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Als hochmaligner Tumor stellt das Neuroblastom ausgehend vom sympathischen Nervensystem den häufigsten soliden, extrakraniellen Tumor des Kindesalters dar. Aufgrund seiner heterogenen Charakteristik und teils höchst aggressiven Wachstums bedarf es besonders im Hinblick auf die hohe Rezidivrate von Hochrisikopatienten neuer innovativer Therapien, die einen langanhaltenden Anti-Tumoreffekt induzieren. Durch zunehmende Erkenntnisse auf dem Gebiet der Tumorimmunologie sind dabei besonders immuntherapeutische Behandlungsstrategien immer weiter in den Vordergrund gerückt. Diese führen zur spezifischen Aktivierung des körpereigenen Immunsystems verbunden mit der Erkennung und Eliminierung der Tumorzellen. In der Praxis ist eine wirksame Anwendung der aktiven Immuntherapie jedoch mit einigen Herausforderungen verbunden. Dazu gehören die Identifikation von geeigneten Tumorantigenen, die optimale Aufnahme, Prozessierung und Präsentation der Antigene durch Immunzellen sowie die Überwindung der Immuntoleranz zur Induktion zytotoxischer und Gedächtnis-T-Zellen. Auch die natürlichen Regulationsmechanismen sollten nicht außer Acht gelassen werden, da diese einerseits die anti-tumoralen Effekte einer resultierenden Immunantwort eindämmen können, jedoch andererseits gesundes Gewebe vor einer Autoimmunreaktion schützen. Ziel dieser Arbeit war es daher die bereits bekannte präklinische Wirksamkeit einer Tyrosinhydroxylase (TH)-gerichteten Immuntherapie gegen das Neuroblastom durch eine zusätzliche Immunstimulation mit dem Zytokin IL-15 und einer Immuncheckpoint-Blockade zu verbessern. Dafür wurde ein bicistronisches DNA-Vakzin generiert, welches sowohl für die cDNA der TH als auch die von IL-15 kodiert. Um dabei die Herstellung und MHC-I-vermittelte Präsentation antigener TH-Peptide, effektiv zu gestalten und die Immunigenität des Vakzins zu erhöhen, erfolgte die upstream-Kopplung einer modifizierten Ubiquitin-Sequenz an die der xenogenen TH. Die Integration der IL-15-Sequenz in das DNA-Vakzin ermöglicht eine auf die Mikroumgebung der Antigenpräsentation beschränkte lokale Applikation und kann so die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen unterstützen ohne systemische Zytokin-bedingte Nebenwirkungen zu verursachen. Nach der Generierung des Vakzins erfolgte die In-vitro-Charakterisierung durch Transfektion von CHO-Zellen mit dem DNA-Vakzin, wobei die Plasmid-vermittelte Synthese der ubiquitinierten TH und Freisetzung von bioaktivem IL-15 bestätigt wurden. Die Evaluierung der anti-tumoralen Eigenschaften in vivo erfolgte in einem syngenen Mausmodell, wobei attenuierte S. typhimurium SL7207 als orales Applikationsvehikel für das DNA-Vakzin dienten, die durch die Stimulierung des mukosalen Immunsystems dem DNA-Vakzin eine gesteigerte Immunogenität verleihen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der S. typhimurium-vermittelte Genransfer sowie die effektive Expression der im Vakzin enthaltenen Gene in den APC der Peyer Plaques nachgewiesen werden. Weiterhin konnten die durch zytotoxische T-Zellen vermittelte anti-tumoralen Effekte einer TH-basierten Immuntherapie, repräsentiert durch ein reduziertes Primärtumorwachstum sowie verminderter Metastasierung, durch die Ko-Expression von IL-15 in einem syngenen Mausmodell gesteigert werden. Interessanterweise führte die Immuncheckpoint-Blockade durch eine anti-PD-1-AK-Therapie sowohl mit als auch ohne Kombination mit dem DNA-Vakzin zu einem signifikanten Anstieg der anti-tumoralen Effekte. Dieses Ergebnis unterstreicht die nachteilige Rolle immunregulatorischer Mechanismen bei der Ausbildung einer zellulären Immunantwort durch eine Immuntherapie, was ergänzend durch den Nachweis immunsuppressiver Zytokine in der Tumormikroumgebung bestätigt wurde. Bei der Anwendung von Behandlungsstrategien zur aktiven Immunisierung ist daher die Blockierung der natürlichen Regulationsmechanismen sowie der tumor-induzierten Immunsuppression von enormer Bedeutung. Zusammenfassend war das in dieser Arbeit generierte xenogene DNA-Vakzin in der Lage durch die Ko-Expression von IL-15 die NB-spezifischen Effekte der TH-gerichteten Immuntherapie zu steigern. Des Weiteren konnten mittels einer anti-PD-1-gerichteten Immuncheckpoint-Blockade immunregulatorische Prozesse unterbunden und dadurch die CTL-vermittelten anti-tumoralen Effekte der Target-gerichteten DNA-Vakzinierung verstärkt werden. Gerade bei schwach immunogenen Tumoren wie dem Neuroblastom sind Kombinationstherapien notwendig, welche eine TAA-gerichtet Immunantwort zur Induktion eines Immunologischen Gedächtnisses in Gang bringen und gleichzeitg die Regulationsmechanismen unterbinden, um so eine effektive Tumorbekämpfung zu ermöglichen. Diese vielversprechende Vakzinierungsstrategie könnte somit neuer immunologischer Ansatz für eine adjuvante Erhaltungstherapie für eine minimale Resterkrankung bei refraktären Neuroblastompatienten darstellen.

Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmethoden sind im Laufe der letzten Jahrzehnte zu einem unverzichtbaren Hilfsmittel in der Entwicklung von innovativen und generischen oralen Formulierungen geworden. Sie dienen in einer frühen Phase der Produktentwicklung u.a. zur Selektion von geeigneten Formulierungskandidaten im Vorfeld von Bioverfügbarkeits- und Bioäquivalenzuntersuchungen. Mithilfe biorelevanter Freisetzungsmethoden sollen dabei der menschliche Gastrointestinaltrakt (GIT) oder Teile davon simuliert werden, um somit Aussagen zum In-vivo-Freisetzungsverhalten der untersuchten Formulierung treffen zu können. Im Zuge der Entwicklung biorelevanter In-vitro-Testmethoden lag der Fokus bisher vorrangig in der Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden Erwachsenen. Inter- und intraindividuelle Unterschiede und andere Faktoren, die das Freisetzungsverhalten im GIT beeinflussen können, wie beispielsweise das Alter des Patienten oder zusätzliche Erkrankungen, blieben hingegen größtenteils unberücksichtigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten daher individualisierte In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt werden, welche die In-vivo-Variabilität des gastrointestinalen Transitverhaltens von Darreichungsformen und die variablen pH-Bedingungen des GIT nach Nüchterneinnahme widerspiegeln sollen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Modelle sollte es demnach möglich sein, die Robustheit des Freisetzungsverhaltens von modifiziert freisetzenden Arzneiformen gegenüber inter- und intraindividuellen Unterschieden im Passageverhalten und den vorherrschenden pH-Bedingungen zu untersuchen. Am Beispiel von magensaftresistenten Acetylsalicylsäure (ASS)-Formulierungen wurde zunächst im Rahmen eines systematischen Screenings der Einfluss der Zusammensetzung des Freisetzungsmediums auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem Vergleich phosphatgepufferter Medien mit dem physiologisch für den nüchternen Dünndarm relevanten Kohlensäure (H2CO3)/Hydrogencarbonat (HCO3-)-Puffersystem. Auf Basis von Literaturdaten zur Elektrolytzusammensetzung der intestinalen Flüssigkeiten wurde als Resultat des systematischen Screenings mit Carbonate-based Fasted State Simulated Intestinal Fluid (CarbFaSSIF) ein Freisetzungsmedium entwickelt, welches die Elektrolytzusammensetzung der luminalen Flüssigkeiten des nüchternen Dünndarms widerspiegelt und auf dem H2CO3/HCO3--Puffersystem basiert. Der Einsatz eines automatischen pH-Regulationssystem (pHysio-grad®) zur Stabilisierung von thermodynamisch instabilen HCO3--basierten Freisetzungsmedien ermöglichte es, mit CarbFaSSIF dynamische intestinale pH- und Transitprofile in hoher zeitlicher Auflösung in einer kompendialen Blattrührerapparatur zu simulieren. Am Beispiel von magensaftresistenten Mesalazin- und Natriumvalproatformulierungen wurde die Robustheit des Freisetzungsverhaltens gegenüber der Variabilität gastrointestinaler pH- und Passagebedingungen untersucht. Mit dem lokal im GIT wirkenden Mesalazin und dem systemisch wirkenden Natriumvalproat wurden zwei Arzneistoffe mit unterschiedlichen Wirkprinzipien ausgewählt, die aufgrund eines individuell variablen Freisetzungsverhaltens zu teils schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen oder zu einem Therapieversagen führen könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden beispielhaft individuelle pH- und Transit-Bedingungen von vier individuellen Probanden einer in der Literatur beschriebenen In-vivo-Studie für die In-vitro-Simulationen ausgewählt, welche einerseits den Durchschnitt der In-vivo-Studie widerspiegelten, aber auch extreme Passage- und pH-Bedingungen aufwiesen. Die untersuchten Formulierungen zeigten abhängig von der Art der magensaftresistenten Überzüge eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber den individuellen simulierten pH- und Transit-Profilen. Für die Mesalazinformulierungen war es möglich, den Ort und das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung, die für eine erfolgreiche Therapie ausschlaggebend sind, in individuellen Probanden in vitro zu bestimmen. Im Gegensatz zu den lokal im GIT wirkenden Mesalazinformulierungen sind für die antiepileptische Therapie mit magensaftresistenten Natriumvalproatformulierungen neben dem Ausmaß insbesondere der Zeitpunkt der Wirkstofffreisetzung für konstante Plasmaspiegel von entscheidender Bedeutung. Darauf basierend wurden unter Verwendung der ermittelten Freisetzungsdaten und mithilfe von individuellen pharmakokinetischen Parametern für die natriumvalproathaltigen Darreichungsformen In-silico-Simulationen mit einem neuen Simulationsprogramm (BioavailabilityDesign expert) zur Vorhersage von Natriumvalproatplasmaprofilen durchgeführt. Die ermittelten In-silico-Plasmaprofile wurden dabei mit dem mathematischen Verfahren des durchschnittlichen Euklidischen Abstands mit In-vivo-Daten aus der Literatur verglichen, um die In-vivo-Vorhersagekraft des Freisetzungsmodells beurteilen zu können. Abhängig von der Art des magensaftresistenten Überzugs und dem daraus resultierenden unterschiedlichen Ansprechen auf die Bedingungen der In-vitro-Freisetzungstests konnten für zwei der drei untersuchten Natriumvalproatformulierungen vielversprechende Vorhersagen zu den resultierenden Plasmaspiegeln getroffen werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit lag in der Implementierung des pHysio-grad®-Systems und der neu entwickelten HCO3--basierten Medien in prädiktiven Freisetzungstestmethoden für pädiatrische Darreichungsformen. Um vor allem das im GIT von Kindern, insbesondere bei Neugeborenen und Kleinkindern, im Vergleich zum Erwachsenen für die Wirkstofffreisetzung zur Verfügung stehende geringere Flüssigkeitsvolumen in einem In-vitro-Test hinreichend wiedergeben zu können, wurde für diesen Zweck eine neue Freisetzungsapparatur entwickelt. Das konstruierte System basierte auf standardisierten Prüfgefäßen und ermöglichte Freisetzungsuntersuchungen in einem Volumen von 30 bis 110 mL. Durch die Einbindung von miniaturisierten Komponenten des pHysio-grad®-Systems konnten zur Simulation der intestinalen Bedingungen von Kindern unterschiedlicher Altersgruppen auch physiologisch-relevante HCO3--Medien eingesetzt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass individualisierte Freisetzungsmethoden basierend auf physiologischen HCO3--Medien einen vielversprechenden Ansatz zur Beurteilung der Robustheit der Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Arzneiformen hinsichtlich der Variabilität von gastrointestinalen Transit und pH-Bedingungen darstellen. Darüber hinaus wurde mit einem Freisetzungsmodell für pädiatrische Arzneiformen ein erster Ansatz entwickelt, um die Besonderheiten, die mit der Arzneimittelapplikation an Kindern in Verbindung stehen, in einem In-vitro-Maßstab wiederzugeben. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten In-Vitro-Methoden basieren auf physiologischen Daten von gesunden erwachsenen Probanden, stellen aber eine universelle Plattform dar, die perspektivisch auch zur Simulation von individuellen Patienten eingesetzt werden kann. Die neu konzipierten Freisetzungsmodelle würden daher zukünftig sehr von systematischen In-vivo-Studien an Patienten profitieren, die Einflussfaktoren, wie Alter oder Erkrankungen, auf die Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten und das gastrointestinale Passageverhalten von Arzneiformen untersuchen.

