wären Daten aus tierexperimentellen Studien zu kombinierten Maßnahmen interessant. Weitere wissenschaftliche Ergebnisse könnten zu einem optimierten Modell beitragen, damit es die realen Bedingungen besser widerspiegelt. Zu einer weiteren Präzisierung könnte zum Beispiel die dezidierte mathematische Berechnung des Wachstums von resistenten E. coli in den unterschiedlichen Teilen des Gastrointestinaltrakts des Huhns und in der Einstreu führen, unter Berücksichtigung von pH-Wert und Temperatur. Ungeachtet dessen bietet die vorliegende Version des Modells eine nützliche Unterstützung bei der Vorhersage der Auswirkung unterschiedlicher Maßnahmen auf das Auftreten und die Verbreitung von ESBL/AmpC-bildenden E. coli in Masthuhnbetrieben. Diese Ergebnisse können zu einer umfassenden Quantitativen mikrobiologischen Risikobewertung (QMRA) beitragen, mittels derer die Effizienz von Risikominderungsmaßnahmen in der gesamten Broilerproduktionskette, von der Brüterei und Aufzucht über die Mast, Schlachtung, Verarbeitung und den Einzelhandel bis hin zum Verzehr - from farm to fork, bestimmt werden kann.
In vitro assays play a crucial role in the biopharmaceutical assessment of drugs. During the past two decades, biorelevant media became an indispensable tool to forecast the in vivo solubility and dissolution of pharmaceutical drug candidates, and to assess absorption risks like low solubility or drug precipitation. Nevertheless, in vitro set-ups are still a simplification of the conditions in the human GI tract. This thesis aimed to shed light on some of the remaining open questions, aiming at providing a better understanding of the effects of biorelevant media on solubility, dissolution, and precipitation processes, and providing guidance for a more streamlined usage in the future. The results of this work can be outlined in brief as follows: First, a new design of experiment-based method development was introduced which increased the robustness and accuracy of derivative UV spectrophotometric methods for drug quantification in biorelevant precipitation assays. Second, based on this new approach, the impact of SIF powder aging on the supersaturation and precipitation behavior of the model drug ketoconazole was investigated. Recommendations on the use of biorelevant media for precipitation assays were developed to further improve the reproducibility of transfer experiments and to enhance data reliability. Third, it was investigated under which circumstances the physiological bicarbonate buffer should be applied to Fasted State Simulated Intestinal Fluid medium for in vitro solubility, dissolution, and precipitation testing to resemble the in vivo conditions.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
Um zukünftige Untersuchungen des im bekannten chemical space unterrepräsentierten Strukturmotivs 3,4-disubstituierter bzw. 3,4-verbrückter 1H-Indol-Derivate zu ermöglichen sollte im Zuge der praktischen Arbeiten, welche dieser Dissertation zugrunde liegen, eine Reihe bisher nicht literaturbekannter Verbindungen dieser Substanzklasse, auch unter Verwendung von Multikomponentenreaktionen, dargestellt und charakterisiert werden. Weitere Untersuchungen zur Derivatisierung und Modifikation des Strukturmotivs sollten durchgeführt werden und im Idealfall zu einem weiteren Ringschluss an den tricyclischen Substraten führen. Relevante Verbindungen sollten anschließend in einer Reihe von (internationalen) Screening-Kampagnen und bei Kooperationspartnern hinterlegt werden, um langfristig eine nähere Charakterisierung ihrer physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften zu erreichen, welche gegebenenfalls zur weiteren Optimierung des Strukturmotivs für spezifischere Anwendungen führen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen drei Substanzbibliotheken verschiedener Grundkörper darzustellen und zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um 13 Derivate der cyclischen Bisamide vom 5-Oxo-1,3,4,5-tetrahydropyrrolo[4,3,2-gh]isochinolin-3-carboxamid-Typ, welche sich durch Ugi-MCR aus einem geeigneten bifunktionellen Reagenz, sowie verschiedenen primären Aminen und Isocyaniden in Anlehnung an die Arbeiten von Mironov et al. synthetisieren ließen. Weiterhin konnten, ausgehend von den tricyclischen Verbindungen vom 2-Methyl-5-oxo-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure- und 2-Methyl-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure-Typ, welche nach einer modifizierten Vorschrift nach Böshagen et al. erhalten werden konnten, zwei weitere Substanzbibliotheken mit 33 bzw. 24 individuellen Amid-Derivaten hergestellt werden. Dabei konnte durch Verwendung geeigneter Substrate nach der Amidkupplung die Freilegung eine basischen funktionellen Gruppe in einigen Verbindungen erreicht werden, welche die Bildung eines Hydrochlorid-Salzes ermöglichte und dadurch die Wasserlöslichkeit der neuen Verbindungen deutlich zu erhöhen vermag.
Auch gelang durch Einsatz des ökologisch äußerst vorteilhaften Lösungsmittels Dihydrolevoglucosenon die Entwicklung einer „grüneren“ Vorschrift zur Synthese dieser Substanzen, welche auf den Einsatz des, aus ökologischen und gesundheitlichen Gründen kritisch zu hinterfragenden, Lösungsmittels N,N-Dimethylformamid verzichtet.
Die Untersuchungen zur weiteren strukturellen Modifikation der erhaltenen 3,4-verbrückten 1HIndol- Derivate verlief nicht mit dem erhofften Erfolg, da viele Untersuchungen zu dieser Thematik unter anderem mittels Diels-Alder-Reaktion und Olefin-Metathese nicht zu isolierbaren Produkten führten. Allerdings konnte durch Diamin-vermittelte Ringschlussreaktion von 3-Formyl-1H-indol- 4-carbonsäuremethylester letztlich eine Synthesevorschrift zur Darstellung tetracyclischer Derivate erhalten werden. Die aus diesen Versuchen hervorgegangene Verbindung konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zur Kristallisation gebracht und am Institut für Biochemie der Universität Greifswald im Arbeitskreis für Synthetische und Strukturelle Biochemie röntgendiffraktometrisch untersucht werden, was zur Bestätigung der angenommenen Konstitution führte.
Erste Evaluationen der biologischen Aktivität der dargestellten Verbindungen konnten bereits im Arbeitskreis Pharmazeutische Bioanalytik der Universität Greifswald vorgenommen werden: Dabei wurden die relevanten Verbindungen mittels MTT-Assay auf eventuelle Zytotoxizität hin untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass von den meisten untersuchten Verbindungen keine Zytotoxizität ausgeht, wobei dies allerdings, aufgrund der Limitationen des MTT-Assay im Bezug auf diese Aussage, in weiteren Untersuchungen abschließend geklärt werden sollte. Weiterhin konnte für einige der synthetisierten Verbindungen eine Inhibition der Arachidonat-5-Lipoxygenase (5-LOX) mit IC50-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich in vitro nachgewiesen werden. Der genaue Mechanismus der Inhibition, ebenso wie eine eventuell vorhandene Selektivität gegenüber anderen Arachidonat-Lipoxygenasen soll Gegenstand zukünftiger Untersuchungen, unter anderem am isolierten Enzym 5-LOX und in Homogenaten, sein. Darüber hinaus konnte ein großer Teil der synthetisierten Verbindungen im Molekülarchiv „Compound Platform“ (ComPlat) des Karlsruhe Institut für Technologie (KIT) hinterlegt werden, wo sie einer Vielzahl von potentiellen Kooperationspartnern zur Verfügung stehen. Erste Ergebnisse einer solchen Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Fahrer der Technischen Universität Kaiserslautern sollen zeitnah in einer gemeinsamen Publikation veröffentlicht werden. DesWeiteren konnten 40 Verbindungen in der „Testing4Ag“-Kampagne des Unternehmens Bayer Crop Science untergebracht werden, wo ihre Wirkung auf ein breites Spektrum von Schädlingen, Pilzen und Unkräutern evaluiert werden soll. Die Ergebnisse dieser Testungen stehen zum Zeitpunkt der Niederschrift dieser Arbeit noch aus. Eine Hinterlegung von 40 Substanzen in der EU-OPENSCREEN-Plattform, einer non-profit-Abteilung des European Research Infrastructure Consortium (ERIC) wird vorbereitet.
Agglomerate Sprühgetrockneter Amorpher Fester Dispersionen (Englisch: Spray-dried Amorphous Solid Dispersions – SD-ASD) im Gastrointestinaltrakt können zu Beeinträchtigungen des Wohlergehens von Nagetieren in präklinischen Studien im Rahmen der Arzneimittelentwicklung führen. Das Auftreten solcher Agglomerate, nachfolgend Pharmakobezoare genannt, war dabei auf Studien an Nagetieren beschränkt bei welchen Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat (HPMC-AS) als Trägerpolymer der als Suspension applizierten SD-ASDs eingesetzt wurde. In diesem Promotionsprojekt evaluierten wir basierend auf Berichten präklinischer Studien Faktoren, welche die Pharmakobezoarbildung in vivo beeinflussen. Weiterhin wurde ein In vitro-Modell entwickelt, mittels welchem das Agglomerationspotential verschiedener SD-ASDs vor Applikation untersucht werden konnte. Dieses Modell wurde ebenfalls genutzt um einen Ansatz zur Reduktion des Agglomerationspotentials zu finden, welcher in der letzten Phase des Promotionsprojektes in vivo verifiziert wurde. Dabei wurde der Effekt der Viskositätserhöhung der Suspensionen zur Reduktion der Pharmakobezoarbildung nicht nur anhand der Masse der bei Sektion gefundenen Pharmakobezoare bewertet, sondern auch die Inzidenz von Pharmakobezoaren an verschiedenen Zeitpunkten der 24-tägigen Studie auf Basis kontinuierlich durchgeführter MRT-Messungen verglichen. Die Visualisierung der intragastralen Pharmakobezoarbildung in vivo ermöglichte darüber hinaus ein detailliertes Verständnis des Prozesses der Pharmakobezoarbildung in Nagetieren unter Berücksichtigung anatomischer und physiologischer Faktoren.
Die Kenntnis über die im Gastrointestinaltrakt ablaufenden Prozesse spielt in der Entwicklung neuer Arzneiformen eine entscheidende Rolle. Besonders im Dickdarm ist dabei neben den physiologischen Bedingungen die bakterielle Besiedlung zu beachten, welche sowohl inter- als auch intraindividuell hoch variabel ist. Bislang gibt es keine einheitliche Methode zur Untersuchung des Einflusses der intestinalen Mikrobiota auf die Metabolisierung von Arzneistoffen. Diese Methoden sind jedoch entscheidend für das Verständnis des Einflusses der bakteriellen Metabolisierung auf die Pharmakokinetik und -dynamik der Arzneistoffe.
Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es, ein In vitro-Modell zu entwickeln und anzuwenden, welches die dynamischen Bedingungen im Colon ascendens, insbesondere im Hinblick auf die pH-Werte, Durchmischung und bakterielle Besiedlung, darstellt.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurde im Rahmen erster Versuche untersucht, wie es sowohl mit monographierten als auch biorelevanten Modellen möglich ist, die mechanische Belastung, die auf eine Arzneiform im GIT ausgeübt wird, darzustellen. Die Verwendung der SmartPill™ eröffnete die Möglichkeit, in den Apparaturen auftretende Drücke aufzuzeichnen. Außerdem konnten die gemessenen Drücke anschließend mit Daten aus In vivo-Studien verglichen werden. Die Untersuchungen ergaben, dass in den monographierten Apparaturen keine Drücke auftreten, die den während der Magen-Darm-Passage auftretenden Drücken entsprechen. Im Gegensatz dazu können im DOFTA gezielt Drücke und so auch vollständige Druckprofile simuliert werden.
