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Ziel der Arbeit war die Vervollständigung der molekulargenetischen Untersuchungen der indirekten und direkten genomischen Diagnostik bei Familien mit Hämophilie B und das Erfassen der Daten. Aus den Daten sollte eine Darstellung der Informativität und Sicherheit der klinischen, indirekten und direkten Diagnostik bei der Konduktorinnen- und pränatalen Diagnostik erfolgen. Allel- und Heterozygotenfrequenzen, evtl. vorhandene Kopplungsungleichgewichte und Rekombinationsereignisse polymorpher Restriktionsorte sollten für die deutsche Population ermittelt werden. In diesem Rahmen sollten auch Möglichkeiten und Grenzen der Heteroduplexmethode als kostengünstige Methode zum Mutationsscreening bzw. zum Nachweis bekannter Mutationen aufgezeigt werden. In ausgewählten Familien sollte der Mutationsursprung bestimmt und eventuell vorhandene Foundereffekte nachgewiesen werden. Für die Untersuchung standen 359 Probanden (hämostaseologisch bzw. klinisch voruntersuchte Indexpatienten mit HB sowie deren Familienangehörige) zur Verfügung.
Die Rolle von Sequenzvarianten im Cathepsin L als Risikofaktoren der chronischen Pankreatitis
(2016)
Die chronische Pankreatitis ist meist eine wiederkehrende Entzündung der Bauchspeicheldrüse mit intrapankreatischer Aktivierung der Verdauungsenzyme. Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (PSTI = SPINK1) finden sich häufig bei Patienten mit chronischer Pankreatitis. Die häufigste SPINK1 Mutation p.N34S ist aber auch bei 1-2 % der gesunden Normalbevölkerung nachweisbar. Experimentelle Daten belegen, dass das p.N34S mutierte Protein durch CTSL schneller degradiert wird. In dieser Arbeit wird untersucht, ob Mutationen im CTSL Gen das Risiko von p.N34S+ Individuen erhöhen, an einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse zu erkranken. Hierfür werden mittels TaqMan-Analyse die Probanden der SHIP-Studie (SHIP-0 n=4308, im Weiteren Kontrollen) und Individuen mit chronischer ideopathischer Pankreatitis (n=2299, im Weiteren Patienten) für N34S-Mutation in SPINK1 genotypisiert. Hiernach wird bei den p.N34S+ Individuen das CTSL mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung untersucht. Wir finden eine nichtsynonyme Mutation (c.5A>C, p.N2T), eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters (c.98delA, p.K33fs) und einen SNP c.-461C>A (rs3118869), für den eine Modifikation der Expression in anderem Zusammenhang publiziert ist. Die p.N2T Mutation wird bei einem Patienten und zwei Kontrollen nachgewiesen, die Verschiebung des Leserasters nur bei einem Patienten. Der SNP kann bei 42 Patienten und 46 Kontrollen nachgewiesen werden. Für keine der gefundenen Varianten zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der Verteilung. Auch in der Haplotypenanalyse kann kein signifikanter Verteilungsunterschied gezeigt werden. Ein Einfluss von CTSL Mutationen auf das Risiko an einer Pankreatitis zu erkranken, erscheint für Träger der p.N34S Mutation im SPINK1 Gen möglich, kann an dem untersuchten Kollektiv aber nicht bewiesen werden.