Neuroblastoma (NB) is an aggressive, poorly immunogenic tumor in childhood. Therapy for high-risk NB remains challenging. Immunotherapy with anti-GD 2 antibody ch14.18/CHO effectively prolongs the survival of NB patients. Killer-immunoglobulin-like receptor (KIR)/human leucocyte antigen (HLA) mismatch and Fc gamma receptor (FCGR) polymorphisms are reported to affect antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) induced by monoclonal antibodies. To determine whether FCGR polymorphisms and KIR/HLA mismatch are associated with the survival following ch14.18-based immunotherapy, genotyping methods that allow for genotype determination of FCGR2A, -3A, -3B, KIR2DL1, 2DL2, 2DL3, and 3DL1 have been established and applied to the analysis of 53 NB patients treated with ch14.18/CHO. High-affinity polymorphisms of FCGR2A (H131) and FCGR3A (V158) were associated with improved survival. Importantly, patients displaying both the FCGR3A-V158 and FCGR2A-H131 alleles exhibited significantly improved event-free survival. No association was found between KIR/HLA genotypes or FCGR3B alleles and patients’ survival in our patient cohort. In conclusion, impact of FCGR2A and -3A genotypes in response to ch14.18/CHO immunotherapy in combination with IL2 was demonstrated. FCGR2A and -3A might therefore provide a prognostic marker when conducting ch14.18/CHO-based immunotherapy.

Steptococcus pneumoniae (pneumococcus) represents a common colonizer of the human upper respiratory tract (URT). However, under certain conditions, for example following viral infections, or in indiciduals with a weakened immune system, including young children, elderly and immunocompromised persons, it can cause a wide range of life-threatening diseases, such as pneumonia, meningitis or sepsis. Based on the polysaccharide capsule that surrounds the bacterium, pneumococci are classified into so far 98 different serotypes. Prevention of S. pneumoniae infections was achieved by the development of pneumococcal polysaccharide-based (PPSV) vaccines. However, these vaccines have important limitations, including high manufacturing costs and restricted serotype coverage facilitating replacement by non-vaccine serotypes. Aiming for the development of a serotype-independent vaccine, the potential of surface-exposed and highly conserved pneumococcal lipoproteins was evaluated for being targeted as a future protein-based vaccine. Therefore, selected lipoproteins were examined i) for their surface abundance and accessibility, ii) for their presence in clinically relevant S. pneumoniae strains, and iii) for their immunogenicity. Finally, based on these initial screenings, the most promising candidates were selected to analyze their protective efficacy in a moude model of colonization. DacB and PnrA were identified as highly abundant lipoproteins on the pneumococcal surface. They showed to be immunogenic both during natural infection using convalescent patient sera and when given to mice as a subunit vaccine formulation. Following intranasal immunization and challenge of mice with two heterologous S. pneumoniae strains, both proteins reduced the pneumococcal load in the nasopharynx. The protection correlated with increased production of IL-17A indicative for a Th17-mediated immunity, which is strongly suggested to play a critical role in preventing pneumococcal colonization and infection. Lipoproteins are triggering innate receptors on antigen-presenting cells, thereby linking innate with adaptive immune responses. Therefore, lipidated proteins were evaluated for their potential to be used as an adjuvant for vaccination. Lipidation clearly enhanced humoral immune responses to DacB and PnrA without the need of an additional adjuvant. However, an additional adjuvant was required to confer protection against pneumococcal colonization. In conclusion, Lipoproteins are interesting candidates for future protein-based vaccine strategies because they are highly conserved, abundant and immunogenic. PnrA and DacB were identified as potential candidates, since they induced protection against pneumococcal colonization, which in turn may lead to a decline in infections and transmission.

β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von großem Interesse insbesondere für die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungsverfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringfügig untersucht worden und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib noch nicht in großtechnischem Maßstab eingesetzt. Wünschenswert ist die Etablierung einer Synthese, welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden Enantiomere jeweils die höhere biologische Wirksamkeit aufweisen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen für β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase. Zunächst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale Analytik für die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch für 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss über die Konzentration und den Enantiomerenüberschuss gab. Die vier zur Verfügung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivitäten in einem photometrischen NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von ca. 150 Amintransaminasen wurde bezüglich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden für Pregabalin sechs und für Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Umsätze bis zu 90% bei 99%ee (R) mit IMAC-gereinigter 3FCR_5M erzielt werden. Um Kosten für ein späteres großtechnisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion ebenfalls für den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass geringere Enantiomerenüberschüsse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der Substratverbrauch höher als die Produktbildung war. Als mögliche Ursachen wurden der Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivität durch die veränderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gewünschten Substrat-Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Phänomen konnte durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung jedoch erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden. Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine höhere Substratkonzentration nicht einen proportional höheren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzymlösung gesteigert werden, sodass ein Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe erfordern würde. Praktikabel wäre einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erhöhung der Enzymstabilität durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR_5M im größeren Maßstab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von 30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivität im Vergleich zur Expression im Schüttelkolben erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage für die Transaminase-vermittelte Synthese von (R)-Baclofen geschaffen wurde. In zukünftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in großem Maßstab im Fokus stehen.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Verknüpfung von Moderatoren des Akkulturationsprozesses und psychischer Gesundheit auf Grundlage des Modells von Berry. Im Vordergrund steht die grundsätzliche Frage, wie sich die Moderatoren auf die psychische Verfassung des Migranten auswirken am Beispiel von Spätaussiedlern in Mecklenburg-Vorpommern. Durchgeführt wurde eine Querschnittsstudie per zweisprachigem Fragebogen. Es kamen die Module Brief Symptom Inventory-53, Gießener Beschwerdebogen-24, Trierer Inventar zum chronischen Stress-12 und die Leipziger Kurzskala des Sense of Coherence Scale (SOC-9) zum Einsatz. Die befragten Spätaussiedler weisen im Durchschnitt in vielen Skalen überwertige Belastungen auf. Höhere Werte an Integration korrelieren positiv mit höheren Skalenwerten der psychischen Gesundheit. Die Betrachtung der Akkulturationsstrategien unter den Spätaussiedlern zeigte die Strategie der Integration als die am häufigsten gewählte, am stärksten war jedoch die Marginalisierung mit psychischer Gesundheit assoziiert. Insbesondere die gefundenen Zusammenhänge zwischen beruflicher Integration und Parametern der psychischen Gesundheit sind bemerkenswert. Denkbar wäre, dass das Gewähren einer Präferenz für eine der beiden Kulturen zu einer psychischen Dysbalance führt. Insbesondere im Bereich der Akkulturationsstrategien von Spätaussiedlern sieht der Autor weiteren Forschungsbedarf.