Im weiteren Verlauf der Arbeit waren die zuvor gewonnenen Erkenntnisse hilfreich für die Entwicklung des neuen Modells zur Darstellung des Colon ascendens. In das MimiCol wurden pH-Wert-Daten aus einer SmartPill™-Studie implementiert. Die Vorteile des neuartigen Bioreaktors MimiCol sind das kleinere Medienvolumen, das den In vivo-Bedingungen näherkommt, die Möglichkeit, Medienwechsel durchzuführen und dadurch Metabolite abzuführen und neue Nährstoffe hinzuzufügen sowie die genauere Simulation von In vivo-Durchmischungsmustern.
Ziel der durchgeführten Untersuchung war der Vergleich der Metabolisierung des Modellarzneistoffs Sulfasalazin in dem neuartigen dynamischen Bioreaktor MimiCol und einem statischen Standard-Batch-Fermenter. Beide wurden mit der gleichen, kryokonservierten fäkalen Standardmikrobiota beimpft. Die Experimente zeigten, dass das MimiCol in der Lage ist, die dynamischen Bedingungen im aufsteigenden Dickdarm zu simulieren. Die dynamischen Bedingungen im MimiCol führten zu einer Verdopplung der Metabolisierungskonstanten im Vergleich zum statischen Batch-Fermenter. Das MimiCol ahmt, besonders in Bezug auf pH-Fluktuationen und Bakterienwachstum, die dynamischen Bedingungen im aufsteigenden Dickdarm nach und könnte sich in allen Phasen der Arzneimittel- und Formulierungsentwicklung als nützlich erweisen.
Zur Erleichterung und Beschleunigung der Datengenerierung wurde im nächsten Schritt eine Erweiterung des Modells angestrebt. Hierbei war es die größte Herausforderung, die ursprünglichen Parameter auf ein erweitertes Modell mit einer anderen Steuerung und anderen Komponenten zu übertragen. Außerdem wurde in diesem Zuge die Charakterisierung komplexer Bakterienkulturen mittels 16S rRNA-Sequenzierung eingeführt. Bei der Erweiterung des Modells wurde besonderes Augenmerk auf die Einfachheit des Designs und die leichte Skalierbarkeit gelegt.
Um zu beweisen, dass die Übertragung der Parameter erfolgreich war, wurde erneut der Abbau von Sulfasalazin untersucht und die bakterielle Zusammensetzung während des Experiments durch 16S rRNA-Sequenzierung analysiert. Die Übertragung der Versuchsbedingungen auf das neue Modell war erfolgreich. Kommerziell erhältliche Komponenten wurden in den Aufbau implementiert. Das Modell MimiCol³ repräsentierte das Colon ascendens in seinen Eigenschaften bezüglich des Volumens, pH-Werts und Redoxpotentials zufriedenstellend. Die 16S rRNA-Sequenzierung führte zu weiteren Erkenntnissen über die bakterielle Zusammensetzung in den drei Gefäßen. Der Abbau von Sulfasalazin stand in guter Übereinstimmung mit den In vivo-Daten und den im MimiCol gewonnenen Daten. Das neue Modell des Colon ascendens MimiCol³ ermöglichte es, zuverlässigere Daten zu sammeln, da drei Experimente gleichzeitig unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass ein wichtiges Instrument zur Untersuchung des Einflusses unseres Mikrobioms im Darm auf den Abbau von Arzneistoffen und Arzneiformen entwickelt wurde.
Das kolorektale Karzinom stellt mit ca. 63.000 Neuerkrankungen pro Jahr die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland dar.1 Weltweit wird bis 2030 mit einem Anstieg der Inzidenz und Mortalität um 60 % gerechnet..264 Dabei steigt die Zahl der Kolonkarzinome in Schwellenländern bereits deutlich an und betrifft immer jüngere Menschen.2 Aufgrund dieser gesundheitlichen Herausforderungen ist die Entwicklung neuer Therapieverfahren von besonderem Interesse. Mit der Entdeckung einer möglichen Beteiligung von Gerinnungsproteasen an der Progression verschiedener Karzinome, darunter auch kolorektaler Erkrankungen, wurde ein neuer therapeutischer Angriffspunkt geschaffen, der im Rahmen der vorliegenden Dissertation untersucht werden sollte. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Wirkung des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa und der PAR2-Aktivierung auf das Kolonkarzinom in vitro und in vivo.
In vitro wurden drei verschiedene Kolonkarzinomzelllinien (murine MC38 Zellen, humane HCT116 Zellen und humane CaCo2 Zellen) vergleichend auf den Einfluss von FXa untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass die Proliferation und Migration von MC38 Zellen durch FXa, nicht aber durch Thrombin signifikant erhöht wird. Der gleiche Effekt wird im Wound Scratch Assay nach selektiver PAR2-Aktivierung (Protease Activated Receptor 2) beobachtet, was auf einen PAR2-gesteuerten Migrationseffekt in MC38 Zellen hindeutet, da FXa seine zellulären Effekte über PAR2 vermitteln kann. Darüber hinaus kann eine Beteiligung des EGFR an dieser FXa-induzierten Migration bestätigt werden. Im Western Blot zeigt sich eine verstärkte Aktivierung der Signalmoleküle p38 MAPK, p44/42 MAPK und AKT nach FXa-Stimulation als mögliche Ursache der migratorischen und proliferativen Effekte des Gerinnungsfaktors. Der Einsatz des EGFR-Inhibitors Erlotinib zeigte eine Beteiligung des EGFR an der Aktivierung von p38 MAPK und AKT in MC38 Zellen. Die Stimulation von Kolonkarzinomzellen der Maus mit FXa führt zudem zu einer signifikant erhöhten Expression von PAR2.
Die aktivierten Gerinnungsfaktoren FXa und Thrombin haben dagegen keinen Einfluss auf die Proliferationsrate von humanen HCT116 und CaCo2 Zellen in vitro. Während die Motilität von CaCo2-Zellen durch FXa und Thrombin reduziert wird, erhöhen diese die Migrationsfähigkeit von HCT116-Zellen signifikant. Die selektive PAR2-Aktivierung führt ebenso wie FXa zu einer reduzierten Motilität der CaCo2-Zellen. Dies deutet auf einen PAR2-vermittelten Effekt hin. In HCT116 Zellen löst sowohl eine PAR1- als auch eine PAR2-Aktivierung eine signifikant erhöhte Zellmigration aus. Das zugrundeliegende promigratorische Signal nach FXa-Stimulation konnte mittels Western Blot in der gesteigerten Phosphorylierung von p38 MAPK und p44/42 MAPK in CaCo2 Zellen gefunden werden. In HCT116 Zellen hatte FXa keinen Einfluss auf die Aktivierung dieser Signalmoleküle.
In vivo wurde erfolgreich ein Tiermodell für die subkutane Injektion von murinen Kolonkarzinomzellen etabliert. Dabei werden eine Million MC38 Zellen in die Flanke von C57Bl/6J Wildtyp und PAR2-KO Mäusen mit C57Bl/6J Hintergrund injiziert und das Tumorwachstum über 21 Tage beobachtet. Die Ergebnisse zeigen einen entscheidenden Einfluss von PAR2 auf die Tumorentstehung. PAR2-KO Mäuse weisen nach 21 Tagen signifikant kleinere Tumore auf als ihre Wildtyp Artgenossen. PAR2-KO Tiere müssen zudem seltener aufgrund ihres Gesundheitszustandes vorzeitig aus dem Versuch genommen werden. Auffällig ist auch das größere Milzgewicht im Verhältnis zum Körpergewicht bei PAR2-KO Tieren, was auf gesteigerte Inflammationsreaktionen hindeuten könnte. Der Einsatz eines direkten FXa-Hemmers (Apixaban) in klinisch relevanten Dosierungen hat in vivo keinen signifikanten Einfluss auf die Progression des Kolonkarzinoms.
Die in dieser Arbeit generierten Daten belegen vor allem die Bedeutung von PAR2 für die Progression des Kolonkarzinoms: In vitro können zum Teil starke, aber sehr unterschiedliche Effekte des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa bzw. des aktivierten PAR2 auf kolorektale Karzinomzellen beobachtet werden. In vivo hingegen zeigt sich, dass weniger FXa als vielmehr die Aktivierung von PAR2 direkt an der Progression des kolorektalen Karzinoms beteiligt ist. Durch molekularbiologische Untersuchungen mittels PCR konnte zudem eine Beteiligung des S1P-Signalweges nachgewiesen werden.
Bereits seit dem Ende des 20. Jahrhunderts ist bekannt, dass PAR1 in verschiedenen Krebsarten überexprimiert wird und direkt mit der Malignität von Tumorerkrankungen assoziiert werden kann. Auch eine steigende PAR2-Expression kann mit einem schlechteren Outcome bei Patienten mit Magen- oder Prostatakrebs in Verbindung gebracht werden.186 In der vorliegenden Arbeit konnte der Zusammenhang zwischen PAR2-Signaling und einer schlechteren Prognose im Darmkrebs-Tiermodell bestätigt werden. Die Expression des Rezeptors im Endothel oder im Gastrointestinaltrakt, in direkter Umgebung des Tumors, kann einen starken Einfluss auf das Tumorgeschehen ausüben. Die Inhibition von PAR2 oder des nachgeschalteten PAR2-Signalings könnte daher einen vielversprechenden neuen Therapieansatz beim kolorektalen Karzinom darstellen.
Innovative Wirkstoffe stellen die Entwickler und Entwicklerinnen von pharmazeutischen Darreichungsformen vor große Herausforderungen. Viele neue Arzneistoffe weisen eine unzureichende orale Bioverfügbarkeit auf. Die Gründe hierfür sind vielfältig und liegen unter anderem in der ortsabhängigen Löslichkeit und Permeabilität der betreffenden Substanzen. Dieser Problematik kann auf chemischer und technologischer Ebene begegnet werden. Auf der Seite der pharmazeutischen Technologie besteht beispielsweise die Möglichkeit, mukoadhäsive Darreichungsformen zu entwickeln. Darunter versteht man Systeme, die an der Schleimhaut haften und dadurch eine Retention des Arzneistoffes an der entsprechenden Stelle bewirken. Einerseits führt dies zu einer lokalen Erhöhung der Wirkstoffkonzentration, andererseits wird durch die Adhäsion die potenzielle Resorptionszeit verlängert. Beide Faktoren können sich positiv auf die Bioverfügbarkeit auswirken.
Zur Charakterisierung mukoadhäsiver Arzneiformen sind verschiedene Methoden beschrieben worden, von denen jedoch keine standardisiert ist. Mögliche Einflussfaktoren auf die Messung wurden in der Vergangenheit teilweise nicht ausreichend evaluiert, was die Konzeption einer geeigneten Messmethode erschwert. In der vorliegenden Arbeit wurde systematisch eine Methode zur Messung der Adhäsivität von Polyvinylalkohol-Filmen auf Basis der Messung der maximalen Haftkraft erarbeitet. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit ein in vitro-Test durchgeführt, der zur Aufklärung gerätespezifischer Einflussfaktoren diente. Es zeigte sich, dass die Adhäsion von PVA-Filmen an biomimetischen Agar/Muzin-Gelen in erster Linie zeitabhängig ist. Das Maximum der Adhäsion konnte nach 3 min beobachtet werden. In dieser Zeit kommt es zu einer Quellung des zuvor festen Films, wodurch die Beweglichkeit der Polymerketten zunimmt. Dies kann die Vernetzung von Polymer und Muzin begünstigen, wodurch die Adhäsion zunimmt. Nach Überschreiten eines Maximums kommt es zu einer Überhydratisierung des Systems und zu einer Abnahme der Kohäsion, so dass der Gelfilm beim Entfernen der Messsonde in sich reißt.
