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Abomasal emptying rate of diarrhoeic and healthy suckling calves fed with oral rehydration solutions
(2020)
Abstract
The aim of the study was to determine the abomasal emptying rate (AER) of calves suffering from naturally occurring diarrhoea compared with that of healthy calves. Furthermore, the effects of an oral rehydration solution (ORS) mixed into milk replacer on the AER were determined. Acetaminophen absorption test (APAT) was performed to estimate the AER. Sixty Holstein–Frisian calves (age < 14 days) were included in the study and divided into groups as follows: healthy calves (H; n = 16), healthy calves fed with ORS (HORS; n = 14), diarrhoeic calves (D; n = 15) and diarrhoeic calves fed with ORS (DORS; n = 15). For the APAT, the calves were fed 2 L of milk replacer containing 50 mg acetaminophen (AP)/kg body weight. Venous blood samples were collected before and after milk replacer and AP intake in 30–60 min intervals for 12 hr. During the APAT, no significant differences in median maximum acetaminophen concentration (Cmax) were observed among all groups. Time to reach maximum acetaminophen concentration (Tmax) in DORS (median 390 min, 25/75 quartiles: 300/480 min) was significantly higher compared with that in H (median: 270 min 25/75 quartiles: 210/315 min) and HORS (median: 300 min (25/75 quartiles: 240/360 min). Non‐linear regression revealed that the calculated abomasal half‐life (AP t1/2) tended to be delayed in DORS (median: 652 min, 25/75 quartiles: 445/795 min, p = .10). The area under the AP curve values (AUC) from 0 to 120 min and 0 to 240 min of the observation period were significantly higher in H than D and DORS. In conclusion, significant differences in the AER indices reflected delayed abomasal emptying in diarrhoeic calves. Furthermore, the hypertonic ORS tended to have an additive delaying impact on the AER, which needs attention for the feeding management of diarrhoeic calves.
Als Folge eines akuten Myokardinfarktes kommt es zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration assoziiert mit einer Aktivierung der kardialen Cysteinproteasen Calpain I und II. Diese scheinen in der Pathogenese von Gewebeschäden und Nekrose nach Myokardinfarkt eine wesentliche Rolle zu spielen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Calpain I bei kardialen Umbauprozessen nach Infarkt. Calpaininhibitoren könnten daher in der Therapie des Myokardinfarkts erfolgreich eingesetzt werden. Unter den Bedingungen einer kardialen Ischämie konnte bei einigen dieser Substanzen eine kardioprotektive Wirkung demonstriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde ein Aktivitätsprofil der beiden Calpainformen im infarzierten und nicht-infarzierten Myokard erstellt und die Auswirkungen des Calpaininhibitors CAL 9961 in vitro und in vivo untersucht. Hierzu wurde an Ratten durch permanente Ligation der linken Koronararterie ein akuter Myokardinfarkt induziert. Ein, 3, 7 und 14 Tage nach Infarkt wurden Calpain I und II aus Gewebehomogenaten von interventrikulärem Septum (IS) und linker, freier Ventrikelwand (LVFW) mittels Chromatographie auf DEAE-Sepharose getrennt. Die Aktivität wurde in scheinoperierten und Infarkt-induzierten Tieren mit chronischer Placebo- oder CAL 9961-Therapie mithilfe eines Enzymassays mit synthetischem Substrat gemessen. Die Therapie wurde 3 Tage vor Infarktinduktion begonnen. Calpain I-Aktivität erreichte 14 Tage nach Infarkt höchste Werte im nicht-infarzierten Myokard (IS), während die maximale Calpain II-Aktivität 3 Tage nach Infarktereignis im infarzierten Herzgewebe (LVFW) gemessen wurde. In Experimenten in vitro hemmte CAL 9961 beide Calpainformen vollständig. In vivo verhinderte eine chronische Therapie mit CAL 9961 bei Tieren mit Myokardinfarkt teilweise den Anstieg der Calpain I-Aktivität im nicht-infarzierten Gewebe (IS) und reduzierte die Calpain II-Aktivität im infarzierten Myokard (LVFW) auf das Level scheinoperierter Tiere. Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die kardialen Calpaine I und II nach einem akuten Myokardinfarkt aktiviert werden, sich ihre Aktivierung jedoch innerhalb des Myokards zeitlich und regional unterscheidet. Die chronische Inhibition dieser Enzyme könnte die Calpain-vermittelten Gewebeschäden limitieren und zur Erhaltung der strukturellen Integrität des Myokards nach Infarkt beitragen.