Das gram-negative Stäbchenbakterium Burkholderia pseudomallei, Erreger der Melioidose, ist ein fakultativ intrazelluläres Pathogen. Ein detailliertes Wissen über das Proteom dieses Pathogens liefert eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Pathomechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden detailierte „reference maps“ des intra- und extrazellulären Proteoms von B. pseudomallei Stamm E8 erstellt. Es wurden hierbei insgesamt 353 intrazelluläre und 154 extrazelluläre Proteine identifiziert und anschließend einer funktionellen Klassifizierung unterzogen. Die „reference maps“ stellen ein wichtiges Werkzeug für weitere vergleichende Proteomanalysen dar. In weiterführenden Experimenten wurde das Proteom dreier Wildtypstämme verglichen. Hierbei zeigten sich insgesamt nur geringe Unterschiede zwischen den drei analysierten Stämmen E8, E212 und K96423. Die Proteomanalysen bestätigten die Ergebnisse der Genotypisierung – beide Ansätze ergaben eine engere Verwandtschaft der Stämme E212 und K96423 als mit Stamm E8. Im Infektionsverlauf von B. pseudomallei ist das sonst aerob lebende Bakterium in der Lage sich auch unter anaroben Bedingungen auszubreiten. Über die anaerobe Physiologie von B. pseudomallei ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein Screeningsystem entwickelt werden, mit dem aus insgesamt 2344 Transposonmutanten 16 Mutanten mit reduziertem Wachtum unter anaeroben Bedingungen identifiziert wurden. Die vier Mutanten mit dem am stärksten verringerten Wachstum wurden für weitere Analysen im Rahmen dieser Arbeit ausgewählt. Drei der Mutanten hatten Molybdän bezogene Gendefekte und bei einer Mutante betraf der Gendefekt eine putative Sensor-Kinase. Die untersuchten Mutanten konnten erfolgreich komplementiert werden und somit polare Effekte ausgeschlossen werden. Die Komplentanten wiesen wieder dem Wildtyp entsprechendes anaerobes Wachstum auf und wiesen auch bei allen weiteren Experimenten, wie z.B. Infektionsversuchen, die Eigenschaften des Wildtyps auf. Dass unter den 2344 gescreenten Transposon Mutanten drei der vier auffälligsten Mutanten Molybdän bezogene Gendefekte aufwiesen, unterstreicht die Wichtigkeit von Molybdän und im Zusammenhang damit der anaeroben Nitratreduktase. Die Attenuierung der drei Mutanten im C57BL/6-Maus-Infektionsmodell deutet auf die Wichtigkeit des anaeroben Stoffwechsels bei chronischen Infektionsverläufen von B. pseudomallei hin. Bei der weiteren näher untersuchten Mutante liegt ein Defekt einer putativen Sensorkinase vor. Diese gehört zu einem Zwei-KomponentenSignaltransduktionssystem, welches Homologien zum RegB-RegA-System aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchte Sensorkinase einen entscheidenen Einfluss auf die Virulenz von B. pseudomallei hat. Der exakte Mechanismus der Attenuierung durch die Mutation von BPSL0201 bleibt vorerst jedoch noch ungeklärt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem hier entwickelten Screeningsystem erfolgreich Transposonmutanten identifiziert werden konnten, welche ein reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen aufweisen. Durch die anschließende Charakterisierung konnten tiefere Einblicke in den anaeroben Lebensstil von B. pseudomallei gewonnen werden. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei und der vollen Virulenz hin. Die gewonnenen Erkenntnisse stimulieren weitere Untersuchungen im Hinblick auf den Einfluss des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei bei der Pathogenese der Melioidose.

Species persistence in the face of rapidly progressing environmental change requires adaptive responses that allow organisms to either cope with the novel conditions in their habitat or to follow their environmental niche in space. A poleward range shift due to global warming induced habitat loss in the south has been predicted for the lesser horseshoe bat, Rhinolophus hipposideros. Theoretical as well as numerous empirical studies link range expansion success to increased dispersal and reproduction rates due to spatial sorting and r-selection resulting from low population densities at the expansion front. R. hipposideros females however are highly philopatric and the species’ life history reflects a K- rather than an r-strategy, encompassing a long life span and limited individual annual reproductive output. I therefore investigated if adaptations in these traits determining range expansion success (dispersal and reproduction) can be observed in this bat species of high conservation concern. Genetic diversity presents a critical factor for adaptive responses to global change, both for range expansion and for coping with novel environmental conditions. I hence explored the genetic diversity levels of European R. hipposideros leading edge populations and their drivers for an assessment of these populations’ evolutionary potential and the development of conservation recommendations. Comparing range expansion traits between an expanding R. hipposideros metapopulation in Germany and a non-expanding one in France revealed that range expansion was associated with an increase in juvenile survival and fecundity, and no decrease in adult survival. These results demonstrate than an increase in reproduction and growth rates is generally possible in R. hipposideros, indicating a potential adaptation (sensu lato) to range expansion. A positive correlation between adult and juvenile survival in the expanding metapopulation suggests higher resource acquisition in the expanding metapopulation, giving rise to the question if the observed demographic changes have a genetic basis or if they are rather induced by differences in environmental conditions between the two metapopulations. Long-term range expansion success requires adaptive evolutionary changes. The relative contribution of the former and that of undirected changes resulting e.g. from differences in resource availability therefore will have to be investigated in more detail in the future to allow predictions about range expansion dynamics in R. hipposideros. The number of individuals within a radius of approximately 60 to 90 km around a population (as a measure of connectivity) was identified as the main positive driver of the studied populations’ genetic diversity. Overall genetic diversity levels in German R. hipposideros populations were found to be reduced compared to populations in France as a legacy of demographic bottlenecks resulting from severe population declines in the mid-20th century. This finding is alarming as future range expansion can be expected to entail a further decrease in genetic diversity. The resulting loss of genetic diversity can be expected to be particularly strong in R. hipposideros due to the detected dependence of genetic diversity on connectivity, because range expansion often results in small and patchy populations. Protecting and ideally re-installing genetic diversity in R. hipposideros leading edge populations therefore presents a conservation goal of utmost importance. To achieve this endeavour, conservation efforts should target the protection of extensive networks of well-connected populations. Geographical concentration of individuals should be avoided and populations in key locations that connect clusters must be protected particularly well to prevent populations from becoming isolated. Continuous, regular monitoring of population trends is also important for a quick registration of disturbances or threats, and the subsequent rapid development of countermeasures to preclude further demographic declines. The reduced levels of genetic diversity in the German metapopulation precluded a reliable quantification of dispersal rates due to the reduced power of discrimination between individuals. While ongoing re-colonization and the establishment of new maternity colonies provide evidence for increased dispersal in the expanding metapopulation, evaluating the expected range expansion velocity of R. hipposideros in relation to the estimated velocity of global warming induced habitat loss will require the confirmation of the existing preliminary dispersal data by employing more genetic markers.

Die Bedeutung der Einschätzung von Interaktionen verschiedener Medikamente und der hiermit potentiell einhergehenden Nebenwirkungen nehmen aufgrund der stetigen Entwicklung neuer medikamentöser Therapieansätze und der hierdurch bedingt vermehrt auftretenden Polypharmazie kontinuierlich zu. Die Grundlage für das Verständnis dieser Interaktionen bilden die Pharmakokinetik und die Pharmakodynamik. Wichtige Einflussfaktoren im Hinblick auf die Regulation dieser beiden Prozesse sind die nukleären Rezeptoren CAR und PXR, die als ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren entsprechend der anfallenden Metaboliten den Metabolismus mitbestimmen. Ein bekannter Induktor von CAR mit seinen Zielgenen in der Pharmakokinetik ist Efavirenz – ein wichtiger Bestandteil der HIV- Therapie. Hierauf basierend wurde in einer klinischen Studie mit 12 Probanden u.a. Gewebe (PBMCs und Intestinum) unter der kontrollierten Gabe von Efavirenz mit Ezetimib untersucht. Letzteres Medikament wurde zum einen als Parameter für den Metabolismus der zahlreichen Zielgene von CAR und zum anderen als eine mögliche Option zur Behandlung der Dyslipidämie – der Entstehung einer Dysbalance als vermeintliche Nebenwirkung von Efavirenz – eingesetzt. Diese klinische Studie ergab, dass Efavirenz keine Regulation im Intestinum auf die mRNA bewirken konnte, jedoch vereinzelt Induktionen auf Proteinebene. Im Modell der Caco2-Zellen ließ sich prinzipiell nach Exposition von Efavirenz eine Induktion feststellen. Auch im Kompartiment der PBMCs ließ sich generell – innerhalb der Studie und auch in vitro– eine Induktion detektieren. Dabei konnte jedoch weder eine relevante pharmakokinetische noch eine pharmakodynamische Interaktion zwischen Efavirenz und Ezetimib eindeutig nachgewiesen werden. Insgesamt scheinen gleiche Zielgene von CAR abhängig vom Kompartiment regulationsfähig zu sein. Ob letztendlich die Distribution von Efavirenz über die Induktion oder auch das Kompartiment und dessen Umstände an sich die Induktion beeinflussen bleibt offen. Die Feststellung grundlegender Schlussfolgerungen ist somit aufgrund der derzeit noch unklaren Confounder noch nicht möglich, weshalb weitere komplementäre Forschungsvorhaben erforderlich sind, um zusätzliche Erkenntnisse zu erzielen.