Die Geschwindigkeit, mit der die Sonde entfernt wurde, beeinflusste ebenfalls die Ergebnisse der Untersuchungen. Höhere Geschwindigkeiten führten zu höheren berechneten Adhäsionsarbeiten Wad, während die maximale Abrisskraft Fmax ein Plateau erreichte. Dieses Verhalten könnte durch die viskoelastischen Eigenschaften der beteiligten Bindungspartner beeinflusst werden.
Bezüglich der gerätespezifischen Parameter schien die Anpresskraft des Mukoadhäsivs an das biomimetische Gel den geringsten Effekt auszuüben. Unter Berücksichtigung der verwendeten Kraftmesszelle und der Integrität des Gels sollten höhere Anpresskräfte verwendet werden. Je nach Applikationsort sind physiologische Drücke zu berücksichtigen.
Ausgehend von den in vitro gewonnenen Erkenntnissen wurden anschließend zwei ex vivo Versuche durchgeführt. Diese Versuche konzentrierten sich auf die Eigenschaften der Substrate selbst, auf denen die PVA-Filme haften sollten. Der Einfluss der Präparation der verwendeten Gewebe auf die Adhäsion wurde sowohl an Dünndarmpräparaten vom Schwein als auch am Menschen untersucht. Die Gewebe wurden zum einen im frischen Zustand unmittelbar nach der Entnahme für die Mukoadhäsionsmessungen verwendet, im zweiten Versuchsabschnitt wurden sie für eine Woche im Gefrierschrank gelagert und für die Experimente aufgetaut. Bei den Schweinedärmen stellte sich die Frage, ob die Reinigung der frischen Därme einen zusätzlichen Effekt haben könnte. Aufgrund der geringen Probenzahl konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Bei zwei von drei Versuchstieren erhöhte sich die errechnete Arbeit (Wad) durch die vorsichtige Reinigung. Beim Auftauen der gereinigten Gewebe konnte bei allen Versuchstieren ein Anstieg der Wad sowie der maximalen Abrisskraft beobachtet werden. Diese Daten wurden statistisch mit den Ergebnissen der ex vivo-Humanstudie verglichen. Das Probandenkollektiv, dessen Daten in die Untersuchungen einflossen, umfasste insgesamt 12 Teilnehmer, die sich aufgrund verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen einer geplanten Operation unterziehen mussten. Gesundes Dünndarmgewebe, das aus operationstechnischen Gründen zusätzlich zum erkrankten Gewebe entfernt werden musste, wurde im Rahmen der Studie verwendet. Der statistische Vergleich der Gewebe unterschiedlicher Herkunft zeigte sowohl im frischen als auch im aufgetauten Zustand keine signifikanten Unterschiede. Bei Betrachtung der einzelnen Messwerte konnte jedoch festgestellt werden, dass die berechneten Wad bei menschlichem Gewebe etwas höher lagen als bei Schweinepräparaten. Eine größere Probenzahl könnte einen möglichen statistisch signifikanten Unterschied aufzeigen. Bei menschlichem Gewebe konnte außerdem festgestellt werden, dass die Verwendung einer Messeinstellung mit höherer Anpresskraft, längerer Kontaktzeit und schnellerem Entfernen der Messsonde zu signifikant höheren Wad führte (Einstellung A vs. Einstellung B). Bei allen Messungen wurde deutlich, dass die Adhäsionsarbeit empfindlicher auf Änderungen der Messparameter reagiert und daher möglicherweise der geeignetere Surrogatparameter für die Quantifizierung der Mukoadhäsion ist. Insgesamt zeigte sich bei den biologischen Präparaten eine deutlich größere Variabilität der Messwerte als bei den in vitro-Versuchen. Bei dem humanen Gewebe der ex vivo-Studie handelte es sich um Gewebe, welches von der für den Eingriff ursächlichen Erkrankung nicht betroffen war. In diesem Zusammenhang ist die große interindividuelle Variabilität der Messwerte auf der gesunden Schleimhaut hervorzuheben. Bei der Anwendung mukoadhäsiver Filme auf histologisch veränderter, pathogener Schleimhaut könnte die Mukoadhäsion möglichweise sogar weitaus variabler sein, da in diesem Fall neben der histologischen Veränderung auch eine mögliche Begleitmedikation eine Rolle spielen könnte. Diese Aspekte sollten bei dem Design einer Darreichungsform, aber auch eines geeigneten Testsystems zukünftig berücksichtigt werden.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können zur weiteren Optimierung und Validierung einer Messmethode für die Mukoadhäsion beitragen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Um die biologische Relevanz dieser in vitro-Experimente zu verbessern, können physiologische Daten aus telemetrischen Systemen genutzt und in den experimentellen Aufbau implementiert werden.
Diese Arbeit war Teil eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten interdisziplinären Forschungsnetzwerks (#1HealthPREVENT) und stellte eine einmalige peri-operative antibiotische (Penicillin/Gentamicin (P/G)) Prophylaxe (PAP) im Zuge eines operativen Eingriffs nach diagnostizierter Kolik beim Pferd der bislang üblichen fünf-Tage-Antibiose gegenüber, mit dem Ziel den Einfluss der PAP auf die Häufigkeit von (engl.) Extended Spectrum β-Lactamase produzierenden Escherichia coli (ESBL-EC) und die Veränderungen im enteralen Mikrobiom der Pferde zu untersuchen und zur Verbesserung des sorgfältigen Einsatzes von Antibiotika in der Veterinärmedizin beizutragen. Die per Los jeweils einer der zwei Gruppen („single shot“ Gruppe (SSG); „5 days“ Gruppe (5DG)) zugeordneten Pferde wurden dafür jeweils an drei verschiedenen Zeitpunkten (Klinikaufnahme (t0), Tag 3 (t1) und Tag 10 (t2) postoperativ) beprobt (Kotproben und Nüsternabstriche). Zusätzlich zur Gruppe der hospitalisierten Pferde wurde auch eine nicht-hospitalisierte Kontrollgruppe ohne klinische Auffälligkeiten einbezogen. Alle Proben wurden hinsichtlich positiver ESBL-EC untersucht und die identifizierten Isolate phänotypisch (durchgeführt vom Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen, Freie Universität Berlin) und genotypisch charakterisiert. Unabhängig vom P/G PAP-Schema stieg für die Pferde die Wahrscheinlichkeit von t0 zu t1 sowie von t0 zu t2 an, positiv für ESBL-EC zu sein. Die Ganzgenom-Sequenzierung der Isolate ergab außerdem eine enge räumliche und zeitliche Beziehung zwischen Isolaten mit gemeinsamen Sequenztypen, was auf eine lokale Ausbreitung hindeutete. Die 16S rRNA-Gen Sequenzierung der Kotproben (durchgeführt vom Institut für Klinische Molekularbiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) zur Untersuchung der Veränderungen im enteralen Mikrobiom zeigte nach der bioinformatischen Aufbereitung (durchgeführt von Silver Anthony Wolf, Robert Koch-Institut) und Fach-übergreifenden Analyse eine Beeinträchtigung in der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota (Alpha-Diversität) für Pferde mit akuter Kolik im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche jedoch nicht signifikant war. Die mikrobielle Gesamtkomposition der untersuchten Proben (Beta-Diversität) wies vor allem für die 5DG an t1 erhebliche Einschränkungen auf, was höchstwahrscheinlich auf die fortlaufende Verabreichung von Antibiotika zurückzuführen war. In beiden Studiengruppen wurde zudem an t1 eine erhöhte Abundanz von Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia, festgestellt. Insgesamt wiesen die Ergebnisse dieser Arbeit einen starken Einfluss des Krankenhausaufenthaltes an sich auf, vor allem auf die ESBL-EC-Isolationsraten, wodurch möglicherweise Unterschiede zwischen den verschiedenen PAP-Behandlungen überdeckt wurden. Trotzdem stellen die in dieser Studie gesammelten Ergebnisse und gewonnenen Erkenntnisse einen ersten wichtigen Schritt in der Etablierung von Antibiotic Stewardship-Programmen in Pferdekliniken dar und könnten somit einen langfristigen Einfluss auf die lokale Verbreitung von ESBL-EC haben.
Antimicrobial resistance (AMR) is of paramount importance in the context of One Health, an integrated and unifying approach that aims to achieve a sustainable balance in the well-being of people, domestic and wild animals, plants, and their shared environments. Whenever bacteria become resistant to the therapeutic effects of antibiotics, they can cause infections that are difficult to treat effectively, increasing the risk of severe disease progression and death. Although AMR can develop naturally over time and is per se “ancient”, the excessive use of antibiotics in human and veterinary medicine over the past century has significantly accelerated its emergence and spread. Opportunistic Gram-negative enterobacteria, particularly Escherichia coli (E. coli ) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) strains, increasingly exhibit resistance to multiple classes of clinically used antibiotics, thus presenting multidrug-resistant (MDR) phenotypes. To make matters worse, some of these strains combine multidrug resistance with high-level virulence, posing a threat to both immunocompromised and healthy individuals. Consequently, MDR E. coli and K. pneumoniae have been designated as high-risk pathogens by the World Health Organization, underscoring the urgent need for new antibiotic development.
This thesis is motivated by the fact that only a limited number of international high-risk clonal E. coli and K. pneumoniae lineages stand out across all One Health dimensions and dominate the broad pool of MDR enterobacteria. While we only know little about the underlying drivers and contributing factors impacting their occurrence, emergence, and adaptation across different ecologies, this thesis employs a diverse range of bioinformatics and phenotypic approaches to identify the key factors important for the success of these lineages, also in rather under-explored settings. It includes three main components: (i) the analysis of genomic survey data of MDR E. coli isolates from ecologies in sub-Saharan Africa, (ii) the application of functional genomics and phenotyping techniques to characterize bacterial virulence and assess its clinical relevance in a food-borne E. coli strain, and (iii) the investigation of evolutionary pathways that promote the development of resistance to a novel drug combination and exploring compensatory mechanisms in a K. pneumoniae strain. To achieve these objectives, this research integrates genomics and transcriptomics with molecular biology and functional studies encompassing a comprehensive set of in vitro and in vivo virulence and resilience assays to explore MDR bacteria in-depth.
We provide compelling evidence for the broad occurrence of successful high-risk clonal lineages in the One Health context and their circulation among clinics, wildlife, and food in international locations. In the first study, we isolated extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli strains from houseflies collected from various wards at the University Teaching Hospital of Butare (Rwanda). In a follow-up study, we then examined in-depth the genomes of additional ESBL-producing E. coli from the same clinic and obtained from hospitalized patients, their caregivers, associated community members, and pets. The analyses revealed that the sample sets from this sub-Saharan African context consisted predominantly of globally recognized E. coli lineages, including sequence types (ST)131, ST167, ST410, and ST617. They play a pivotal role in the further dissemination and stabilization of AMR across diverse habitats within the One Health context. Moreover, our genomic results emphasize that these One Health-related high-risk clonal lineages exhibit the ability to successfully combine multidrug resistance with high-level bacterial virulence.