Organic cation transporter 1 (OCT1) is a membrane transporter that affects hepatic uptake of cationic and weakly basic drugs. OCT1 transports structurally highly diverse substrates. The mechanisms conferring this polyspecificity are unknown. Here, we analyzed differences in transport kinetics between human and mouse OCT1 orthologs to identify amino acids that contribute to the polyspecificity of OCT1. Following stable transfection of HEK293 cells, we observed more than twofold differences in the transport kinetics of 22 out of 28 tested substrates. We found that the β2-adrenergic drug fenoterol was transported with eightfold higher affinity but at ninefold lower capacity by human OCT1. In contrast, the anticholinergic drug trospium was transported with 11-fold higher affinity but at ninefold lower capacity by mouse Oct1. Using human–mouse chimeric constructs and site-directed mutagenesis, we identified nonconserved amino acids Cys36 and Phe32 as responsible for the species-specific differences in fenoterol and trospium uptake. Substitution of Cys36 (human) to Tyr36 (mouse) caused a reversal of the affinity and capacity of fenoterol but not trospium uptake. Substitution of Phe32 to Leu32 caused reversal of trospium but not fenoterol uptake kinetics. Comparison of the uptake of structurally similar β2-adrenergics and molecular docking analyses indicated the second phenol ring, 3.3 to 4.8 Å from the protonated amino group, as essential for the affinity for fenoterol conferred by Cys36. This is the first study to report single amino acids as determinants of OCT1 polyspecificity. Our findings suggest that structure–function data of OCT1 is not directly transferrable between substrates or species.
Die koronare Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache in den Ländern der westlichen Welt. Dem Endothelin-System wird zunehmend eine Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und der koronaren Herzkrankheit (KHK) zugesprochen. Das Endothelin-Converting Enzyme (ECE) katalysiert im letzten Schritt des Endothelin-Systems die Bildung des aktiven Endothelins aus seinem inaktiven Vorläufer big-Endothelin. In dieser Arbeit wurde die Assoziation der beiden Polymorphismen G-377A und C-854T in der Promotorregion des ECE-1a, einer Isoform des ECE, zum Risiko der KHK in einem großen Kollektiv von 1000 Patienten mit einer angiografisch verifizierten KHK und 1000 Kontroll-Patienten untersucht. Die Untersuchung ergab für die Variante G-377A eine Häufigkeit des A-Allels von 10,44% in der KHK-Gruppe gegenüber 10,69% in der Kontrollgruppe. Für die Variante C-854T ergab sich eine Häufigkeit des T-Allels von 8,05% in der KHK-Gruppe gegenüber 7,24% in der Kontrollgruppe. Beim Vergleich der Genotypenverteilung mittels x2-Test ergab sich für beide Varianten kein signifikanter Unterschied (p=0.71 bzw. p=0.63). Für beide Varianten erfolgten Stratifizierungen nach allgemeinen Faktoren wie Alter und Geschlecht und nach den verschiedenen Risikofaktoren einer KHK, die insgesamt keine signifikanten Verteilungsunterschiede ergaben. Zusammenfassend konnte kein Beweis einer Assoziation der beiden Polymorphismen zum Risiko der koronaren Herzkrankheit erbracht werden
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind zur häufigsten Todesursache in der BRD geworden. Wir untersuchten anhand eines funktionell bedeutsamen Polymorphismus der endothelialen NO-Synthase, inwiefern ein Zusammenhang zwischen einer genetischen Variante zu diesen Erkrankungen besteht. In einer großen populationsbasierten Querschnittsstudie in Nord- und Ostvorpommern stellten wir keine signifikante Assoziation des eNOS Glu298Asp-Polymorphismus zu kardiovasculären Erkrankungen wie arterielle Hypertonie oder Myokardinfarkt fest.
Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abhängig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen vom Verhältnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abhängt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquitär exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilität der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung für den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu führen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilität der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilität der NDPK-Expression untersucht werden. Dafür wurden zunächst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivität etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivität konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren können. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivität wurde eine systematische Analyse zur Phänotyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgeführt. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität für die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene für beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche für die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. Für die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. Für zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazität von Kernproteinen untersucht. Darüber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Ergänzende Untersuchungen mit Centre dÉtude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien bestätigten eine ausgeprägte Variabilität der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erklärt werden konnte.
Auswirkungen der Körperposition auf die Magenentleerung und Pharmakokinetik von oralen Arzneiformen
(2023)
Kenntnisse über die Physiologie des humanen GITs und dessen Einfluss auf orale Arzneiformen sind essenziell für die Sicherheit der Pharmakotherapie. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher Körperpositionen auf das Anfluten von Koffein als Modell für eine Substanz der BCS Klasse I bei der Einnahme als Tablette und Kapsel sowie die Magenentleerung des mitgetrunkenen Wassers zu untersuchen und untereinander zu vergleichen. Die Erhebung der Daten erfolgte durch Speichelproben von 12 gesunden Probanden nach Einnahme von jeweils 240 mL Wasser zusammen mit einer Koffein enthaltenden Eiskapsel als Markierung für das Wasser, sowie je einer ebenfalls Koffein enthaltenden Hartkapsel und einer Tablette in aufrechter Körperposition, Rückenlage, Rechts- und Linksseitenlage im Crossover-Design. Zur Unterscheidung wurde für die Eiskapsel 13C3-isotopenmarkiertes Koffein, für die Kapsel 13C1-isotopenmarkiertes Koffein und für die Tablette natürliches (12C) Koffein verwendet.