Die Dichte von medizinischen Versorgungseinrichtungen und Leistungserbringern ist in ländlichen Räumen gering. Zu überwindende Distanzen können aufgrund dessen groß sein. Die Einwohner peripherer Räume sind jedoch oft älter, haben ein höheres Morbiditätsrisiko und einen größeren Bedarf an medizinischer Versorgung. Dazu kommen mit dem Alter zunehmenden Mobilitätseinschränkungen. Obwohl der motorisierte Individualverkehr in ländlichen Räumen dominiert, ist auch die Erreichbarkeit durch den öffentlichen Personennahverkehr (ÖPNV) wichtig, da gerade ältere Menschen seltener ein Auto besitzen. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Pkw- und ÖPNV-Erreichbarkeit von Hausärzten (Allgemeinmediziner und hausärztliche Internisten), Augenärzten, fachärztlichen Internisten und Urologen im Landkreis Vorpommern-Greifswald sowie die Analyse wie viele Einwohner von guter bzw. schlechter Erreichbarkeit betroffen sind und ob eine längere Fahrzeit mittels Pkw und ÖPNV einen Einfluss auf die Inanspruchnahme von Hausärzten bzw. Frauenärzten in Vorpommern hat. Die Erreichbarkeitsanalysen für diese Vorhaben wurden in einem Geografischen Informationssystem (GIS) mittels Netzwerkanalysen auf der Basis von digitalen routingfähigen Straßendaten mit der Software ESRIArcGIS 10.0 Esri Inc., Redlands/California (USA) durchgeführt. Für die ÖPNV-Erreichbarkeit wurde zusätzlich ein Model verwendet, dass auf der Implementation des Dijkstra Algorithmus‘ die Fahrpläne der regionalen Verkehrsbetriebe einliest und Routen zu den nächstgelegenen medizinischen Leistungserbringern berechnet. Unterschiede zwischen den Arztgruppen wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test bestimmt. Die Daten zur Inanspruchnahme stammen aus der Study of Health in Pomerania (SHIP) aus dem 5-Jahres-Follow-Up SHIP-1. Determinanten für die Inanspruchnahme wurden mit multiplen logistischen Regressionen ermittelt. Für die statistischen Berechnungen wurde die Software SAS 9.3 © 2002-2010 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) verwendet. Die Pkw-Fahrzeit zum Hausarzt beträgt maximal 23 Minuten, während die ausgewählten spezialisierten Fachärzte in maximal 43 Minuten erreicht werden. 80 % der Bevölkerung erreicht den Arzt jedoch innerhalb von 20 Minuten. Die ÖPNV-Fahrzeit (hier Hin- und Rückfahrt) beträgt durchschnittlich 100 Minuten zum Hausarzt und zwischen 130 und 160 Minuten zum ausgewählten spezialisierten Facharzt. 4 – 7 % der Bevölkerung hat keine Verbindung (Hin- und Rückfahrt) mit dem ÖPNV zum Hausarzt bzw. Facharzt. Die Unterschiede zwischen Haus- und Fachärzten sind statistisch signifikant. Bezüglich des Einflusses der Erreichbarkeit auf die Inanspruchnahme hat sich gezeigt, dass die Erreichbarkeit keinen signifikanten Einfluss hat, wenngleich ein Trend zur geringeren Inanspruchnahme bei größeren Entfernungen erkennbar ist. Für die Inanspruchnahme der Frauenärzte sind jedoch das Alter, der Sozialschichtindex und Personen im Haushalt ≥ 18 Jahre (potentielle Mitfahrgelegenheiten) statistisch signifikante Determinanten. Eine gute ÖPNV-Erreichbarkeit ist nicht nur eine Frage der Distanz, sondern vor allem der Anbindung. Mithilfe von Erreichbarkeitsanalysen lassen sich Räume identifizieren, die einen schlechteren räumlichen Zugang zur Versorgung haben, weshalb Erreichbarkeitsanalysen in Planungsprozessen im Gesundheitsbereich grundsätzlich Anwendung finden sollten. Eine geringere Inanspruchnahme ist in Vorpommern nicht signifikant mit schlechterer Erreichbarkeit im Sinne von längeren Fahrzeiten assoziiert. Wichtiger ist, dass es überhaupt eine Verkehrsanbindung gibt, z.B. durch Mitfahrmöglichkeiten.

Kieferorthopädische Behandlungen mit individell gefertigten aktiven Elementen führen zu besseren Behandlungsergebnissen in kürzerer Behandlungszeit bei gleichzeitig geringeren Nebenwirkungen. Mit CAD-Programmen und FE-Simulationen werden individuelle kieferorthopädische Elemente entworfen, die schnell und kostengünstig durch die RapidPrototyping-Technologie und speziell den 3D-Druck produziert werden können. Diese Studie zeigt dabei, dass es möglich ist, Objekte z. B. in Form von Federn und Bögen mit vorberechneter Kraftentfaltung zu planen und zu drucken. Die Druckparameter und die Parameter der gewählten Simulation sind entscheidend für die Qualität und die Eigenschaften des gedruckten Objektes. In dieser Studie wurden zwei verschiedene Versuchsaufbauten entwickelt, welche die Kraftentfaltung der Elemente mit einem Gelsensor bzw. mit einer Wägezelle gemessen hat. Es wurden Versuchsobjekte im Design eines Expansionsbogens aus den Materialien PLA und PETG sowie Zugfedern/Elastikketten aus den Materialen TPU und Filaflex mit 3D-Druckern produziert. Es wurde festgestellt, das Gelsensoren infolge fehlender Konstanz zur Messung von Kräften in der Zahnmedizin ungeeignet sind, während sich Wägezellen als geeignet erwiesen haben. Geplante/simulierte Kraftentwicklungen korrelierten mit r=0,995 bzw r=0,998 nach Pearson signifikant zu den Kraftentwicklungen von gedruckten Expansionsbögen aus den Materialien PLA und PETG. Weiterhin wurde für elastische Ketten/Federn aus TPU eine signifikante Korrelation mit r=0,980 von simulierter zu gemessener Kraft nachgewiesen. Das Material TPU war geeignet zur individuellen Produktion von elastischen Zugfedern als Ergänzung zu konventionellen elastischen Ketten, deren Kräfte nicht exakt planbar sind. Die Experimente zeigten, dass Langzeitbelastung und Aufbewahrung in Wasser zu geringen Kraftverlusten der TPU-Federn führten. Es wurde das Potential der Rapid-Prototyping-Technologie kombiniert mit FE-Simulationen veranschaulicht. Die ständige Weiterentwicklung dieser Technologie ermöglicht schnell und kostengünstig individuelle Behandlungselemente zu produzieren bei geringerer Nebenwirkungsrate, so dass diese Technik in der Kieferorthopädie zunehmend wichtig wird.

Ziel: Aussagen zur Scherhaftfestigkeit und Torsionsstabilität 3D-gedruckter Polymethacrylat-Brackets mit makroretentiver bzw. mikroretentiver Basis im Vergleich zu konventionell hergestellten Kunststoff-Brackets. Material und Methode: Die mit der Software FreeCad 0,16 (freecadweb.org) konstruierten Brackets (Standard Edgewise-Bracket mit 22 inch Slotgröße, Torque 0°, und Tip 0°) wurden im DLP-Verfahren aus einem medizinisch zugelassenen Polymethacrylat (SHERAprint ortho Plus, SHERA, Lemförde) 3D-gedruckt. Die Nachhärtung erfolgte in zwei Zyklen unter Stickstoff Schutzatmosphäre (1,5bar, je 3000 Blitze, 10/sec, 200 Watt, 280 bis 580nm) (Otoflash G171, NK Optik, Baierbrunn) nach einer Reinigung im Ultraschallbad (2 x 2min, 90% Ethanol). Zur Untersuchung der Scherhaftfestigkeit wurden bei 40 dieser Brackets Retentionsrillen in die Basis konstruiert (Makroretention). Weitere 40 Brackets erhielten eine glatte Bracketbasis, die 3 Sekunden lang mit Aluminiumoxidkristallen sandgestrahlt wurde (Mikroretention). Als Kontrollgruppe dienten konventionelle Kunststoffbrackets vergleichbarer Größe (Brilliant, Forestadent, Pforzheim). Die Brackets aller drei Versuchsgruppen wurden im Standard-etch- Verfahren mit lichtpolymerisierendem Adhäsiv auf bovinen Zahnprüfkörpern befestigt und einem Thermocycling unterzogen (1000 Zyklen, je 30sec, 5/55°C). Die Ermittlung der Scherhaftfestigkeit erfolgte gemäß DIN 13990-246 in einer Universalprüfmaschine (Zwick BZ050/TH3A, Zwick Roell, Ulm). Zur statistischen Auswertung wurden eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA), der t-Test und der Mann-Whitney-Test durchgeführt. Zur Durchführung der Torsionsstabilitätversuche wurden die bereits in den Scherversuchen verwendeten Bracketgrundkörper um einen Lastarm erweitert. Eine in die Universalprüfmaschine eingespannte Haltekonstruktion diente der Fixierung eines senkrecht zur Druckrichtung ausgerichteten geraden Stangendrahts (Querschnitt von 0,019 inch x 0,025 inch), an dem der Bracketanteil der Prüfkörper mit einer kieferorthopädischen Stahlligatur befestigt wurde. Die Torque- und Tipbewegung entstand durch Kraftapplikation des Druckscherbügels auf den Lastarm des Prüfkörpers. Ergebnisse: 3D-gedruckte Brackets mit makroretentiver Basis zeigten eine Scherhaftfestigkeit von 3,89 ± 1,0663MPa. Bei 3D-gedruckten Brackets mit mikroretentiver Basis wurde eine signifikant geringere Scherhaftfestigkeit von 3,09 ± 1,0454MPa ermittelt. Die Kontrollgruppe mit konventionell hergestellten Kunststoffbrackets zeigte eine vergleichbare Scherhaftfestigkeit von 3,84 ± 0,995MPa. Die in der Literatur beschriebene minimale Scherhaftfestigkeit von 6MPa wurde von keiner der Versuchsgruppen erreicht. Die Torsionsstabilität 3D-gedruckter Bracket zeigte beim maximalen Torque einen Mittelwert von 51,10 ± 9,40Nmm, das mittlere maximale Tipdrehmoment betrug 32,42 ± 5,43Nmm. Schlussfolgerungen: Die Scherhaftfestigkeitswerte 3D-gedruckte Brackets mit Makroretention ähneln denen von konventionell hergestellten Kunststoffbrackets. Um den klinischen Anforderungen besser gerecht zu werden, bedarf es hier allerdings noch einer Steigerung. Die Bruchfestigkeit 3D-gedruckter Brackets in Bezug auf die Torsionsbelastung, sowohl unter Torque- als auch unter Tipbewegung, scheint für den klinischen Gebrauch hingegen angemessen zu sein. In-office verwendbare 3D-Drucker könnten zukünftig für die Herstellung individualisierter Multibracket-Apparaturen genutzt werden.