To gain a more detailed understanding of the sophisticated interplay of virulence and AMR, we developed and refined a set of in vitro and in vivo methods for virulence phenotyping. These methodologies enabled us to characterize pathogens based on crucial clinical aspects such as biofilm formation, siderophore secretion, resistance to complement-mediated killing, and their capacity to cause mortality in Galleria mellonella larvae. By using a food-borne E. coli strain from an internationally recognized high-risk clonal lineage, we verified the remarkable combination of a MDR phenotype with clinically significant virulence properties, including synthesis of curli fibers and cellulose as part of biofilm formation, extensive secretion of siderophores, resilience against complement-containing human serum and pronounced mortality in the infection model.
Nevertheless, the success of One Health-related high-risk clonal lineages does not rely solely on an “ideal” synergistic interplay between bacterial virulence and AMR. It also depends on their ability to rapidly mitigate the fitness costs associated with AMR acquisition, as these costs manifest in the form of reduced competitiveness and virulence in the absence of antibiotics. However, this is at odds with the observation of the global distribution of One Health-related high-risk clonal lineages across various One Health dimensions, even in environments with expectedly low selection pressures. To comprehensively address this, we conducted experimental evolution studies selecting for ceftazidime-avibactam-resistant mutants, which illuminated the rapid adaptations to changing environments. The adaptations and compensatory mechanisms were seemingly driven by major bacterial regulators, including the envelope stress response regulator RpoE on genomic and transcriptomic levels.
In conclusion, the results of this thesis shed light on the fundamental principles that govern the character and interplay between AMR and bacterial virulence and advance our understanding of the contributors and drivers of successful MDR international high-risk clonal lineages in the One Health context. This is also important for effective and alternative intervention strategies to prospectively further address the global threat of AMR.
Background and Objectives: Alzheimer’s disease (AD) stands as a pervasive neurodegenerative ailment of global concern, necessitating a relentless pursuit of remedies. This study aims to furnish a comprehensive exposition, delving into the intricate mechanistic actions of medicinal herbs and phytochemicals. Furthermore, we assess the potential of these compounds in inhibiting human acetylcholinesterase through molecular docking, presenting encouraging avenues for AD therapeutics. Materials and Methods: Our approach entailed a systematic exploration of phytochemicals like curcumin, gedunin, quercetin, resveratrol, nobiletin, fisetin, and berberine, targeting their capability as human acetylcholinesterase (AChE) inhibitors, leveraging the PubChem database. Diverse bioinformatics techniques were harnessed to scrutinize molecular docking, ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity), and adherence to Lipinski’s rule of five. Results: Results notably underscored the substantial binding affinities of all ligands with specific amino acid residues within AChE. Remarkably, gedunin exhibited a superior binding affinity (−8.7 kcal/mol) compared to the reference standard. Conclusions: These outcomes accentuate the potential of these seven compounds as viable candidates for oral medication in AD treatment. Notably, both resveratrol and berberine demonstrated the capacity to traverse the blood-brain barrier (BBB), signaling their aptitude for central nervous system targeting. Consequently, these seven molecules are considered orally druggable, potentially surpassing the efficacy of the conventional drug, donepezil, in managing neurodegenerative disorders.
Despite recent advances in the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC), acquired drug resistance to targeted therapy remains a major obstacle. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) has been identified as a key resistance mechanism in NSCLC. Here, we investigated the mechanistic role of key EMT-regulating small non-coding microRNAs (miRNAs) in sublines of the NSCLC cell line HCC4006 adapted to afatinib, erlotinib, gefitinib, or osimertinib. The most differentially expressed miRNAs derived from extracellular vesicles were associated with EMT, and their predicted target ZEB1 was significantly overexpressed in all resistant cell lines. Transfection of a miR-205-5p mimic partially reversed EMT by inhibiting ZEB1, restoring CDH1 expression, and inhibiting migration in erlotinib-resistant cells. Gene expression of EMT-markers, transcription factors, and miRNAs were correlated during stepwise osimertinib adaptation of HCC4006 cells. Temporally relieving cells of osimertinib reversed transition trends, suggesting that the implementation of treatment pauses could provide prolonged benefits for patients. Our results provide new insights into the contribution of miRNAs to drug-resistant NSCLC harboring EGFR-activating mutations and highlight their role as potential biomarkers and therapeutic targets.
Because of the importance of gastric emptying for pharmacokinetics, numerous methods have been developed for its determination. One of the methods is the salivary tracer technique, which utilizes an ice capsule containing caffeine as a salivary tracer. Despite the ice capsule’s advantage in labeling ingested fluids with caffeine for subsequent salivary detection, its risk of premature melting before swallowing, and its complicated storage and preparation, limit its application, particularly in special populations (e.g., older people). For this reason, here, a compression-coated tablet was developed and validated against the ice capsule in a cross-over clinical trial. The two dosage forms were administered simultaneously to 12 volunteers in an upright position under fasted and fed state conditions. To distinguish the caffeine concentrations in saliva from each dosage form, regular type of caffeine (12C) was added to the tablet, while for the ice capsule 13C3 labelled caffeine was used. The salivary caffeine concentrations showed no statistically significant differences for the pharmacokinetic parameters tmax and AUC0→60 (p > 0.05). Thus, the new formulation is a useful tool for determining gastric emptying that can also be used in special populations.
Dermatophytosis, the most prevalent fungal infection, is witnessing a rising incidence annually. To address this challenge, we developed a terbinafine-loaded oil-in-water nanoemulsion (TH-NE) through the aqueous microtitration method. The formulation comprised olive oil (oil phase), Span 80 (surfactant), and propylene glycol (co-surfactant). Pseudo-phase ternary diagrams and thermodynamic studies underscored the stability of TH-NE. Employing the Box–Behnken design (BBD), we optimized TH-NE, which resulted in a remarkable particle size of 28.07 nm ± 0.5, a low polydispersity index (PDI) of 0.1922 ± 0.1, and a substantial negative zeta potential of −41.87 mV ± 1. Subsequently, TH-NE was integrated into a 1.5% carbopol matrix, yielding a nanoemulgel (TH-NEG). Texture analysis of TH-NEG demonstrated a firmness of 168.00 g, a consistency of 229.81 g/s, negative cohesiveness (−83.36 g), and a work of cohesion at −107.02 g/s. In vitro drug release studies revealed an initial burst effect followed by sustained release, with TH-NEG achieving an impressive 88% release over 48 h, outperforming TH-NE (74%) and the marketed formulation (66%). Ex vivo release studies mirrored these results, with TH-NEG (86%) and TH-NE (71%) showcasing sustained drug release in comparison to the marketed formulation (67%). Confocal microscopy illustrated that TH-NEG and TH-NE penetrated to depths of 30 µm and 25 µm, respectively, into the epidermal layer. Furthermore, dermatokinetic studies highlighted the enhanced drug penetration of TH-NEG compared to TH-NE through mouse skin. In summary, our study establishes TH-NEG as a promising carrier for terbinafine in treating dermatophytosis, offering improved drug delivery and sustained release potential.
Synthesis of Quercetin-Loaded Silver Nanoparticles and Assessing Their Anti-Bacterial Potential
(2023)
The study delves into the multifaceted potential of quercetin (Qu), a phytoconstituent found in various fruits, vegetables, and medicinal plants, in combination with silver nanoparticles (AgNPs). The research explores the synthesis and characterization of AgNPs loaded with Qu and investigates their pharmaceutical applications, particularly focusing on antibacterial properties. The study meticulously evaluates Qu’s identity, and physicochemical properties, reaffirming its suitability for pharmaceutical use. The development of Qu-loaded AgNPs demonstrates their high drug entrapment efficiency, ideal particle characteristics, and controlled drug release kinetics, suggesting enhanced therapeutic efficacy and reduced side effects. Furthermore, the research examines the antibacterial activity of Qu in different solvents, revealing distinct outcomes. Qu, both in methanol and water formulations, exhibits antibacterial activity against Escherichia coli, with the methanol formulation displaying a slightly stronger efficacy. In conclusion, this study successfully synthesizes AgNPs loaded with Qu and highlights their potential as a potent antibacterial formulation. The findings underscore the influence of solvent choice on Qu’s antibacterial properties and pave the way for further research and development in drug delivery systems and antimicrobial agents. This innovative approach holds promise for addressing microbial resistance and advancing pharmaceutical formulations for improved therapeutic outcomes.
The goal of this study was to assess the anticancer efficacy of chlorojanerin against various cancer cells. The effects of chlorojanerin on cell cytotoxicity, cell cycle arrest, and cell apoptosis were examined using MTT assay, propidium iodide staining, and FITC Annexin V assay. RT-PCR was employed to determine the expression levels of apoptosis-related genes. Furthermore, docking simulations were utilized to further elucidate the binding preferences of chlorojanerin with Bcl-2. According to MTT assay, chlorojanerin inhibited the proliferation of all tested cells in a dose-dependent manner with a promising effect against A549 lung cancer cells with an IC50 of 10 µM. Cell growth inhibition by chlorojanerin was linked with G2/M phase cell cycle arrest in A549 treated cells. Flow cytometry analysis indicated that the proliferation inhibition effect of chlorojanerin was associated with apoptosis induction in A549 cells. Remarkably, chlorojanerin altered the expression of many genes involved in apoptosis initiation. Moreover, we determined that chlorojanerin fit into the active site of Bcl-2 according to the molecular docking study. Collectively, our results demonstrate that chlorojanerin mediated an anticancer effect involving cell cycle arrest and apoptotic cell death and, therefore, could potentially serve as a therapeutic agent in lung cancer treatment.
The absorption of drugs with narrow absorption windows in the upper small intestine can be improved with a mucoadhesive drug delivery system such as enteric films. To predict the mucoadhesive behaviour in vivo, suitable in vitro or ex vivo methods can be performed. In this study, the influence of tissue storage and sampling site on the mucoadhesion of polyvinyl alcohol film to human small intestinal mucosa was investigated. Tissue from twelve human subjects was used to determine adhesion using a tensile strength method. Thawing of tissue frozen at −20 °C resulted in a significantly higher work of adhesion (p = 0.0005) when a low contact force was applied for one minute, whereas the maximum detachment force was not affected. When the contact force and time were increased, no differences were found for thawed tissue compared to fresh tissue. No change in adhesion was observed depending on the sampling location. Initial results from a comparison of adhesion to porcine and human mucosa suggest that the tissues are equivalent.
Development of Test Programs for the Biorelevant Characterization of Esophageal-Applied Dosage Forms
(2023)
In the local treatment of the esophageal mucosa, the retention time of the different dosage forms, such as tablets, films or liquids, is of high relevance for the effective treatment of diseases. Unfortunately, there are only few in vitro models describing the esophageal route of administration. To predict the behaviour of an esophageal-applied dosage form, it is necessary to simulate the site of application in a biorelevant way. The aim of this work was to develop two test setups for an esophageal peristalsis model which was described in a previous study. Different parameters such as flow rate, peristalsis, angle of inclination or mucous membrane were varied or introduced into the model. A stimulated and unstimulated modus were developed and tested with two different dosage forms. The time until the dosage form was cleared from the in vitro model was shorter with the stimulated than with the unstimulated modus. Also, esophageal-applied films had a prolonged transit time compared to a viscous syrup. The modification of the simulated esophageal surface made it possible to estimate the retention time of the dosage forms. It could be demonstrated that the residence time of a dosage form depends on different parameters affecting each other.
