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Author

  • Gebhard, Simon (1)
  • Pöther, Dierk-Christoph (1)

Year of publication

  • 2012 (2) (remove)

Language

  • German (1)
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Keywords

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Institute

  • Abteilung fĂŒr Mikrobiologie und Molekularbiologie (1)
  • Institut fĂŒr Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin (1)

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Proceedings in the thiolome of low GC, Gram-positive bacteria (2012)
Pöther, Dierk-Christoph
Thiol or sulfhydryl groups are highly reactive functional groups in cellular systems. Molecules carrying thiol groups are mostly derivatives of the amino acid cysteine and are grouped as low molecular weight (LMW)-thiols: coenzyme A (CoA), glutathione (GSH) or bacillithiol (BSH). LMW-thiols can help in the maintenance of the reduced cellular environment as so called redox-buffers. Additionally, they act as co-factors in enzyme reactions or help in the detoxification of reactive oxygen or nitrogen species, electrophilic compounds or thiophilic metalloids (arsenite, tellurite). In proteins from different organisms cysteine is underrepresented compared to other amino acids, but still overtakes diverse roles. It is an important determinant in the tertiary and quaternary structure of proteins. The nucleophilic character of the thiol or thiolate group, respectively, makes cysteine the catalytically active amino acids of different enzymes. As a precursor cysteine participates in the formation of Fe-S clusters and coordinates different co-factors like heme, iron or zinc. The main goal of this study was the investigation of the different cellular thiol pools, now defined as the thiolome. The thiolome is the entity of the cellular thiol pools, i.e. LMW-thiols and protein thiols, and the dynamics between these pools. In Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus mixed disulfides between protein thiols and free LMW-thiols, so called S-thiolations, were identified in different proteins in response to the thiol specific reagent diamide. Some of these S-thiolations were located at catalytically active cysteine residues. Subsequent analysis of metabolites supports this: the S-thiolation of the cobalamine-independent methionine-synthase MetE led to a decrease of the cellular methionine content. Additionally, the conversion of threonine to different branched-chain amino acids (BCAAs) was disrupted by the S-thiolation of the branched-chain amino acid aminotransferase YwaA, thereby probably inducing the synthesis of ppGpp, the alarmon of the stringent response. In addition to the identification of S-thiolations a technique was established which allowed the discrimination between intra- and intermolecular disulfides. The non-reducing/ reducing diagonal gel electrophoresis was applied to B. subtilis and S. aureus and confirmed known existing disulfide bonds, e.g. in alkyl hydroperoxide reductase AhpC or the thiol peroxidase Tpx. In response to diamide an increase of specific disulfide bonds in different proteins was observed. The analysis of the LMW-thiol content by an HPLC-approach allowed the observation of the dynamics of the thiolome. In response to diamide the reduced LMW-thiol content decreased by 75%, reduced protein thiols by 60%. Collaborations with other working groups allowed the identification of BSH in this approach. Additionally, an unknown thiol was found that is likely a derivative of BSH. Screening of the LMW-thiol content of different S. aureus-strains under various growth conditions revealed that strains 8325-4 and SH1000 lack BSH. The lack of BSH was attributed to an 8 bp-duplication in the bshC-gene that encodes the last enzyme of the BSH-synthesis. BSH-production was restored by transducing plasmid-borne functional BshC from strain Newman into strains 8325-4 and SH1000. The reconstitution of the BSH-synthesis aided in the resistance to the antibiotic fosfomycin but did not increase the resistance to different oxidants (diamide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide). The production of BSH had also positive effects on the survival of S. aureus inside human bronchial epithelial cells and murine macrophages in phagocytosis assays. Additionally, a GSH-uptake was observed into S. aureus which has before been known as a GSH-free bacterium. Taken together, this thesis provides the first insights into both, the LMW-thiol- and protein thiol pool of low GC, Gram-positive bacteria under different conditions. A plethora of different methodologies was used to describe the thiolome. The bacterial thiolome is a sophisticated system which is tightly regulated, but also flexible enough to not rely on determined molecules like BSH. The influences of the thiolome are not restricted to its own system and regulation, but also affect different branches of cellular physiology like the metabolism of BCAAs.