Die Folgen von Osteoporose und Adipositas stellen große gesundheitspolitische und sozioökonomische Herausforderungen dar. Seit vielen Jahren wird untersucht, inwieweit Fettgewebe auf den Knochen einen protektiven oder schädlichen Einfluss ausübt. Dabei kamen verschiedene Studien, zum Großteil Querschnittsstudien, zu gegensätzlichen Ergebnissen. In der vorliegenden Studie wurde der Zusammenhang zwischen BMI, Taillenumfang, VAT oder abdominellem SAT und der Knochensteifigkeit sowie dem osteoporotischen Frakturrisiko in der erwachsenen Allgemeinbevölkerung im Nordosten Deutschlands untersucht. Dabei konnte ein positiver Zusammenhang zwischen BMI, Taillenumfang, VAT oder abdominellem SAT und der BUA und dem Steifigkeitsindex hergestellt werden. Der BMI war darüber hinaus positiv mit der BUA assoziiert. Außerdem wurde gezeigt, dass die Chance für ein mittleres oder hohes Frakturrisiko mit steigendem BMI, Taillenumfang und abdominellem Fettvolumen abnimmt. Diese Ergebnisse stützen im Wesentlichen das lange beschriebene Paradigma eines protektiven Einflusses des Fettgewebes auf den Knochenstatus und stärken darüber hinaus die Bedeutung der klinisch leicht verfügbaren Parameter BMI und Taillenumfang bei der Einschätzung des osteoporotischen Frakturrisikos. Allerdings erlaubt die Durchführung dieser Studie als Querschnittstudie keine Rückschlüsse auf Kausalitäten hinsichtlich der möglicherweise komplexen Interaktionen zwischen Fett- und Knochengewebe. Daher sind in Zukunft weitere Längsschnittstudien an einer repräsentativen Studienpopulation unter Verwendung standardisierter Messmethoden nötig, um die Zusammenhänge und Interaktionen dieser beiden Gewebe besser zu verstehen.

Das Koi Herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) verursacht eine tödliche Erkrankung bei Kois und Karpfen. Um sichere und wirksame Lebendvirusimpfstoffe zu erhalten, haben wir Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von KHV erzeugt, aus deren Genom die für die beiden Nukleotidstoffwechselenzyme Thymidinkinase (TK, ORF55) und Desoxyuridin-Triphosphatase (DUT, ORF123) codierenden Leserahmen gezielt entfernt worden waren. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in den zellkulturadaptierten aber noch virulenten Stamm KHV-T eingeführt. Umfangreiche in vitro Tests zeigten, dass die Deletion der TK- und DUT- Gene die KHV-Replikation in Zellkultur (CCB Zellen) nicht erkennbar beeinträchtigt. In vivo Tests an Jungkarpfen zeigten jedoch eine im Vergleich zum Ausgangsvirus signifikant reduzierte Virulenz der Einzelgen-Deletionsmutanten eine fast vollständige Attenuierung der Doppelmutante. Dennoch waren alle immunisierten Karpfen gegen eine letale Belastungsinfektion mit virulentem KHV geschützt. Mittels einer neu entwickelten Triplex-Real-Time-PCR und aus Kiementupferproben isolierter DNA war es möglich, mit TK-negativem KHV immunisierte und Wildtyp- infizierte Karpfen zu differenzieren. Daher könnte die Doppelmutante KHV- TΔDUT/TK als genetischer Marker-Impfstoff geeignet sein. In einer zweiten Studie wurde die Funktion von vier immunogenen Hüllglykoproteinen der ORF25-Genfamilie (ORF25, ORF65, ORF148 und ORF149) von KHV untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass alle vier Gene für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion von ORF65 keinen erkennbaren Einfluss auf die Virusvermehrung hatte, führte die Deletion von ORF148 sogar zu einer leicht erhöhten Replikationsrate. Im Gegensatz dazu bewirkten Deletionen von ORF25 oder ORF149 einen verzögerten Eintritt in die Wirtszellen und damit auch eine verlangsamte Vermehrung und Ausbreitung der Viren. Interessanterweise führte die gemeinsame Deletion der Gene ORF148 und ORF149 zu einem wildtypähnlichen Wachstumsverhalten, das auf gegensätzlicher Funktionen der beiden Proteine hindeutete. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von CCB-Zellen, die mit den verschiedenen Glykoproteindeletionsmutanten infiziert waren, zeigten keine Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Virionen im Zellkern oder im Zytoplasma, oder die Virusfreisetzung. Im Tierversuch erwiesen sich KHV-Mutanten mit Deletionen der Gene ORF148 und/oder ORF149 als geringfügig, aber für eine Verwendung als Lebendvirus-Impfstoff nicht ausreichend abgeschwächt. Überlebende Fische waren jedoch gegen Belastungsinfektionen ebenso gut geschützt wie Wildtyp-infizierte Karpfen, so dass die Deletion dieser antikörperinduzierenden Proteine zur Entwicklung von KHV-Markerimpfstoffen beitragen könnte, die eine serologische Differenzierung von Wildtyp-infizierten und geimpften Fischen erlauben (DIVA- Prinzip). In einer dritten Studie wurden durch serielle Zellkulturpassage von virulentem KHV und anschließende in vivo Infektionsversuche Hinweise darauf gefunden, dass das bislang nicht näher charakterisierte, neben dem ORF149 Gen lokalisierte ORF150 für einen weiteren Virulenzfaktor von KHV codiert. Möglicherweise könnte also durch eine kombinierte Deletion der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten KHV-Gene ein sicherer und wirksamer, genetisch und serologisch differenzierbarer Markerimpfstoff hergestellt werden.

Global climate change is occurring all over the world, but in the Arctic the climate is changing more rapidly and drastically than in many other parts of our planet. Many species that are already at their climatic limit need to adapt to recent climate conditions or migrate in order to not go extinct. The possibilities of adaption include phenotypic plasticity and adaptation to various extents. This is also the case for white spruce P. glauca, which belongs to the conifers and thus in the largest group of gymnosperms still living today. Among the approx. 600 extant conifer species white spruce is one of the most widespread trees in North American boreal forests. Its range extends from 69° N in the Canadian Northwest Territories to the Great Lakes at about 44° N, where it occurs from sea level to an altitude of about 1520 m (Burns and Honkala, 1990). Site related, climate-dependent differences in white spruce reproduction can be seen as a strategy to survive under the harsh climatic conditions at Alaska's treelines: Besides sexual reproduction, the vegetative propagation occurs in the white spruce as an additional reproductive mechanism. This can be realized by "layering" when the lower branches of the tree crown touch the ground and develop roots to later grow as a separate individual with or without a connection to the mother tree. Known as other mechanisms of vegetative propagation are also the rooting of fallen trees which were not completely uprooted, and the "root suckering", in which new shoots sprout from the roots of the tree. However, the latter was not yet observed in the genus Picea. With the help of short, repetitive, non-coding sequences in the genome, which are therefore not subject to selection and are called microsatellites, these clones can be determined by genotyping. For this purpose, using different polymorphic microsatellites, an individual multilocus genotype is created for each tree, by means of which it can be compared with all other trees of the same species. In the first part of this work (article I), the occurrence of clones in three study areas at Alaskan treelines are examined and the reasons for their appearance in variable numbers are discussed. For this purpose, 2571 white spruces (P. glauca) were genotyped and their position was determined via differential GPS in the field. The percentage of clonal trees is higher in areas with harsh climatic conditions and correlates with the height of the lowest branches of the tree crown. This suggests that the vegetative propagation of white spruce is a backup strategy for times when climatic conditions hamper sexual reproduction. The correlation between clone numbers and tree crown height suggests "layering" as the main mechanism for cloning whereas selection for vegetative reproduction seems to be very unlikely shown by the results for genetic differentiation between the clonal and the singleton trees in this study. In the second part of this work (articles II and III), the influence of environmental factors and phenotypic traits on the mycobiome of the needles (including all fungi living on (epiphytic) and in (endophytic) the needles) in our study areas in Alaska was investigated. The mycobiome of the white spruce needles was chosen as a proxy for the parasite infection rate by fungi and thus serves as a fitness parameter. For this purpose, all epiphytic and endophytic fungal species were analyzed by a metabarcoding analysis. In article II, 48 trees of one study area at Alaska’s northern treeline (Brooks Range) were examined for differences in mycobiome due to genetic differentiation, phenotypic characteristics and / or habitat characteristics. The trees used for this study were sampled from two adjacent plots on a south-facing mountain slope with an elevation gradient from 875 to 950 meters above sea level. It could be shown that, in contrast to the trees genotype, the height above sea level, the mountain slope, as well as the height and age of the trees have a significant impact on the mycobiome. The genetic differentiation between the tree individuals, however, showed no significant effect. Based on article II we examined the mycobiome composition of a total of 96 trees in 2 plots (16 trees each) at three sites in Alaska over a distance of 500 kilometers. Additionally, we sampled needles of two different ages for each tree (current year and three years old needles) summing up to 192 samples in total. The incentive of this study (article III) was to investigate the influence of origin and age of spruce needles on their mycobiome and if there is a genetic predisposition that is related to the fungal species community. In addition, the sampling design was improved by collecting needles from all four orientations (North, South, East and West) and sampling trees at a standardized distance to each other to avoid systematic errors. Comparable to article II the influence of the trees genetics on the species community of the epiphytic and endophytic fungi of the white spruce needles seems to be very unlikely. In contrast, a significant influence of the geographic origin and the needle age on the species structure of the needle inhabiting fungal species was found. The phenotypic tree traits height and dbh (diameter at breast height) had only minor influence and did in fact explain less than 2% of the mycobiome variance. Using Illumina sequencing, 10.2 million reads from the nucleotide sequence between the internal transcribed spacer (ITS) genes could be obtained, which yielded in 1575 ribotypes (called operational taxonomic unit, OTU) for the fungi. These were compared with a reference database to compare and assign them to known fungal species. For example, 942 OTUs with >95% similarity could be identified as known species, with 1975 samples identified on genus level and 2683 when determined to family level. The most pronounced difference between the two studies (article II and III) were due to the fungal species of the class of Pucciniomycetes, more specifically the genus Chrysomyxa which belongs to the rust fungi and is plant pathogenic. In the study of article II (sampling in 2012), Pucciniomycetes accounted for only a minor portion of the assigned DNA sequences. In the second study (article III, sampling in 2015) they accounted for more than half of all basidiomycetes found, which in turn contain 20.0% of all DNA sequences, the second largest phylum found beside Ascomycetes (51.4%).