Humans consume snail flesh as part of their diet. To assess its nutritional value and toxicity, chemical analyses were conducted to confirm the presence of protein, total and reduced carbohydrates, fat, fatty acid composition and mineral components. Furthermore, an acute toxicity study was carried out to determine the safety of Helix aspersa Müller snail flesh. H. aspersa Müller snail flesh exhibits a high nutritional content, a good ω3/ω6 ratio and higher levels of unsaturated fatty acids. Various minerals have been found in the flesh of H. aspersa Müller. Around 76.91 kcal, or 3.84% of the energy of a daily meal of 2000 kcal, are present in 100 g of this flesh. The evaluation of the antioxidant capacity indicated that the flesh’s extracts contained a large quantity of antioxidant biomolecules. Administration of the aqueous extract of H. aspersa Müller flesh didn’t cause death in laboratory rats, indicating that the lethal dose 50 is greater than 2000 mg·kg−1 body weight. The consumption of the flesh of H. aspersa Müller is highly recommended for human consumption due to its high concentration of nutrients and essential elements, as well as unsaturated fats, and due to its safety.
The microbiome of the colon is characterized by its great diversity. This varies not only intra- but also interindividually and is influenced by endogenous and exogenous factors, such as dietary and lifestyle factors. The aim of this work was to investigate the extent to which the degradation of the drug sulfasalazine is influenced by different microbiota. Therefore, the in vitro model MimiCol3 was used, which represents the physiological conditions of the ascending colon. In addition to a representative physiological volume, the pH value, redox potential and an anaerobic atmosphere are important to provide the bacteria with the best possible growth conditions. Stool samples were taken from three healthy subjects, comparing omnivorous, vegetarian and meat-rich diets, and cultured for 24 h. However, the nutrient medium used for cultivation led to the alignment of the bacterial composition of the microbiota. The previously observed differences between the diets could not be maintained. Nevertheless, the similar degradation of sulfasalazine was observed in all microbiota studied in MimiCol3. This makes MimiCol3 a suitable in vitro model for metabolism studies in the gut microbiome.
Multidrug-resistant gram-negative pathogens such as Escherichia coli have become increasingly difficult to treat and therefore alternative treatment options are needed. Targeting virulence factors like biofilm formation could be one such option. Inhibition of biofilm-related structures like curli and cellulose formation in E. coli has been shown for different phenolic natural compounds like epigallocatechin gallate. This study demonstrates this effect for other structurally unrelated phenolics, namely octyl gallate, scutellarein and wedelolactone. To verify whether these structurally different compounds influence identical pathways of biofilm formation in E. coli a broad comparative RNA-sequencing approach was chosen with additional RT-qPCR to gain initial insights into the pathways affected at the transcriptomic level. Bioinformatical analysis of the RNA-Seq data was performed using DESeq2, BioCyc and KEGG Mapper. The comparative bioinformatics analysis on the pathways revealed that, irrespective of their structure, all compounds mainly influenced similar biological processes. These pathways included bacterial motility, chemotaxis, biofilm formation as well as metabolic processes like arginine biosynthesis and tricarboxylic acid cycle. Overall, this work provides the first insights into the potential mechanisms of action of novel phenolic biofilm inhibitors and highlights the complex regulatory processes of biofilm formation in E. coli.
Overexpression of polo-like kinase 1 (PLK1) has been found in many different types of cancers. With its essential role in cell proliferation, PLK1 has been determined to be a broad-spectrum anti-cancer target. In this study, 3D-QSAR, molecular docking, and molecular dynamics (MD) simulations were applied on a series of novel pteridinone derivatives as PLK1 inhibitors to discover anti-cancer drug candidates. In this work, three models—CoMFA (Q² = 0.67, R² = 0.992), CoMSIA/SHE (Q² = 0.69, R² = 0.974), and CoMSIA/SEAH (Q² = 0.66, R² = 0.975)—of pteridinone derivatives were established. The three models that were established gave R²(pred) = 0.683, R²(pred) = 0.758, and R²(pred) = 0.767, respectively. Thus, the predictive abilities of the three proposed models were successfully evaluated. The relations between the different champs and activities were well-demonstrated by the contour chart of the CoMFA and CoMSIA/SEAH models. The results of molecular docking indicated that residues R136, R57, Y133, L69, L82, and Y139 were the active sites of the PLK1 protein (PDB code: 2RKU), in which the more active ligands can inhibit the enzyme of PLK1. The results of the molecular dynamic MD simulation diagram were obtained to reinforce the previous molecular docking results, which showed that both inhibitors remained stable in the active sites of the PLK1 protein (PDB code: 2RKU) for 50 ns. Finally, a check of the ADME-Tox properties of the two most active molecules showed that molecular N° 28 could represent a good drug candidate for the therapy of prostate cancer diseases.
Seventeen bacterial strains able to suppress plant pathogens have been isolated from healthy Vietnamese crop plants and taxonomically assigned as members of the Bacillus cereus group. In order to prove their potential as biocontrol agents, we perform a comprehensive analysis that included the whole-genome sequencing of selected strains and the mining for genes and gene clusters involved in the synthesis of endo- and exotoxins and secondary metabolites, such as antimicrobial peptides (AMPs). Kurstakin, thumolycin, and other AMPs were detected and characterized by different mass spectrometric methods, such as MALDI-TOF-MS and LIFT-MALDI-TOF/TOF fragment analysis. Based on their whole-genome sequences, the plant-associated isolates were assigned to the following species and subspecies: B. cereus subsp. cereus (6), B. cereus subsp. bombysepticus (5), Bacillus tropicus (2), and Bacillus pacificus. These three isolates represent novel genomospecies. Genes encoding entomopathogenic crystal and vegetative proteins were detected in B. cereus subsp. bombysepticus TK1. The in vitro assays revealed that many plant-associated isolates enhanced plant growth and suppressed plant pathogens. Our findings indicate that the plant-associated representatives of the B. cereus group are a rich source of putative antimicrobial compounds with potential in sustainable agriculture. However, the presence of virulence genes might restrict their application as biologicals in agriculture.
In den Weltmeeren findet rund die Hälfte der jährlichen globalen Kohlenstofffixierung statt, davon ein großer Anteil in küstennahen Regionen. Hier kommt es zu wiederkehrenden saisonalen Algenblüten, die durch eine zeitlich begrenzte explosionsartige Vermehrung von Mikroalgen (hauptsächlich Diatomeen und Coccolithophoren) charakterisiert sind. Vor allem Frühjahrsblüten (März-Mai) haben aufgrund ihrer zeitlichen und räumlichen Vorhersagbarkeit einen hohen Stellenwert als Modellsysteme, anhand deren sich der Kohlenstoffkreislauf der Meere untersuchen lässt.
Mikroalgen produzieren eine große Vielfalt an Makromolekülen, die für die mit ihnen vergesellschafteten Bakterien als Nahrungsgrundlage dienen. Besonders im Fokus stehen hier die für den Kohlenstoffkreislauf relevanten Polysaccharide. Im Gegensatz zu anderen natürlichen Makromolekülen wie DNA oder Proteinen können Polysaccharide aus vielen verschiedenen Monomeren mit unterschiedlichsten Bindungen bestehen. Zusätzlich finden sich an diesen Zuckermonomeren viele Modifikationen wie Acetylierungen, Methylierungen oder Sulfatierungen, die die Komplexität weiter erhöhen. Diese Variabilität bedingt eine hohe strukturelle und funktionale Diversität. So können Polysaccharide Speicherstoffe, Zellwandbestandteile oder Teile der extrazellulären Matrix darstellen.
Komplementär hierzu besitzen Polysaccharid-verwertende Bakterien entsprechend komplexe, enzymatische Abbaumechanismen. Besonders hervorzuheben sind hier die Bakterien des Phylums Bacteroidota, die sich in verschiedensten Nischen auf den Abbau von Polysacchariden spezialisiert haben. Sie finden sich in Bodenproben, als Teil der menschlichen Darmflora, oder eben auch als bedeutende Begleiter von Algenblüten.
Bacteroidota (und in marinen Systemen hauptsächlich die zu ihnen gehörenden Flavobakterien) besitzen zum Abbau diverser Polysaccharide sogenannte Polysaccharide utilization loci (PULs), genomische Inseln, die alle notwendigen Proteine zur Aufnahme und Abbau eines bestimmten Polysaccharids codieren. Hierzu gehören hochspezifische Enzyme (Carbohydrate-active enzymes, CAZymes), transkriptionelle Regulatoren sowie Transportersysteme, die initial gespaltene Oligosaccharide über die Membran in das Bakterium transportieren, wo sie von weiteren Enzymen vollständig abgebaut werden. Diese Co-Lokalisation der benötigten Gene und deren gemeinsame Regulation stellt einen enormen Selektionsvorteil der Bacteroidota dar und ist der Grund, warum sie, ähnlich wie Algen, einer jährlich wiederkehrenden Sukzession folgen, die sich gut untersuchen lässt.Die Forschungsartikel, die Teil dieser Doktorarbeit sind, untersuchen das Zusammenspiel von Polysaccharid-produzierenden Algen mit den Bakterien, die sie abbauen, aber auch darauf basierende Beziehungen der Bakterien untereinander. Die erste Publikation beschäftigt sich mit dem weit verbreiteten Speicherpolysaccharid α-Glucan, für das der Großteil der blütenbegleitenden Bakterien einen spezifischen aktiven PUL besitzt. Eine Untersuchung der in der Blüte vorhandenen Algenarten bestätigte, dass die Blüte von β-Glucan-produzierenden Algen dominiert wird. Da Bakterien aber selbst α-Glucane als Speicherpolysaccharide verwenden, konnte gezeigt werden, dass nicht die Algen selbst, sondern die Bakterien Hauptproduzent dieser Polysaccharide während einer Phytoplanktonblüte sind. Bakterielle Proteine, die dem Abbau von Algen-β-Glucan und dem daraus folgenden Aufbau von bakteriellem α-Glucan dienen, waren in Umweltproben und in Laborkulturen unter ähnlichen Bedingungen abundant. Die Untersuchung von extrahiertem bakteriellem Polysaccharid bewies, dass dieses nicht nur α-Glucan enthält, sondern dass dieses Polysaccharid auch in der Lage war, α-Glucan PULs mariner Bakterien zu induzieren. Hier zeigte sich ein innerhalb des marinen Kohlenstoffkreislaufs bisher wenig berücksichtigter Kreislauf, indem Bakterien Polysaccharide anderer Bakterien nutzen, die z.B. durch Viren lysiert wurden.
Die anderen zwei Artikel dieser Arbeit befassen sich mit dem Abbau von Zellwandpolysacchariden durch blütenassoziierte Modellbakterien. In einer der Studien wird detailliert der Abbau eines β-Mannans (ein Polysaccharid das hauptsächlich aus dem Monosaccharid Mannose besteht) durch ein Bakterium des Genus Muricauda beschrieben. Die PUL-Struktur dieses Bakteriums kam in mehreren anderen Phytoplanktonblüten-assoziierten Bakterien vor. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass es sich hier um ein Mannan mit zusätzlichen Galactose- und Glucose-Substitutionen handelte. Proteom-Untersuchungen bestätigten, dass das Bakterium derartige Substrate unter Induktion des β-Mannan-PULs nutzen können. β-Mannan konnte durch Antikörpermarkierung in Blütenproben sowie spezifischen Mikroalgenarten (Chaetoceros, Coscinodiscus) nachgewiesen werden. Die in dieser Publikation charakterisieren β-Mannan-PUL-codierten Enzyme waren in der Lage, dieses Signal zu löschen, was bewies, dass Muricauda sp. Mannan-basierte Zellwandpolysaccharide bestimmter Arten von Mikroalgen abbauen kann.