Molekular-epidemiologische Untersuchungen veterinärmedizinisch relevanter Pathogene beruhen auf der Auswertung und Einordnung verlässlicher und detailreicher Sequenzinformationen. In den letzten Jahren haben sich die Sequenziermethoden des sogenannten Next-Generation Sequencing (NGS) kontinuierlich weiterentwickelt, so dass nun Nukleinsäureproben unterschiedlichster Herkunft zur Volllängensequenzierung viraler Genome herangezogen werden können. Des Weiteren sind Metagenomanalysen möglich geworden, d.h. die Untersuchung der Zusammensetzung der Organismenpopulation in einer Probe durch Sequenzierung der gesamten Nukleinsäurepopulation. Letzteres erlaubt auch die Untersuchung viraler Varianten in einer Probe (Quasispeziesanalysen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden NGS-Methoden und Arbeitsabläufe zur Ausnutzung metagenomischer Datensätze optimiert, verfeinert und nachfolgend in praxisrelevanten Studien zu Lyssa- und Coronaviren erprobt. In einer ersten Studie zur Charakterisierung des neu entdeckten Bokeloh Fledermaus-Lyssavirus konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, akkurate Volllängensequenzinformationen direkt aus Zellkulturüberständen zu generieren, die nicht nur die mittels der klassischen Kettenabbruch-Synthese generierten Daten bestätigen, sondern darüber hinaus auch virale Varianten aufzeigen. Eine detaillierte, hochauflösende Variantenanalyse (Tiefensequenzierung) lag im Fokus einer weiteren Studie zu Lyssaviren. Hier wurden kommerzielle Oralimpfstoffe gegen die Tollwut und ihre Ausgangsvirusstämme hinsichtlich ihrer Quasispezieszusammensetzung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Tiefensequenzierung einen wichtigen Beitrag zur Qualitätskontrolle (Stammidentität und -stabilität) eines Lebendimpfstoffes liefern kann, der in den Lizensierungsprozess eingebunden werden könnte. Dabei ist die Analyse auf Ebene der viralen Gesamtpopulation der Auswertung auf Konsensusebene überlegen. Metagenomische Datensätze erlauben nicht nur die Analyse viraler Populationen, es sind auch Wirtsinformationen ableitbar. Die kombinierte Auswertung viraler und wirtsspezifischer Informationen erlaubte eine phylogeographische Studie zur genetischen Diversität arktischer Tollwutviren und ihrer Reservoirwirte. Die Methode konnte erfolgreich angewendet werden um zu zeigen, dass es zwar eine räumliche Populationsstruktur bei den untersuchten Polarfüchsen gibt, diese jedoch nicht mit unabhängigen Tollwutvirusvarianten assoziiert werden können. Neben den oben genannten Lyssavirusprojekten waren zwei Studien zum Virus der porzinen epidemischen Diarrhoe Teil der vorliegenden Arbeit. Metagenomische Datensätze wurden verwendet, um Volllängensequenzen abzuleiten und diese phylogenetischen Detailanalysen und Netzwerk-Untersuchungen zu unterziehen. Außerdem konnten die Datensätze verwendet werden, um virale und bakterielle Koinfektionen zu untersuchen, die möglicherweise einen Einfluss auf die Schwere der Erkrankung gehabt haben könnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass uns die optimierten NGS-Methoden in die Lage versetzen, metagenomische Datensätze zu nutzen, um nicht nur unverfälschte Volllängensequenzen für phylogenetische Detailanalysen zu generieren, sondern auch Quasispezies-Analysen durchzuführen sowie Wirts- und Virusfaktoren vergleichend zu untersuchen.
The virosphere comprises all known and unknown viruses in our ecosystems. Advanced sequencing technologies in combination with metagenomic analysis have become a key tool for exploring this global diversity of viruses. However, discovery of novel viruses and comparative analyses are often based on small sequence fragments or lack biological context, which restricts a proper classification. In this study advanced genomic methods were used that included comprehensive knowledge of viral genomes along with supporting biological metadata in order to identify and classify viruses at different levels of genetic relationships. In a first example, the genetic background of vaccine-induced rabies cases was revealed by analyzing and comparing the genetic diversity of viral populations. Furthermore, the fundament for a taxonomic reclassification of orthopoxviruses was established on basis of a wide scale genomic analysis. In addition, novel neurotropic mamastroviruses from sheep and cattle were classified as members of a single species that provided evidence of interspecies transmission. Finally, two putative novel species of alphaherpesviruses and orthopoxviruses were identified. These examples are based on field cases that provide substantial corresponding clinical metadata and information of host-pathogen interactions. The analyses, therefore, puts taxonomic classification into biological and epidemiological context, rather than addressing generic phylogenetic relationships. Furthermore, the presented work demonstrates that a universal approach for virus classification is neither feasible nor reasonable as analyses must be adjusted the nature of the addressed virus. All results with impact on the current taxonomic classification will be or are already reported to the International Committee on Taxonomy of Viruses. In conclusion, this thesis contributed to the classification concepts of viruses and expanded the knowledge of virosphere diversity.