Due to a variety of plasma sources in terms of type of discharge, energy yield, working gas or geometric factors, it is recommended to standardize the study protocol by choosing a plasma source and easy access to rugged tumor surfaces as demonstrated by the CAP-plasma-jet. The intention of the trial shall be to optimize the plasma jet for tumor site capability and operating room implementation. It makes sense to start clinical trials in plasma medicine with the treatment of head and neck squamous cell carcinoma patients of infected wounds and ulcerations. CAP is able to reduce contamination of cancer ulcerations and the typical fetid odor that often accompanies head and neck cancer patients. The intention of the trial shall be to evaluate the efficiency of decontamination in head and neck cancer ulcerations in terms of pathogenic species, amount of reduction and reliability. Standardize study protocol: Phase I, clinical explorative single-arm, randomized, open, multicenter Primary objective Reduction of microbial burden of cancer ulcerations by application of CAP Secondary objective: Reduction of tumor following local CAP application Inclusion: 20 Patients suffering from locally advanced oral cavity carcinoma with open tumor surfaces, treated with palliative intention and no more curative treatment options Exclusion: No wish for treatment, no compliance and understanding the protocol of the clinical study Efficacy: reduction of microbial burden; Documentation of visible changes by photography; Pathohistological and biochemical examination of specimen, taken from the tumor area and control areas Procedure: Plasma is applied for 1 minute per cm², spot area of 3 mm diameter distance between nozzle and tumor surface of 14 mm. 3 times/week with a break of 1 week followed by a repeated cycle for another week. Conclusion: The most important intention of the trial from the clinician’s point of view shall be to make CAP-treatment an effective and well-accepted addition to standard cancer therapy based upon EBM at least in palliative medicine.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den subjektiven Gesundheitszustand von Asylsuchenden in Vorpommern-Greifswald und Berlin sowie deren Inanspruchnahmeverhalten in Bezug auf medizinische Hilfe zu untersuchen. Für Mecklenburg-Vorpommern wurde dieses Thema bisher noch in keiner Arbeit aufgegriffen und an bundeslandübergreifenden Erhebungen fehlt es deutschlandweit. Die hier durchgeführte Befragung in sechs Gemeinschaftsunterkünften in Vorpommern-Greifswald und Berlin ermöglicht zudem einen Vergleich zwischen ländlichen und städtischen Strukturen. Um auch verschiedene Versorgungsvoraussetzungen in den Herkunftsländern aufzugreifen, wurden Farsi-sprechende, das heißt aus Afghanistan und Iran Geflüchtete befragt. Der verwendete Farsi-sprachige Fragebogen ist eigens für diese Arbeit entwickelt worden und beinhaltet unter anderem den Gießener Beschwerdebogen, Items des European Minimum Health-Moduls und des Deutschen Gesundheitssurveys. Die theoretischen Grundlagen zum Inanspruchnahmeverhalten beziehen sich maßgeblich auf Rosenstocks Health Belief-Modell. Damit ergeben sich Hinweise auf die kulturelle Übertragbarkeit dieses Modells auf den persischen Kulturkreis. Trotz hoch eingeschätzter Beeinträchtigung im Alltag durch den eigenen Gesundheitszustand, erfolgen nur durchschnittlich 4,3 Arztbesuche in 12 Monaten. Dabei unterscheiden sich die Verhältnisse bei Hausarztbesuchen von denen bei der Inanspruchnahme von Nothilfe, was die juristische Unterscheidung dieser beiden Bereiche im Asylbewerberleistungsgesetz widerspiegelt. Dieser juristische Rahmen wird als mitentscheidendes Hindernis bei der Inanspruchnahme von hausärztlicher Versorgung erlebt. Als größte Herausforderung ergab sich die kleine Stichprobe (N=66) sowie die kulturelle und sprachliche Differenz. Diese Limitationen sind jedoch vergleichbar mit anderen Arbeiten in diesem Themenfeld.

Climate change threatens marine ecosystems by simultaneous alterations and fluctuations in several abiotic factors like temperature, salinity and pH. Therefore, a strong ability to cope with varying environmental factors is indispensable for marine organisms. Especially, larvae of meroplanktonic species will be affected by predicted alterations in environmental conditions as planktonic larval stages are considered the most sensitive stages during life history (Anger 2001). The European shore crab Carcinus maenas, as an ecological key species, was chosen as a model species to investigate multiple stressor effects on early life history stages of marine meroplanktonic invertebrates. The life cycle of C. maenas is biphasic consisting of five pelagic larval stages (four zoeal and one megalopal stage), followed by benthic juvenile and adult phases. The metamorphic molt from the last zoeal stage to the semi-benthic Megalopa includes dramatic changes in ecology, habitat, behavior, feeding, morphology, and physiology. During life history, zoeal stages of C. maenas are of particular interest in the course of climate change as these stages are more vulnerable than the following developmental stages to alterations in abiotic factors. The aim of the present thesis was to develop an integrative view on effects of long-term exposure, from hatching to metamorphosis, to increased temperature and hypo-osmotic conditions on early life history stages of C. maenas. We wanted to gain insights into larval responses to climate driven environmental variables, more specifically, on how tolerance to low salinity is affected by increased temperatures. Consequently, the present study investigated the effect of long-term exposure to twelve different sub-lethal temperature and salinity combinations in an ecological relevant range on larval development of C. maenas. In a multidisciplinary approach, larval responses in performance (survival and developmental duration) and morphology were measured. Furthermore, analysis on larval ontogeny and organogenesis created the foundation for analysis of larval response to multiple stressors in anatomy. Results of the present thesis demonstrated that despite their different life-styles and external morphology, brachyuran larvae are smaller versions of their adults when regarding their inner organization: the adult bauplan unfolds from organ anlagen compressed into miniature organisms. In addition, they provide an overall picture of seemingly gradual organogenesis across larval development and the metamorphic molt, an insight that contrasts with the abrupt external morphological changes during metamorphosis. Gradual anatomical changes in e.g. osmoregulatory structures like gills and antennal glands allowed for ontogenetic shifts of tolerance to temperature and salinity during zoeal development and successive increase in osmo- and thermoregulatory capability. On the other hand, osmoregulatory structures as seen for adults were underdeveloped during zoeal development and therefore do not qualify for osmoregulatory function for these stages. This potentially explains the higher sensitivity of zoeae to hypo-osmotic conditions. Early life history stages of C. maenas were affected on all response levels by the tested multiple stressors. The interaction of temperature and salinity was of antagonistic type, resulting in general reduced stress for larval stages. Nevertheless, low salinity had a strong negative impact on survival, while increased temperature caused ann acceleration of development. Furthermore, the size of zoeae of C. maenas was driven by the interaction of temperature and salinity, with extreme conditions, causing diminished growth, thus resulting in smaller larval size. On the other hand, larval shape was only slightly affected by changes of abiotic factors. Volume of the digestive gland and the heart of larvae from long-term exposure to sub-lethal temperatures and salinities showed high variability. Larval responses were affected by the stressors intensities: moderately high temperatures lessened the negative effects of low salinities, while extreme high temperatures exceeded the ameliorating effect of temperature on stressful salinity conditions. On the other hand, the tolerance to temperature and salinity increased during larval development indicating an ontogenetic shift in response to multiple stressors with development. In addition, performance, morphology, and multiple stressor interaction showed intrapopulation variability among larvae hatched from different females, and between experimental periods. In conclusion, this study highlighted direct effects of abiotic factors on all investigated response levels in early life history stages of the meroplanktonic larvae of the invertebrate C. maenas. High mortality rates combined with higher sensitivity confirm that planktonic early life history stages are the bottleneck during life history of this species. Nevertheless, early life history stages of C. maenas had the ability to cope with wide ranges of changing environmental factors. The antagonism between temperature and salinity on larval development offers potential for early life history stages to persist in a changing world. Furthermore, anatomical structures allow for slight eurytolerance and potentially for compensation of abiotic stress. Overall, slight increases in temperature, driven by climate change may enable larvae of C. maenas to tolerate exposure to moderately low salinities and, combinedwith intrapopulation variability, potentially allows for population persistence. Summarized, this study emphasizes the importance of testing a wide range of ecologically relevant traits in developing pelagic larvae in order to properly characterize their response to environmental change. Changes in abundance and phenology of planktonic larvae like the zoeae of C. maenas have major potential to change a species‘ population structure significantly, and furthermore indirectly affect whole community and ecosystem structures. Therefore, this thesis may serve as a bridge to future studies in evolutionary and ecological developmental biology.