Die dritte Studie geht näher auf den Abbau von Xylanen (bestehend aus Xylose) durch ein blütenassoziiertes Bakterium des Genus Flavimarina ein. In diesem Bakterium wurden anhand der enthaltenen Xylanasen zwei putative Xylan-PULs annotiert. Wachstumsexperimente und Proteom-Untersuchungen zeigten, dass einer dieser PULs hauptsächlich bei Wachstum auf Glucoronoxylan induziert wird, während der andere PUL aufArabinoxylane stärker reagierte. Untersuchung der PUL-CAZymes bestätigte diese Ergebnisse durch Charakterisierung mehrerer Xylanasen sowie Glucoronidasen und Arabinofuranosidasen. Zusätzlich codierten beide PULs für Esterasen, die eine Modifikation der natürlichen Substrate durch Acetylierungen oder Methylierungen nahelegen. Da all diese Merkmale von terrestrischen Xylanen geteilt werden und in Blütenproben aus Küstennahen Regionen Xylane nachgewiesen wurden, ist es möglich, dass Bakterien aus solchen Regionen sowohl Xylane terrestrischen Ursprungs (z.B. durch Flusseinspeisung) sowie marinen Ursprungs abbauen können.
For the characterization of Kv7.2/3 channel activators, several analytical methods are available that vary in effort and cost. In addition to the technically elaborate patch-clamp method, which serves as a reference method, there exist several medium to high-throughput screening methods including a rubidium efflux flame-atomic absorption spectrometry (F-AAS) assay and a commercial thallium uptake fluorescence-based assay. In this study, the general suitability of a graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS)-based rubidium efflux assay as a screening method for Kv7.2/3 channel activators was demonstrated. With flupirtine serving as a reference compound, 16 newly synthesizedcompounds and the known Kv7.2/3 activator retigabine were first classified as either active or inactive by using the GF-AAS-based rubidium (Rb) efflux assay. Then, the results were compared with a thallium (Tl) uptake fluorescence-based fluorometric imaging plate reader (FLIPR) potassium assay. Overall, 16 of 17 compounds were classified by the GF-AAS-based assay in agreement with their channel-activating properties determined by the more expensive Tl uptake, fluorescence-based assay. Thus, the performance of the GF-AAS-based Rb assay for primary drug screening of Kv7.2/3-activating compounds was clearly demonstrated, as documented by the calculated Z’-factor of the GF-AAS-based method. Moreover, method development included optimization of the coating of the microtiter plates and the washing procedure, which extended the range of this assay to poorly adherent cells such as the HEK293 cells used in this study.
Marine Bacteroidetes that degrade polysaccharides contribute to carbon cycling in the ocean. Organic matter, including glycans from terrestrial plants, might enter the oceans through rivers. Whether marine bacteria degrade structurally related glycans from diverse sources including terrestrial plants and marine algae was previously unknown. We show that the marine bacterium Flavimarina sp. Hel_I_48 encodes two polysaccharide utilization loci (PULs) which degrade xylans from terrestrial plants and marine algae. Biochemical experiments revealed activity and specificity of the encoded xylanases and associated enzymes of these PULs. Proteomics indicated that these genomic regions respond to glucuronoxylans and arabinoxylans. Substrate specificities of key enzymes suggest dedicated metabolic pathways for xylan utilization. Some of the xylanases were active on different xylans with the conserved β-1,4-linked xylose main chain. Enzyme activity was consistent with growth curves showing Flavimarina sp. Hel_I_48 uses structurally different xylans. The observed abundance of related xylan-degrading enzyme repertoires in genomes of other marine Bacteroidetes indicates similar activities are common in the ocean. The here presented data show that certain marine bacteria are genetically and biochemically variable enough to access parts of structurally diverse xylans from terrestrial plants as well as from marine algal sources.
Flupirtine and retigabine were essential drugs to combat pain and epilepsy. However, the Kv7 potassium channel openers are fraught with hepatotoxicity and tissue discoloration, respectively, limiting their therapeutic value. Both adverse events are likely due to reactive metabolites arising from oxidative metabolism. Designing safer analogues lacking the structural elements leading to described side effects is an active area of current research. One of the main metabolites of flupirtine is the biologically inactive 4-fluorohippuric acid. Hitherto unexplained, the proposed metabolic pathway leading to the formation of 4-fluorohippuric acid from flupirtine is verified here. Through the use of eighteen flupirtine analogues, mechanistic details of this pathway could be elucidated. A possible connection with the in vitro hepatotoxicity of the flupirtine analogues and the levels of 4-fluorobenzoic acid formed in enzyme incubations was examined by correlation analysis. These findings provide important information for the design of new flupirtine analogues as potential drug candidates.
Die Therapie von Erkrankungen des hinteren Auges erfolgt heute hauptsächlich durch die intravitreale Injektion von Lösungen, Suspensionen oder Implantaten. Um neue intravitreale Arzneiformen zu entwickeln werden in der präklinischen Phase neben In vitro-Untersuchungen zur Wirkstofffreisetzung auch In vivo-Studien an Tieren verwendet. Die Physiologie des Auges der verwendeten Tiere weicht jedoch von denen des humanen Glaskörpers ab, weshalb die Übertragbarkeit der Ergebnisse teilweise kontrovers diskutiert wird. Durch eine Kombination dieser in vivo-Studien mit biorelevanteren In vitro-Freisetzungsmodellen könnte ein besseres Verständnis für das Verhalten von intravitrealen Arzneiformen erhalten werden.
In dieser Arbeit wurde die EyeFlowCell entwickelt, bei der zentral der humane Glaskörper durch ein künstliches Gel simuliert wird. In dieses Glaskörpersubstitut injizierte Arzneiformen können hinsichtlich ihrer Wirkstofffreisetzung unter verschiedenen Aspekten charakterisiert werden…
Pentathiepins are cyclic polysulfides that exert antiproliferative and cytotoxic activity in cancer cells, induce oxidative stress and apoptosis, and potently inhibit GPx1. These properties render this class of compounds promising candidates for the development of anticancer drugs. However, the biological effects and how they intertwine to promote high cytotoxicity have not been systematically assessed throughout a panel of cancer cell lines from distinct tissues of origin. In this thesis, six novel pentathiepins were analyzed and constitute the second generation of compounds with additional properties such as fluorescence or improved water solubility to facilitate cellular testing. All compounds underwent extensive biological evaluation in 14 human cancer cell lines. These studies included investigations of the inhibitory potential with regards to GPx1 and cell proliferation, examined the cytotoxicity in human cancer cell lines, as well as the induction of oxidative stress and DNA strand breaks. Furthermore, selected hallmarks of apoptosis, ferroptosis, and autophagy were studied. Experimental approaches regarding these cellular mechanisms included observing morphological changes, detecting phosphatidyl serine exposure and caspase activity, and quantifying cleaved PARP1 and levels of LC3B II. In addition, the analysis of the cell cycle aimed to identify aberrations or arrests in cell division.
Five of the six tested pentathiepins proved to be potent inhibitors of the GPx1, while all six exerted high cytotoxic and antiproliferative activity, although to different extents. There was a clear connection observed between the potential to provoke oxidative stress and damage to DNA in the form of single- and double-strand breaks both extra- and intracellularly. Furthermore, various experiments supported apoptosis but not ferroptosis as the mechanism of cell death in four different cell lines. In particular, the externalization of PS, the detection of activated caspases, and the cleavage of PARP1 corroborated this conclusion. Additionally, indications for autophagy were found, but more investigations are required to verify the current data. The findings of this dissertation are mainly in line with the postulated mechanism of action proposed for pentathiepins and a previous publication from our group that described their biological activity. However, the influence of modulators such as oxygen and GSH on the biological effects was ambiguous and dependent on the compound. The expression profile of the cell lines concerning GPx1 and CAT did not influence the cellular response toward the treatment, whereas the cell doubling time correlated with the cytotoxicity.
As the various pentathiepins give rise to different biological responses, modulation of the biological effects depends on the distinct chemical structures fused to the sulfur ring. This may allow for future optimization of the anticancer activity of pentathiepins. An analysis of the structure-activity relationships revealed that the piperazine scaffold was associated with superior biological activity compared to the pyrrolo-pyrazine backbone. Furthermore, substituents with electron-withdrawing properties or those providing a free electron pair, such as fluorine or morpholine, were advantageous. These findings should help design and synthesize the next generation of pentathiepins, thereby expanding the library of compounds, allowing for the further deduction of structure-activity relationships and an improved understanding of their mechanism of action.
The poor aqueous solubility of many drug substances has been addressed using different solubility enhancement approaches in the pharmaceutical technology field over the last decades. In this context, advanced drug delivery systems based on lipids referred to as SNEDDS were used to overcome solubility limitations of drugs, that are often associated with a low bioavailability after oral administration. There are numerous examples in the literature for the development of L-SNEDDS, which have led to some pharmaceutical products available on the market. As L-SNEDDS development using conventional methods requires a lot of time and experimental effort, a streamlining of this procedure was aimed in the first part of the presented work.
Starting with the development of L-SNEDDS formulations for solubility enhancement of poorly-water soluble drugs, extensive solubility studies with different BCS Class II drugs were performed in various excipients to determine drugs with high solubilities in these excipients as well as to evaluate multiple excipients for their suitability to be used in L-SNEDDS formulations. Celecoxib, efavirenz and fenofibrate were selected as model drugs and a pre-selection of excipients for further development was made. In a next step, a novel screening approach for L-SNEDDS formulation development based on a customized mapping method in a special triangular mixture design was established. This customized tool for L-SNEDDS development comprised the systematic analysis of results obtained with different in vitro characterization methods such as droplet size analysis and distribution, transmittance measurement and emulsification performance assessment. Furthermore, the novel approach streamlined the procedure for L-SNEDDS development as a reduction of experimental effort and time compared to conventional methods was achieved. The most promising L-SNEDDS formulations determined via the customized screening tool approach showed high drug release of celecoxib, efavirenz as well as fenofibrate, and clearly indicated that this method was suitable for efficiently designing stable and rapidly releasing L-SNEDDS formulations incorporating poorly water-soluble drugs.
After the successful development of L-SNEDDS formulations with different drug substances using the novel screening approach, a further aspect of this work dealt with conversion of L-SNEDDS into S-SNEDDS, since a limited storage stability has been reported for many L-SNEDDS formulations. The conversion into S-SNEDDS required the determination of appropriate solid carriers with different material properties depending on the manufacturing process. As a first technological approach, adsorption to a solid carrier was investigated by adding a carrier to drug-loaded L-SNEDDS applying a defined mixing ratio resulting in a solid, particulate formulation. When performing drug release studies, S-SNEDDS based on different commercial
carrier materials revealed major limitations due to incomplete drug release. Thus, a tailor-made microparticulate carrier material based on cellulose was developed for the purpose of adsorbing L-SNEDDS and presented with superior performance compared to conventional adsorbents based on cellulose or silica. Based on the obtained results, this novel cellulose-based microparticle prepared with gum arabic as a binder was determined to be the most promising material amongst all adsorptive carriers that were investigated.