VerÀnderungen im Proteom von Thrombozyten durch Bluthochdruck im Rattenmodell (2012)
Gebhard, Simon
Die chronische arterielle Hypertonie erhöht das Risiko fĂŒr kardiovaskulĂ€re Komplikationen wie Schlaganfall und Myokardinfarkt. In der Pathophysiologie dieser Komplikationen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle. Hierbei gehen die meisten Experten derzeit davon aus, dass Thrombozyten mit den durch die Hypertonie geschĂ€digten GefĂ€ĂŸwĂ€nden reagieren. Ziel unserer Untersuchungen war es, zu untersuchen, ob durch die Hypertonie auch VerĂ€nderungen in Thrombozyten entstehen. Thrombozyten zirkulieren im Kreislauf in engem Kontakt mit der GefĂ€ĂŸwand und reagieren sensibel auf hohe ScherkrĂ€fte und aktivierte Endothelzellen. Jede Aktivierung, auch in reversiblen FrĂŒhstadien fĂŒhrt dabei zu VerĂ€nderungen in der Proteinzusammensetzung der Thrombozyten, dem Proteom. Da sie keinen Kern haben, ist die Proteinneosynthese in Thrombozyten stark limitiert. So „speichern“ Thrombozyten Informationen ĂŒber ihre Aktivierungshistorie wĂ€hrend ihrer zehntĂ€gigen Überlebenszeit, da die verĂ€nderten Proteine nicht, oder nur sehr eingeschrĂ€nkt durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden. Proteomics bietet einen Ansatz, ĂŒber tausend Proteine gleichzeitig zu untersuchen. Mittels zweidimensionaler, differentieller in Gel Elektrophorese (2D-DIGE) kann dabei ein sensibler quantitativer Vergleich zweier Proben erfolgen. Die komplexe Methodik erfordert jedoch eine hochgradige Standardisierung der Versuchsgruppen. In diesem Projekt wurde daher ein Tiermodell verwendet, um die ca. 1000, mittels 2D-PAGE dargestellten Proteinspots des Thrombozytenzytosols auf hypertoniebedingte VerĂ€nderungen zu untersuchen. Dabei wurden zwei unterschiedliche Rattenmodelle der Hypertonie eingesetzt um die Aussagekraft zu erhöhen. Nach 14tĂ€giger Hypertoniephase wurden 45 Proteinspots detektiert, deren IntensitĂ€t in beiden Rattenmodellen signifikant verĂ€ndert war. Die Identifikation dieser Spots mittels Massenspektrometrie zeigte neben spezifischen Thrombozytenproteinen v.a. Zytoskelett- und Zytoskelett -assoziierte Proteine. Wurde an die 14tĂ€gige Hypertoniephase eine 10tĂ€gige Erholungsphase angeschlossen, waren diese VerĂ€nderungen nicht mehr nachweisbar. Überraschenderweise waren die beobachteten VerĂ€nderungen unterdrĂŒckbar durch mehrmalige Blutentnahme vor- und wĂ€hrend der Hypertoniephase. Dabei wurden 8 Tage vor-, sowie zweimal wĂ€hrend der Hypertoniephase (Tage 3 und 10) 3 ml Blut entnommen. Die daraufhin durchgefĂŒhrte Untersuchung auf VerĂ€nderungen des Thrombozytenproteoms durch Blutentnahmen an normotensiven Tieren zeigte ein Muster an VerĂ€nderungen, dass dem unter Hypertonie beobachteten entgegengesetzt war. Eine denkbare Ursache fĂŒr diese Beobachtung ist, dass die Thrombozytopoese durch die mehrmaligen Blutverluste gesteigert wurde. Die so vermehrt ausgeschĂŒtteten „jungen“ Thrombozyten zeigen ein inverses Proteommuster, gegenĂŒber den durch Hypertonie gestressten Thrombozyten. Um dieser Hypothese nachzugehen wurden Ratten mit dem Thrombopoetinrezeptoragonisten Romiplostim behandelt. Das Thrombozytenproteom von Ratten nach Stimulation der Thrombozytopoese Ă€hnelt dem von Ratten nach mehrmaligen Blutentnahmen. Dies unterstĂŒtzt unsere Hypothese, dass die durch Blutentnahmen bedingten ProteomverĂ€nderungen auf eine gesteigerte Thormobzytopoese zurĂŒckzufĂŒhren sind und damit auf das gesteigerte Vorkommen junger Thrombozyten im Blutkreislauf. VerĂ€nderungen des Thrombozytenproteoms, die in beiden Tiermodellen unter Hypertonie auftraten, können mit großer Sicherheit auf die Hypertonie zurĂŒckgefĂŒhrt werden. Zu beachten ist allerdings, dass beide Modelle auf einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS) basieren. Es kann also nicht differenziert werden, ob die VerĂ€nderungen durch die Hypertonie selbst oder durch das aktivierte RAAS verursacht wurden. Die Tiermodelle spiegeln somit nur eine Subgruppe der Hypertoniepatienten wider. Wir haben mit diesen Experimenten Thrombozyten-Proteine identifiziert, die sich durch einen erhöhten Blutdruck verĂ€ndern. Diese Proteine sind daher potentielle Kandidaten fĂŒr Biomarker, die eine Aussage ĂŒber den Blutdruckverlauf der zurĂŒckliegenden Tage ermöglichen. Solch ein Marker, Ă€hnlich dem HbA1c beim Diabetes mellitus, könnte die Hypertoniediagnostik erheblich erleichtern. FĂŒr die in dieser tierexperimentellen Studie identifizierten Proteine finden sich analoge Proteine in menschlichen Thrombozyten. Deren VerĂ€nderung durch Bluthochdruck sollte in Fall/Kontroll-Studien am Menschen untersucht werden. In ErgĂ€nzung zum im Journal of Hypertension veröffentlichten Artikel wird in der vorliegenden deutschen Zusammenfassung detaillierter auf die Methoden eingegangen. DarĂŒber hinaus werden zusĂ€tzliche Aspekte in der Diskussion angesprochen.
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