In times of recent climate change, mechanisms to deal with different environments (e.g. via dispersal to other habitats, or via in-situ responses such as genetic adaptation or phenotypic plasticity) are essential. In regions showing seasonality, organisms are already adapted to regular and, thus, often predictable environmental changes. One well-known strategy to survive periods of food shortage, especially during the winter, is hibernation. Although hibernation is already an adaptation to overcome unfavourable conditions, the optimal timing of hibernation to match for example food abundance peaks is likely to be influenced by changing climatic conditions, as expected during human-induced global change. Thus, the ability to respond to changes in optimal timing of hibernation can be crucial for organisms. All hibernators are positioned at the slow end of the slow-fast life history continuum. Longevity combined with a low annual reproductive output can result in slow recovery from population crashes and is expected to be associated with slow genetic adaptation. Therefore, it is assumed that phenotypic plasticity, a rather rapid and sometimes reversible process, is a crucial mechanism in long-lived organisms to adapt to changing environments. However, how differences in individual hibernation behaviour influence mortality and whether individuals are plastic with respect to their hibernation behaviour are largely unknown. Recent studies suggest that climatic change can influence hibernation behaviour in various species differently, in a positive or negative way. Female Columbian ground squirrels (Urocitellus columbianus) delayed their emergence from hibernation with later snow melt and lower spring temperatures. Next to the environmental impact, emergence date showed a moderate heritability in female Columbian ground squirrels. Yellow-bellied marmots (Marmota flaviventris) emerged earlier from hibernation with warmer spring temperatures which resulted in a longer growing period for their offspring and, therefore, higher survival rates. In contrast, in alpine marmots (Marmota marmota) lower snow cover due to higher temperatures and, thus, less isolation led to lower juvenile survival. Negative effects, such as reduced juvenile survival, would be of high concern, especially for long-lived species with a low reproductive output. Bats are exceptionally long-lived compared to other mammals of the same size and often show a low reproductive output with one offspring per year. This is especially true in the temperate zone where bats, furthermore, are characterized by seasonality and depend on hibernation during winter period to survive food and water shortage. Because bats are of high conservation concern it is of prime importance to understand their ability to respond to different climatic conditions and associated mortality costs. The basis of this study was a five-year data set of 1047 RFID-tagged individuals from two bat species, Natterer’s bats (Myotis nattereri) and Daubenton’s bats (Myotis daubentonii), that were automatically tracked when entering or leaving the joint hibernaculum, “Brunnen Meyer”, located in north-western Germany. The two species are similar sized, share demographical traits and often occupy the same areas. Nevertheless, they differ in their foraging strategy and activity pattern during hibernation period. Natterer’s bats are able to glean insects from surfaces, even at low temperatures. Daubenton’s bats depend on flying arthropods and, thus, warmer temperatures. And indeed there is evidence that Natterer’s bats are able to hunt during hibernation period, while in Daubenton’s bats a lack of feeding during the hibernation period is suggested. Furthermore, Natterer’s bats are characterized by a higher activity at the hibernaculum throughout the hibernation period, while Daubenton’s bats on average arrive earlier, stay inactive through the winter and leave later in spring. In both species, the aim was to investigate the impact of their individual hibernation behaviour, precisely the timing of departure in late winter and early spring, on mortality, their adjustment of departure timing to the North Atlantic Oscillation Index (NAO), as well as differences within and between the two species from 2011 until 2015. To later on estimate the potential mortality costs of departure timing, gaining knowledge about the seasonal survival pattern (winter vs. summer) in the two species was a first necessity. In birds, particularly small species were described as winter-regulated populations with a higher mortality during winter. In contrast, in hibernating mammal species, such as bats, a relatively lower or similar winter survival compared to summer survival was shown. In this study, the analysed data demonstrated that the winter 2010/2011 was exceptionally catastrophic in Natterer’s bats and did not impact Daubenton’s bats. When excluding this catastrophic winter in Natterer’ bats, our results revealed a stable winter-summer-survival difference (higher winter and lower summer survival) in adult Natterer’s and Daubenton’s bats, with inter-annual variation in the level of survival which indicates a potential environmental impact on survival. This winter-summer survival pattern is in line with the survival pattern shown for other hibernators. Juveniles always had a lower survival rate than adult bats in both species. Nevertheless, the extent to which the species differ between seasons and age classes was stronger in Daubenton’s bats. They always showed a slightly higher winter survival and a lower summer survival than Natterer’s bats. Together with the catastrophic winter 2010/2011 in Natterer’s bats, this indicates a species-specific sensitivity to the timing of specific weather events which is in line with their foraging strategies and activity pattern during hibernation period. With respect to emergence behaviour from the hibernaculum, the results of this study suggest considerable differences among individuals within as well as between bat species. In comparison to Daubenton’s bats, Natterer’s bats tuned their emergence more closely to weather conditions, specifically the NAO, a large scale weather index related to winter severity, and showed individual variation in behavioural plasticity. In Daubenton’s bats only the females responded to changing conditions and left earlier in individually-experienced warmer and milder winters, comparable to Natterer’s bats females. A potential reason might be reproductive advantages for the females resulting in a longer growing period for their offspring. The shown higher winter survival in adult bats of both species indicated already higher energy expenditure outside the hibernaculum. Thus, leaving early, being active and staying outside longer by itself bore a risk (exposure risk effect). Under consideration of longer exposure times, early departing individuals had on top of that an increased risk to die. This was not given in each year, but a species- and year-specific pattern was revealed. Natterer’s bats were only significantly affected by early departure in 2011, while the remaining years show no significant additional risk of leaving early. In Daubenton’s bats, the years 2014 and 2015 were associated with a significantly higher mortality of leaving early. This is in line with the hypothesis that Daubenton’s bats might not be able to hunt for insects leaving too early and do so as a best out of a bad job. Nevertheless, the year-specific pattern suggests that early bats might profit from advantageous weather conditions during early spring. An additional hint for an environmental impact on early bat survival in at least Daubenton’s bats is that the median proportion of night hours above 3 °C within five days after departure was included in the model with the lowest AIC. However, the effect was not strong enough to be selected as the best model and, therefore, further analyses are needed to investigate this first hint. In conclusion, the reduced winter survival of juveniles compared to adults highlights the importance of considering age class effects in studies that investigate seasonal survival patterns. The stable species-specific winter-summer-survival difference with a higher winter survival compared to summer survival, as well as the one catastrophic winter in Natterer’s bats underline the importance of including seasonal survival patterns in assessing potential fitness costs of changed behaviour. Furthermore, our results suggest that long-lived hibernating bat species have the potential to plastically adjust to changing climatic conditions, but this potential differs between species. Among-individual differences in emergence together with species-specific mortality costs of early emergence suggest the potential for natural selection to shape hibernation phenology. In summary, our findings suggest species-, population- and group-specific differences in the ability to respond to changing environments and, therefore, underline the necessity to further investigate local responses in various organisms to estimate consequences of recent climate change on a wider range.

Ziel der Arbeit war eine Analyse des Auftretens von Risikoclustern unter der Berücksichtigung der Risikoausprägung der Risikoverhaltensweisen Tabakrauchen, Alkoholkonsum, Übergewicht und geringe körperliche Aktivität in einer bevölkerungsrelevanten Stichprobe. Dafür wurde ausgehend von Literaturrecherchen ein Risikoscore entwickelt, anhand dessen Prävalenzdarstellungen sowie multinomiale logistische Regressionsanalysen für als besonders relevant erachtete Risikoscoreausprägungen erfolgten. Die Ergebnisse zeigten ein Dominieren von nicht und wenig riskanten Verhaltenskombinationen in der Gesamtbevölkerung sowie eine Häufung von Risikoverhaltensweisen bei Jüngeren und kürzer Ausgebildeten. Zudem bestand bei den Befragten mit geringerem Bildungsgrad eine hohe Varianz der Risikoverhaltenskombinationen. Als wichtigste Risikoverhaltenskombination mit erhöhter Risikoausprägung wurde das Vorliegen eines Bewegungsmangels kombiniert mit dem Konsum von Tabak festgestellt.

Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine befällt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material übertragen. Während die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verläuft, verursacht die ASP eine hohe Mortalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die jüngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung für die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verfügbar. Und es liegen nur wenige Informationen über Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage für die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden könnten. Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert für über 150 Gene. Über die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umhüllten reifen extrazellulären Virionen auch einfach umhüllte intrazelluläre Partikel, die die die Präparation reiner extrazellulären Virionen erschweren. In früheren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellulären Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte über ein im Jahre 1985 veröffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde für die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer frühen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls bestätigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst während der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellulärer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Präparation über einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 %, die spezifische Infektiosität bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Präparation zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilität der Virionen beeinträchtigt. In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine bestätigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) bestätigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als mögliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter hauptsächlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren fünf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazelluläre Proteom des ASFV identifiziert werden. Für diese Untersuchungen wurden drei empfänglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit für viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empfänglichen Wirt stammt. Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In früheren Studien konnte die Existenz eines Proteins für 44 ORFs bestätigt werden. Für weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass für 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag. In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. Für 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, für 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. Für 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei fünf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell bestätigt. Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet. Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen ähnlich stark oder sogar stärker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden überraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit möglicherweise Träger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.

Escherichia coli has been commonly used as a platform for recombinant protein production and accounts for approximately 30% of current biopharmaceuticals on the market. Nowadays, many recombinant proteins require post-translational modifications which E. coli normally cannot facilitate. Therefore, novel technological advancements are unceasingly being developed to improve the E. coli expression system. In this work, some of the most recently engineered platforms for the production of disulfide bond-containing proteins were used to study the E. coli proteome under heterologous protein production stress. The effects of protein secretion via the Sec and Tat translocation pathways were examined using a comparative LC-MS/MS analysis. The E. coli proteome responds to foreign protein production by activation of several overlapping stress responses with a high degree of interaction. In consequence, a number of important cellular processes such as cellular metabolism, protein transport, redox state of the cytoplasm and membrane structure are altered by the production stress. These changes lead to the reduction of cellular growth and recombinant product yields. Resolving the identified bottlenecks will increase the efficiency of recombinant protein expression processes in E. coli.

The purpose of this study was to compare the effect of culture on consumers’ attitudes toward Cause-Related marketing between Iran and Germany by answering the following questions: A: What is consumer’s response concerning (1) skepticism toward CRM claim (2) attitude toward the CRM strategy, (3) attitude toward CRM brand personality, (4) attitude toward the CRM brand image and (5) CRM purchase intention (6) Warm glow? ; B: Do consumers respond differently to Cause-Related Marketing in Iran in comparison to Germany? C: Can cultural characteristics of the countries explain these differences? To answer the research questions, hypotheses were developed based on the literature which shape the research framework, in total containing 17 hypotheses. The data was gathered by questionnaire to make the research quantitative. By using convenience sampling, 564 responses were generated. The data was analysed by Structural Equation Modeling (SEM) and independent student t-test. Potential differences between Iran and Germany as well as moderation analysis are tested by critical ratio difference test as well as chi-square difference test using multiple- group analysis in AMOS. The results showed the importance of culture in applying CRM strategy. It can be said that CRM in a collectivistic culture like Iran can be successful as well as individualistic country like Germany. Although Iranian consumers were less familiar with this strategy, the benefits of CRM were similar in case of brand image and higher for purchase intention. The research found that emotions play a stronger role in Iran and it is more critical to evoke proper emotions by CRM campaign.

CCR4(-/-) Mäuse überleben in verschiedenen Sepsismodellen (LPS-Schock, CLP, CASP) im Vergleich zum CASP-operierten C57BL/6-Wildtyp besser. Durch Retransfusion von Splenozyten CASP-operierter CCR4(-/-) Mäuse wurde gezeigt, dass dieser überlebensfördernde Effekt auf den Wildtyp übertragbar ist. Ein Anhalt für einen Effekt durch die Retransfusion größerer Mengen nekrotischer oder apoptotischer Zellen findet sich nicht. Auch ein rein proteinassoziierter Effekt scheidet aus. Ursächlich für das verbesserte Überleben nach Retransfusion von CCR4(-/-) Zellen CASP-operierter Mäuse könnte neben einer gering veränderten Zusammensetzung der retransfundierten Zellpopulationen vor allem eine forcierte Verteilung der retransfundierten CCR4(-/-) Zellen in die Milz und weg vom Thymus septischer Empfängertiere sein.

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae; the pneumococcus) is a Gram-positive, aerotolerant, and opportunistic bacteria, which colonizes the upper respiratory tract of human. S. pneumoniae can further migrate to other sterile parts of the body, and causes local as well as fatal infections like, pneumonia, septicaemia and meningitis. Due to incomplete amino acid pathways, pneumococci are auxotrophic for eight different amino acids including glutamine and arginine. The pneumococcus has adapted to the various host environmental conditions and a number of systems are dedicated for the transport and utilization of nutrients such as monosaccharides, amino acids and oligopeptides. In this study the amino acid metabolism was characterised by 15N-isotopologue profiling in two different pneumococcal strains, D39 and TIGR4. Efficient uptake of a labelled amino acids mixture of 15N-labelled amino acids showed that S. pneumoniae has a preference for the amino acids transport instead of a de novo biosynthesis. It is known that glutamine (Gln) serves as main nitrogen source for S. pneumoniae. The 15N-labelled Gln used in this study demonstrated an efficient 15N-enrichment of Glu, Ala, Pro and Thr. Minor enrichment was seen for the amino acids Asp, Ile, Leu, Phe, Tyr, and Val. Remarkably, labelled Gly and Ser could be determined in strain TIGR4, whereas for strain D39 these two labelled amino acids were not detected. This confirms earlier studies with 13C-labelled glucose, which showed the biosynthesis of Ser out of Gly. Strain TIGR4 was able to grow in chemically-defined medium depleted of Gly confirming that Gly can be synthesized out of serine by the action of the enzyme serine hydroxymethyltransferase (SHMT). The transcriptional regulator GlnR controls the Gln and Glu metabolism in S. pneumoniae. Hence, the impact of the repressor GlnR on amino acids metabolism was also studied. An increased 15N-enrichment was determined for Ala and Glu in both used pneumococcal strains, while an increased level of Pro was only measured in the isogenic glnR-mutant of non-encapsulated D39. Arginine can also serve as nitrogen source in strain TIGR4. The arginine deiminase system metabolizes Arg into ornithine, carbamoyl phosphate and CO2 by the generation of 1 ATP and 2 mol NH3. Because of the truncation of the arcA gene strain D39 lacks arginine deiminase activity and has thus no functional ADS system. When 15N-Arg was added for growth, only in strain TIGR4, thirteen (13) labelled amino acids were detected with the highest enrichment for Ala, Glu and Thr. Genes coding for the enzymes of the arginine metabolism and for arginine uptake are regulated by the activator ArgR2 in strain TIGR4. Inactivation of ArgR2 was not accompanied by an enrichment of labelled amino acids, when the argR2-mutant was grown with 15N-labelled Arg indicative of the important role of ArgR2. The bicistronic operon arcDT encoding the arginine/ornithine transporter ArcD and a putative peptidase ArcT belong to the peptidase family M20. The in silico comparison of structures revealed a significant homology of ArcT to PepV of L. delbrueckii and to Sapep of S. aureus known as carboxypeptidase. ArcT was heterologously expressed in E. coli and purified under reducing conditions. An enzymatic reaction was established and several dipeptides like Ala-Arg, Arg-Ala, and Ala-Asp were used as substrates. In addition, the dependency on divalent cations was analysed. Cleavage of the dipeptide Ala-Arg was detected in the presence of Mn2+ as cofactor under reducing conditions. Reduced peptidase activity was observed when Zn2+ was added. No cleavage of the tripeptide Ala-Ala-Arg could be shown indicating that ArcT acts as dipeptidase with the preference to the Arg residue at the C-terminal end. Bacterial meningitis caused by S. pneumoniae was studied in an in vivo proteomic analysis. In a mouse meningitis model S. pneumoniae was isolated from the cerebrospinal fluid (CSF) by a filter extraction step. The MS analysis identified AliB and ComDE only from CSF isolated pneumococci indicating that these proteins are expressed under infection conditions. Mice infected with D39 wild-type and isogenic aliB, comDE and aliB-comDE double knockout mutants showed significantly less number of pleocytosis in the CSF and lower bacterial load in the blood compared to the wild-type. The results indicate that AliB and ComDE play an important role during meningitis. Phenotypic characterization was carried out to identify differences between the wild-type and the aliB-, comDE- and aliB-comDE double mutants. Oxidative stress conditions were induced by the application of hydrogen peroxide or paraquat during growth in a chemically-defined medium similar to the CSF. No alteration in growth and survival of these mutants compared to the wild-type was observed suggesting that oxygen radicals play not an important role during the progression of meningitis. In addition, no differences of AliB expression was detected in the ComDE deficient D39. No impact of aliB and comDE-mutation on the expression of different virulence factors like pneumolysin or proteins involved in capsular biosynthesis was detected. In vitro proteome analysis was performed to compare the wild-type to the AliB, and ComDE deficient D39 in the early and mid logarithmic growth phase. More than 70 % of theoretically expressed proteins were identified. In the aliB-mutant 33 proteins were differentally expressed in the early growth phase and 50 proteins differed during mid log growth. For the comDE mutant 24 and 11 proteins differed in expression in these two growth phases. Interestingly, high level of AliA expression was identified in all samples. The aliB-mutant had a decreased abundance of the proteins resembling an oligopeptide ABC transporter (AmiA, AmiC, AmiD, AmiE). In addition, another ABC transporter for iron transport encoded by spd_1607 to spd_ 1610 was higher expressed in the aliB-mutant. In the ComDE deficient mutant lower abundance of the Ami transporter sytem was identified. An increased abundance of proteins involved in the pyrimidine metabolism (PyrF, PyrE, PyrDb, PyrB and PyrR) was recognized only in the early growth phase of the comDE-mutant. These analyses demonstrate the marginal changes in protein synthesis during growth of S. pneumoniae. These studies demonstrated the adaptation of the proteome of S. pneumoniae to different growth conditions and the impact of regulatory proteins on the availability of carbon and nitrogen sources.