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Target proteins in biotechnological applications are highly diverse. Therefore, versatile flexible expression systems for their functional overproduction are required. In order to find the right heterologous gene expression strategy, suitable host-vector systems, which combine different genetic circuits, are useful. In this study, we designed a novel Bacillus subtilis expression toolbox, which allows the overproduction and secretion of potentially toxic enzymes. This toolbox comprises a set of 60 expression vectors, which combine two promoter variants, four strong secretion signals, a translation-enhancing downstream box, and three plasmid backbones. This B. subtilis toolbox is based on a tailor-made, clean deletion mutant strain, which is protease and sporulation deficient and exhibits reduced autolysis and secondary metabolism. The appropriateness of this alternative expression platform was tested for the overproduction of two difficult-to-produce eukaryotic model proteins. These included the sulfhydryl oxidase Sox from Saccharomyces cerevisiae, which forms reactive hydrogen peroxide and undesired cross-linking of functional proteins, and the human interleukin-1β, a pro-inflammatory cytokine. For the best performing Sox and interleukin, overproducing and secreting variants of these new B. subtilis toolbox fermentation strategies were developed and tested. This study demonstrates the suitability of the prokaryotic B. subtilis host-vector system for the extracellular production of two eukaryotic proteins with biotechnological relevance.
Vertreter der Gattung Bacillus werden nicht zuletzt wegen ihrer guten Sekretionsleistung als Expressionswirte in der pharmazeutischen und chemischen Industrie genutzt und stellen eine Alternative zum gramnegativen Bakterium Escherichia coli, Hefepilzen und anderen Organismen dar. Die Art B. licheniformis ist besonders für die Proteaseproduktion geeignet, während B. subtilis zusätzlich als Produktionswirt für die industrielle Herstellung von Wirk- und Zusatzstoffen wie Bacitracin und Riboflavin verwendet wird.
Das Genom beider Arten wurde vollständig sequenziert und ermöglicht die Analyse einzelner Gene und deren Funktionen. Um die Effizienz von industriellen Fermentationsprozessen zu erhöhen, können verschiedene genetische Modifikationen hilfreich sein. So kann beispielsweise die Deletion einzelner Gene bzw. Gencluster als auch die heterologe Expression bestimmter Gene zu einer Weiterentwicklung eines Produktionsstammes beitragen und die Vorteile mehrerer Stämme in einem vereinen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit beinhaltet u. a. die Erstellung eines optimierten Wirtssystems.
Im Mittelpunkt der dazu durchgeführten Untersuchungen zu B. subtilis standen verschiedene Enzyme des Acetoinstoffwechsels. Es konnte anhand der Überexpression der homologen Xylanase XynA gezeigt werden, dass die Deletion des Operons acoABCL in B. subtilis
6051HGW zu einer verbesserten Autoinduktion des acoA-Promotors führt. Durch einen alsDS-knock out hingegen wird diese verringert. Eine verbesserte Acetoinproduktion des Stammes B. subtilis 6051HGW konnte durch die Expression einer zweiten Kopie der Gene der beiden Untereinheiten einer Acetolactat-Synthase (IlvBH) erreicht werden. Zudem wurde während der stationären Phase ein verbessertes Wachstumsverhalten dieser Mutante auf Minimalmedium beobachtet.
Weiterhin wurde das Gen einer putativen Diacetyl-Reduktase aus dem Stamm B. subtilis TU-B-10 untersucht. Dieses Enzym könnte für die Reduktion des nichtenzymatisch entstandenen
Metaboliten Diacetyl zu Acetoin verantwortlich sein. Nach Integration des entsprechenden Gens in B. subtilis 6051HGW war jedoch keine erhöhte Acetoinkonzentration im Kulturüber-
stand zu messen.
B. subtilis 6051HGW LS8PD zeichnet sich u. a. durch seine 8-fache Proteasedefizienz aus. Anhand zweier Modellenzyme wurde die Eignung des Stammes als Expressionswirt heterologer Proteine untersucht. Mit Hilfe eines simulierten fed-batch-Verfahrens konnte das aus dem eukaryotischen Wirt S. cerevisiae stammende Gen sOx in B. subtilis 6051HGW LS8PD erfolgreich exprimiert und in den Überstand sekretiert werden. Nach Expression des Gens einer DnaseI aus Bos taurus konnte das entsprechende Protein extrazellulär dagegen nicht nachgewiesen werden.
Andere Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurden, beschäftigten sich mit dem Glyoxylatstoffwechsel von B. subtilis 6051HGW. Die Gene des
Glyoxylatzyklus sind nicht im Genom von B. subtilis enthalten. Werden sie aus B. licheniformis in B. subtilis6051HGW transferiert, kann der generierte Stamm B. subtilis ACE Überflussmetabolite wie Acetoin oder Acetat für das Wachstum nutzen. Dabei reichert sich jedoch extrazellulär der Metabolit Glycolat an, was möglicherweise zu einer Beeinträchtigung des Glyoxylatzyklus führen kann. Da die Akkumulation von Glycolat in B. licheniformis nicht erfolgt, wurde vermutet, dass die Aktivität der putativen Glyoxylat-Reduktase GyaR dafür verantwortlich ist.
Für weitere genetische Modifikationen von B. subtilis ACE war eine Neukonstruktion des Stammes erforderlich. Ein anschließender Transfer des Gens gyaR in B. subtilis konnte die extrazelluläre Glycolatkonzentration jedoch nicht senken. Auch die Deletion von gyaR in B. licheniformis
führte nicht zu höheren Konzentrationen dieses Metaboliten. Es kann geschlussfolgert werden, dass das untersuchte Gen gyaR nicht für eine Glyoxylat-Reduktase codiert.
Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit der Zellheterogenität von B. licheniformis P300. Das Auftreten von Subpopulationen in einer Bakterienkultur kann zu einem unterschiedlichen Verhalten der einzelnen Zellen und einer verringerten Gesamteffizienz in Produktions-
prozessen führen. In Zellkulturen des Stammes B. licheniformis P300 konnten verschiedene Subpopulationen identifiziert werden.
Um die genetische Zugänglichkeit zu optimieren, wurden verschiedene Untersuchungen zur natürlichen Kompetenz von B. licheniformis P300 durchgeführt. Zur Vereinheitlichung der
während der Kultivierung des Stammes auftretenden Subpopulationen wurden sigD- und sipW-tasA-yqxM-Deletionsmutanten erstellt. Zur Stammkonstruktion kam ein Verfahren zur Anwendung, das clean deletions im Genom erzeugte. Das Protokoll der Kolonie-PCR zur Identifizierung von potentiellen Deletanten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit optimiert.
Die generierten Mutanten zeigten im Gegensatz zum Wildtypstamm keine sigD-vermittelte Motilität und Chemotaxis sowie keine tasA-vermittelte Biofilmbildung. Nach Auftrennung der Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation wurden die auftretenden Banden mit denen des Wildtyps verglichen. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion von sigD zur Vereinheitlichung der Subpopulationen führt. Die generierte Mutante wies weiterhin ein verbessertes Wachstum
als der Wildtyp und einen veränderten Phänotyp auf, zeigte aber eine verringerte Effizienz bei der Transformation von DNA durch Elektroporation.
Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.