In addition to the technology approach of adsorption, another manufacturing process was considered in the course of the present work, which focused on the preparation of S-SNEDDS by means of HME. As a successful conversion of L-SNEDDS into S-SNEDDS using HME processing requires at least one additional polymeric component, a selection of marketed (co-)polymers that were frequently used in the field of solubility enhancement were evaluated for their suitability in this context. Critical process parameters and target properties of the (co-)polymers were determined, ultimately leading to the idea of developing a novel, customized polymer in order to perform the conversion step via HME in a more suitable and effective manner. In this context, a new copolymer referred to as ModE, as it disclosed a structural association with the commercially available copolymer EUDRAGIT® E PO, was developed. The novel copolymer ModE was evaluated for its suitability for different formulation technologies and showed promising results when used for S-SNEDDS and ASD formulations prepared by the HME process. Different variants of ModE in terms of Mw, Tg and PDI were synthesized via radical polymerization and it was found that the modification of Mw, Tg and PDI of the novel aminomethacrylate-based copolymer had significant effects on drug release as well as storage stability of S-SNEDDS and ASDs. The ModE copolymer type with a Mw of 173 kDa turned out to be the most suitable candidate for S-SNEDDS development using HME technology. In addition, drug-loaded S-SNEDDS based on the ModE variant 173 kDa were storage stable and presented with the highest drug release among all S-SNEDDS formulations tested.
In conclusion, a novel screening tool approach for efficient L-SNEDDS development was established in order to streamline the process for obtaining stable and rapidly releasing L-SNEDDS formulations which improved the solubility of poorly water-soluble drugs. Apart from the L-SNEDDS development process, the conversion from L-SNEDDS into S-SNEDDS was successfully performed using the technology approaches of adsorption to a solid carrier and HME processing. An improved storage stability compared to L-SNEDDS as well as high drug release were achieved for several S-SNEDDS formulations, especially for those prepared with tailor-made materials. Based on the results obtained for S-SNEDDS formulations produced via adsorption, especially in terms of drug release performance, the new cellulose-based
microparticle carriers (M-GA and M-MC) turned out to be the most suitable materials. S-SNEDDS that were manufactured via HME presented with a superior performance regardless of the incorporated drug when comparing the results of S-SNEDDS with those of the corresponding ASDs regarding drug release performance, amorphicity/crystallinity and storage stability. In this context, among all S-SNEDDS formulations prepared via HME, S-SNEDDS based on the ModE variant 173 kDa showed the best results, especially when using the drug substances celecoxib and efavirenz. Although the S-SNEDDS formulation approach is still largely unexplored, based on the research results generated in the present work, it represents a promising technology platform that should definitely be further developed in future experiments.
Klebsiella pneumoniae is a common member of the intestinal flora of vertebrates. In addition to opportunistic representatives, hypervirulent (hvKp) and antibiotic-resistant K. pneumoniae (ABR-Kp) occur. While ABR-Kp isolates often cause difficult-to-treat diseases due to limited therapeutic options, hvKp is a pathotype that can infect healthy individuals often leading to recurrent infection. Here, we investigated the clinical K. pneumoniae isolate PBIO3459 obtained from a blood sample, which showed an unusual colony morphology. By combining whole-genome and RNA sequencing with multiple in vitro and in vivo virulence-associated assays, we aimed to define the respective Klebsiella subtype and explore the unusual phenotypic appearance. We demonstrate that PBIO3459 belongs to sequence type (ST)20 and carries no acquired resistance genes, consistent with phenotypic susceptibility tests. In addition, the isolate showed low-level virulence, both at genetic and phenotypic levels. We thus suggest that PBIO3459 is an opportunistic (commensal) K. pneumoniae isolate. Genomic comparison of PBIO3459 with closely related ABR-Kp ST20 isolates revealed that they differed only in resistance genes. Finally, the unusual colony morphology was mainly associated with carbohydrate and amino acid transport and metabolism. In conclusion, our study reveals the characteristics of a Klebsiella sepsis isolate and suggests that opportunistic representatives likely acquire and accumulate antibiotic resistances that subsequently enable their emergence as ABR-Kp pathogens.
Essential Oils as Multicomponent Mixtures and Their Potential for Human Health and Well-Being
(2022)
Essential oils (EOs) and their individual volatile organic constituents have been an inherent part of our civilization for thousands of years. They are widely used as fragrances in perfumes and cosmetics and contribute to a healthy diet, but also act as active ingredients of pharmaceutical products. Their antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory properties have qualified EOs early on for both, the causal and symptomatic therapy of a number of diseases, but also for prevention. Obtained from natural, mostly plant materials, EOs constitute a typical example of a multicomponent mixture (more than one constituent substances, MOCS) with up to several hundreds of individual compounds, which in a sophisticated composition make up the property of a particular complete EO. The integrative use of EOs as MOCS will play a major role in human and veterinary medicine now and in the future and is already widely used in some cases, e.g., in aromatherapy for the treatment of psychosomatic complaints, for inhalation in the treatment of respiratory diseases, or topically administered to manage adverse skin diseases. The diversity of molecules with different functionalities exhibits a broad range of multiple physical and chemical properties, which are the base of their multi-target activity as opposed to single isolated compounds. Whether and how such a broad-spectrum effect is reflected in natural mixtures and which kind of pharmacological potential they provide will be considered in the context of ONE Health in more detail in this review.
The present study covers the synthesis, purification and evaluation of a novel aminomethacrylate-based copolymer in terms of its suitability for improving the solubility and in vitro release of poorly water-soluble drug compounds. The new copolymer was synthesized by solvent polymerization with radical initiation and by use of a chain transfer agent. Based on its composition, it can be considered as a modified type of dimethylaminoethyl methacrylate-butyl methacrylate-methyl methacrylate “EUDRAGIT® E PO” (ModE). ModE was specifically developed to provide a copolymer with processing and application properties that exceed those of commercially available (co-)polymers in solubility enhancement technologies where possible. By varying the concentration of the chain transfer agent in the radical polymerization process, the molecular weight of ModE was varied in a range of 173–305 kDa. To evaluate the solubility-enhancing properties of ModE, a series of drug-loaded extrudates were prepared by hot melt extrusion using the novel—as well as several commercially available—(co-)polymers. These extrudates were then subjected to comparative tests for amorphousness, solubility-enhancing properties, storage stability, and drug release. Celecoxib, efavirenz, and fenofibrate were used as model drugs in all experiments. Of all the (co-)polymers included in the study, ModE with a molecular weight of 173 kDa showed the best performance in terms of desired properties and was shown to be particularly suitable for preparing amorphous solid dispersions (ASDs) of the three model drugs, which in a first set of dissolution experiments showed better release behavior under pH conditions of the fasting stomach than higher molecular weight ModE types, as well as a variety of commercially available (co-)polymers. Therefore, the results demonstrate the successful synthesis of a new copolymer, which in future studies will be investigated in more detail for universal application in the field of solubility enhancement.
Antimicrobial resistance is an increasing global problem and complicates successful treatments of bacterial infections in animals and humans. We conducted a longitudinal study in Mecklenburg-Western Pomerania to compare the occurrence of ESBL-producing Escherichia (E.) coli in three conventional and four organic pig farms. ESBL-positive E. coli, especially of the CTX-M type, were found in all fattening farms, confirming that antimicrobial resistance is widespread in pig fattening and affects both conventional and organic farms. The percentage of ESBL-positive pens was significantly higher on conventional (55.2%) than on organic farms (44.8%) with similar proportions of ESBL-positive pens on conventional farms (54.3–61.9%) and a wide variation (7.7–84.2%) on organic farms. Metadata suggest that the farms of origin, from which weaner pigs were purchased, had a major influence on the occurrence of ESBL-producing E. coli in the fattening farms. Resistance screening showed that the proportion of pens with multidrug-resistant E. coli was similar on conventional (28.6%) and organic (31.5%) farms. The study shows that ESBL-positive E. coli play a major role in pig production and that urgent action is needed to prevent their spread.
In the search for alternative treatment options for infections with multi-resistant germs, traditionally used medicinal plants are currently being examined more intensively. In this study, the antimicrobial and anti-biofilm activities of 14 herbal drugs were investigated. Nine of the tested drugs were traditionally used in Europe for treatment of local infections. For comparison, another five drugs monographed in the European Pharmacopoeia were used. Additionally, the total tannin and flavonoid contents of all tested drugs were analyzed. HPLC fingerprints were recorded to obtain further insights into the components of the extracts. The aim of the study was to identify herbal drugs that might be useable for treatment of infectious diseases, even with multidrug resistant E. coli, and to correlate the antimicrobial activity with the total content of tannins and flavonoids. The agar diffusion test and anti-biofilm assay were used to evaluate the antimicrobial potential of different extracts from the plants. Colorimetric methods (from European Pharmacopeia) were used for determination of total tannins and flavonoids. The direct antimicrobial activity of most of the tested extracts was low to moderate. The anti-biofilm activity was found to be down to 10 µg mL−1 for some extracts. Tannin contents between 2.2% and 10.4% of dry weight and total flavonoid contents between 0.1% and 1.6% were found. Correlation analysis indicates that the antimicrobial and the anti-biofilm activity is significantly (p < 0.05) dependent on tannin content, but not on flavonoid content. The data analysis revealed that tannin-rich herbal drugs inhibit pathogens in different ways. Thus, some of the tested herbal drugs might be useable for local infections with multi-resistant biofilm-forming pathogens. For some of the tested drugs, this is the first report about anti-biofilm activity, as well as total tannin and flavonoid content.
In the search for alternative treatment options for infections with multi-resistant germs,
traditionally used medicinal plants are currently being examined more intensively. In this study,
the antimicrobial and anti-biofilm activities of 14 herbal drugs were investigated. Nine of the tested
drugs were traditionally used in Europe for treatment of local infections. For comparison, another
five drugs monographed in the European Pharmacopoeia were used. Additionally, the total tannin
and flavonoid contents of all tested drugs were analyzed. HPLC fingerprints were recorded to ob-
tain further insights into the components of the extracts. The aim of the study was to identify herbal
drugs that might be useable for treatment of infectious diseases, even with multidrug resistant E.
coli, and to correlate the antimicrobial activity with the total content of tannins and flavonoids. The
agar diffusion test and anti-biofilm assay were used to evaluate the antimicrobial potential of dif-
ferent extracts from the plants. Colorimetric methods (from European Pharmacopeia) were used for
determination of total tannins and flavonoids. The direct antimicrobial activity of most of the tested
extracts was low to moderate. The anti-biofilm activity was found to be down to 10 µg mL −1 for
some extracts. Tannin contents between 2.2% and 10.4% of dry weight and total flavonoid contents
between 0.1% and 1.6% were found. Correlation analysis indicates that the antimicrobial and the
anti-biofilm activity is significantly (p < 0.05) dependent on tannin content, but not on flavonoid
content. The data analysis revealed that tannin-rich herbal drugs inhibit pathogens in different
ways. Thus, some of the tested herbal drugs might be useable for local infections with multi-re-
sistant biofilm-forming pathogens. For some of the tested drugs, this is the first report about anti-
biofilm activity, as well as total tannin and flavonoid content.
Fibers and yarns are part of everyday life. So far, fibers that are also used pharmaceutically have mainly been produced by electrospinning. The common use of spinning oils and the excipients they contain, in connection with production by melt extrusion, poses a regulatory challenge for pharmaceutically usable fibers. In this publication, a newly developed small-scale direct-spinning melt extrusion system is described, and the pharmaceutically useful polyvinyl filaments produced with it are characterized. The major parts of the system were newly developed or extensively modified and manufactured cost-effectively within a short time using rapid prototyping (3D printing) from various materials. For example, a stainless-steel spinneret was developed in a splice design for a table-top melt extrusion system that can be used in the pharmaceutical industry. The direct processing of the extruded fibers was made possible by a spinning system developed called Spinning-Rosi, which operates continuously and directly in the extrusion process and eliminates the need for spinning oils. In order to prevent instabilities in the product, further modifications were also made to the process, such as a the moisture encapsulation of the melt extrusion line at certain points, which resulted in a bubble-free extrudate with high tensile strength, even in a melt extrusion line without built-in venting.
The study aimed to examine the influence of a rotating magnetic field (RMF) of two different frequencies (5 and 50 Hz) on the expression of regulatory (agrA, hld, rot) and staphylococcal enterotoxin (SE—sea, sec, sel) genes as well as the production of SEs (SEA, SEC, SEL) by the Staphylococcus aureus FRI913 strain cultured on a medium supplemented with a subinhibitory concentration of trans-anethole (TA). Furthermore, a theoretical model of interactions between the bacterial medium and bacterial cells exposed to RMF was proposed. Gene expression and SEs production were measured using quantitative real-time PCR and ELISA techniques, respectively. Based on the obtained results, it was found that there were no significant differences in the expression of regulatory and SE genes in bacteria simultaneously cultured on a medium supplemented with TA and exposed to RMF at the same time in comparison to the control (unexposed to TA and RMF). In contrast, when the bacteria were cultured on a medium supplemented with TA but were not exposed to RMF or when they were exposed to RMF of 50 Hz (but not to TA), a significant increase in agrA and sea transcripts as compared to the unexposed control was found. Moreover, the decreased level of sec transcripts in bacteria cultured without TA but exposed to RMF of 50 Hz was also revealed. In turn, a significant increase in SEA and decrease in SEC and SEL production was observed in bacteria cultured on a medium supplemented with TA and simultaneously exposed to RMFs. It can be concluded, that depending on SE and regulatory genes expression as well as production of SEs, the effect exerted by the RMF and TA may be positive (i.e., manifests as the increase in SEs and/or regulatory gene expression of SEs production) or negative (i.e., manifests as the reduction in both aforementioned features) or none.
Application of In Vivo Imaging Techniques and Diagnostic Tools in Oral Drug Delivery Research
(2022)
Drug absorption following oral administration is determined by complex and dynamic interactions between gastrointestinal (GI) physiology, the drug, and its formulation. Since many of these interactions are not fully understood, the COST action on “Understanding Gastrointestinal Absorption-related Processes (UNGAP)” was initiated in 2017, with the aim to improve the current comprehension of intestinal drug absorption and foster future developments in this field. In this regard, in vivo techniques used for the characterization of human GI physiology and the intraluminal behavior of orally administered dosage forms in the GI tract are fundamental to gaining deeper mechanistic understanding of the interplay between human GI physiology and drug product performance. In this review, the potential applications, advantages, and limitations of the most important in vivo techniques relevant to oral biopharmaceutics are presented from the perspectives of different research fields.
Highly Virulent and Multidrug-Resistant Escherichia coli Sequence Type 58 from a Sausage in Germany
(2022)
Studies have previously described the occurrence of multidrug-resistant (MDR) Escherichia coli in human and veterinary medical settings, livestock, and, to a lesser extent, in the environment and food. While they mostly analyzed foodborne E. coli regarding phenotypic and sometimes genotypic antibiotic resistance and basic phylogenetic classification, we have limited understanding of the in vitro and in vivo virulence characteristics and global phylogenetic contexts of these bacteria. Here, we investigated in-depth an E. coli strain (PBIO3502) isolated from a pork sausage in Germany in 2021. Whole-genome sequence analysis revealed sequence type (ST)58, which has an internationally emerging high-risk clonal lineage. In addition to its MDR phenotype that mostly matched the genotype, PBIO3502 demonstrated pronounced virulence features, including in vitro biofilm formation, siderophore secretion, serum resilience, and in vivo mortality in Galleria mellonella larvae. Along with the genomic analysis indicating close phylogenetic relatedness of our strain with publicly available, clinically relevant representatives of the same ST, these results suggest the zoonotic and pathogenic character of PBIO3502 with the potential to cause infection in humans and animals. Additionally, our study highlights the necessity of the One Health approach while integrating human, animal, and environmental health, as well as the role of meat products and food chains in the putative transmission of MDR pathogens.
Antimicrobial resistance (AMR) is a serious global health threat and extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacterales are a major contributor. This study aimed to gain a deeper insight into the AMR burden of wild animals. In total, 1595 fecal samples were collected by two systematic searches in Mecklenburg-Western Pomerania, north-east Germany. Samples were screened for ESBL-carrying Escherichia (E.) coli and isolates found were further analyzed using antimicrobial susceptibility testing and whole-genome sequencing. We found an estimated prevalence of 1.2% ESBL-producing E. coli in wild boar and 1.1% in wild ruminants. CTX-M-1 was the most abundant CTX-M type. We also examined fecal samples from wild boar and wild ruminants using shotgun metagenomics to gain insight into the resistome in wild animals. The latter revealed significantly lower normalized counts for AMR genes in wildlife samples compared to farm animals. The AMR gene levels were lower in wild ruminants than in wild boar. In conclusion, our study revealed a low prevalence of ESBL-producing E. coli and a low overall AMR gene burden in wild boar and wild ruminants, probably due to the secluded location of the search area.
Characterization, Chemical Compounds and Biological Activities of Marrubium vulgare L. Essential Oil
(2022)
As consumer trends shift towards more natural and ecological consumption patterns, industrialists are actively working towards substituting synthetic chemicals with natural and vegan products that contain bioactive properties. Thus, considering the shifts in customer demand and the growing concern around vegetable sourced productions, this work aims to contribute to the valorization of aromatic and medicinal Moroccan plants. By focusing on the Marrubium vulgare L. species, our objective is to carry out a physicochemical characterization to determine its chemical composition and biological activities. The volatile fraction collected by hydrodistillation (0.61%) and analyzed by GC-MS (gas chromatography coupled to mass spectrometry) contains five main compounds: 3-Thujanone, Eugenol, Topanol, Menthone and Piperitone. The antioxidant activity has been estimated by applying the DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical scavenging test and the ferric reducing antioxidant power (FRAP). The values of inhibitory concentration prove that our oil is a good antioxidant, with values of IC50 = 1.136 mg/mL and IC50 = 2.998 mg/mL, respectively, for the DPPH and FRAP tests. The results of the antifungal activity indicate a significant inhibition of mycelial growth for both tested molds, as well as a total inhibition of spore production at a concentration of 0.25 µL/mL.
In recent years, the colon has become a hot topic in biopharmaceutical research as several in vitro models of the human colon have been presented. A major focus is on the characterization of the microbiota and its capabilities. The aim of the present study was to further develop the MimiCol, preserving its properties and accelerating data acquisition. Emphasis was placed on the simplicity of its design and easy scalability. To prove the viability of the concept, degradation of sulfasalazine was investigated, and the bacterial composition during the experiment was assessed by 16S rRNA sequencing. The transfer of the experimental conditions to the new model was successful. Commercially available components were implemented in the setup. The model MimiCol3 represented the colon ascendens satisfactorily in its properties regarding volume, pH value, and redox potential. 16S rRNA sequencing led to further insights into the bacterial composition in the vessels. Degradation of sulfasalazine was in good agreement with in vivo data. The new model of the colon ascendens MimiCol3 enabled us to collect more reliable data, as three experiments were conducted simultaneously under the same conditions.
Transmucosal drug delivery systems can be an attractive alternative to conventional oral dosage forms such as tablets. There are numerous in vitro methods to estimate the behavior of mucoadhesive dosage forms in vivo. In this work, a tensile test system was used to measure the mucoadhesion of polyvinyl alcohol films. An in vitro screening of potential influencing variables was performed on biomimetic agar/mucin gels. Among the test device-specific factors, contact time and withdrawal speed were identified as influencing parameters. In addition, influencing factors such as the sample area, which showed a linear relationship in relation to the resulting work, and the liquid addition, which led to an abrupt decrease in adhesion, could be identified. The influence of tissue preparation was investigated in ex vivo experiments on porcine small intestinal tissue. It was found that lower values of Fmax and Wad were obtained on processed and fresh tissue than on processed and thawed tissue. Film adhesion on fresh, unprocessed tissue was lowest in most of the animals tested. Comparison of ex vivo measurements on porcine small intestinal tissue with in vitro measurements on agar/mucin gels illustrates the inter- and intra-individual variability of biological tissue.
Species of the genus Drosera, known for carnivorous plants, such as sundew, have been traditionally used for centuries as medicinal plants. Efficacy-determining compounds are naphthoquinones and flavonoids. Flavonoids possess a broad spectrum of bioactive properties, including biofilm inhibitory activity. Biofilms render antibiotics ineffective, contributing to the current rise in antimicrobial resistance. In this study, the biofilm inhibitory activity of two European sundew species (Drosera rotundifolia and Drosera intermedia) grown agriculturally in Germany and four commercial sundew products (declared as Drosera longifolia, Drosera sp. and Drosera planta trit.) against three multidrug-resistant Escherichia coli strains was tested. The aim of the study was to comparatively investigate the biofilm inhibitory potential of sundew species extracts grown locally in northern Germany and commercial sundew products. The minimum biofilm inhibitory concentration of the European sundew species was approx. 35 µg mL−1. In comparison, commercial sundew products ranged in concentration from 75 to 140 µg mL−1. Additionally, individual compounds isolated from European sundew were tested. Among these compounds, biofilm inhibitory activity was determined for four of the eight substances, with 2″-O-galloyl hyperoside standing out for its activity (38 µg mL−1). The whole plant extracts of Drosera rotundifolia and Drosera intermedia proved to be more effective than the commercial products and the single compounds in its biofilm inhibition activity against Escherichia coli strains. Sundew extracts may serve as a potential therapeutic approach for targeting biofilm production.
Abstract
Aim
To verify synergistic effects, we investigated the antimicrobial activity of seven phenolic phytochemicals (gallic acid; epicatechin; epigallocatechin gallate; daidzein; genistein; myricetin; 3‐hydroxy‐6‐methoxyflavone) in combination with six antibiotics against multidrug‐resistant isolates from the ESKAPE group.
Methods and Results
To investigate single phytochemicals and combinations, initial microdilution and checkerboard assays were used, followed by time‐kill assays to evaluate the obtained results. The research revealed that phenolic compounds on their own resulted in little or no inhibitory effects. During preliminary tests, most of the combinations resulted in indifference (134 [71.3%]). In all, 30 combinations led to antagonism (15.9%); however, 24 showed synergistic effects (12.8%). The main tests resulted in nine synergistic combinations for the treatment of four different bacteria strains, including two substances (3‐hydroxy‐6‐methoxyflavone, genistein) never tested before in such setup. Time‐kill curves for combinations with possible synergistic effects confirmed the results against Acinetobacter baumannii as the one with the greatest need for research.
Conclusions
The results highlight the potential use of antibiotic–phytocompound combinations for combating infections with multi‐resistant pathogens. Synergistic combinations could downregulate the resistance mechanisms of bacteria.
Significance and Impact of the Study
The aim of this study is to demonstrate the potential use of phenolic natural compounds in combination with conventional antibiotics against multidrug‐resistant bacteria of the ESKAPE group. Due to synergistic effects of natural phenolic compounds combined with antibiotics, pathogens that are already resistant to antibiotics could be resensitized as we were able to reduce their MICs back to sensitive. In addition, combination therapies could prevent the development of resistance by reducing the dose of antibiotics. This approach opens up the basis for future development of antimicrobial therapy strategies, which are so urgently needed in the age of multidrug‐resistant pathogens.