Die Magenentleerung von Wasser im nüchternen Zustand ist abhängig von dem hydrostatischen Druck, der auf den Pylorus drückenden Wassersäule. Abhängig von der Körperposition wird demnach unterschiedlich viel zusätzliche mechanische Arbeit des Magens benötigt, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Da diese Arbeit in allen Positionen in Abhängigkeit des MMC ohnehin durch aktive Kontraktionen und Motilität aufgebracht wird, ist bei zusätzlich vorliegendem hydrostatischen Druck die Wasserentleerung schneller. Die Magenentleerung von Wasser ähnelt sich in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage, da in diesen Körperpositionen keine zusätzliche mechanische Arbeit benötigt wird, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Im Gegensatz dazu entleert der Magen in Rückenlage und in Linksseitenlage langsamer Wasser, da in diesen Körperpositionen das Wasser gegen die Schwerkraft aus dem Pylorus herausgedrückt werden muss. So war in Linksseitenlage statistisch signifikant die AUC0-61 um 25% und die Cmax um 18% kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch in Rückenlage war die AUC0-61 und die Cmax im Trend kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rückenlage und Linksseitenlage im Trend erst später erreicht.
Die Ergebnisse der Tablette und Kapsel spiegelten größtenteils die Ergebnisse der Wasserentleerung wider, wodurch die enorme Bedeutung der Magenentleerung als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Pharmakokinetik verschiedener schnell zerfallender Darreichungsformen abermals belegt wurde. Die durchschnittliche AUC0-61 in Linksseitenlage war um 33% und statistisch signifikant kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch die AUC0-61 in Rechtsseitenlage war signifikant größer als in Linksseitenlage. Im Trend wurde das durchschnittliche tmax nach Einnahme der Hartkapsel in Linksseitenlage erst später erreicht und das durchschnittliche Cmax war kleiner. Im Trend flutete die Hartkapsel in Rückenlage langsamer an als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage und schneller als in Linksseitenlage.
Die Tablette flutete, im Gegensatz zur Magenentleerung von Wasser, im Trend geringgradig schneller in Rechtsseitenlage an als in aufrechter Körperposition. Der Grund für diese besonders schnelle Wirkstoffanflutung in Rechtsseitenlage war vermutlich, dass die Tablette direkt ins Antrum fiel, aufgrund der Motilität dort schneller desintegrierte oder sogar in den Dünndarm entleert wurde, was wiederum zu noch steileren Profilen führte. Statistisch war die durchschnittliche AUC0-61 dementsprechend in Rechtsseitenlage signifikant größer als in Rücken- und Linksseitenlage. Auch die maximal erreichte Konzentration (Cmax) war statistisch signifikant höher in Rechtsseitenlage als in Linksseitenlage. Die AUC0-61 in Linksseitenlage war ebenfalls statistisch signifikant um durchschnittlich 41% kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rücken- und Linksseitenlage im Trend später erreicht als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage.
Die Daten der Studie zeigten, dass auch die Lag time von Darreichungsformen körperpositionsabhängig waren. Statistisch war die durchschnittliche Lag time nach Einnahme der Tablette in Rechtsseitenlage signifikant kürzer als in Linksseitenlage.
Die Daten zeigten außerdem, dass die Körperposition vor allem für Darreichungsformen mit langer Desintegrationszeit einen wichtigen Einflussfaktor auf das Anflutungsverhalten hatte, da zum Zeitpunkt des Starts der Desintegration bereits vermehrt Wasser aus dem Magen entleert wurde. Besonders bei schlechter löslichen Arzneistoffen könnte demnach der Einfluss der Körperposition noch deutlich gravierender ausfallen. Die Daten zeigten dennoch, dass auch gut lösliche Arzneistoffe teilweise über Stunden im Magen verweilen und zu Doppelpeaks führen können.
Für biopharmazeutische Modellierungen, wie beispielsweise PBPK Modelle, ist der Unterschied zwischen der Magenentleerung in aufrechten Körperposition und in Rückenlage besonders von Bedeutung, da die Modelle häufig auf MRT Daten basieren, welche in Rückenlage akquiriert werden. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Hartkapsel war in aufrechter Körperposition um 24% größer als in Rückenlage. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Tablette war in aufrechter Körperposition um 52% größer als in Rückenlage. Da die im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Unterschiede den potenziell enormen Einfluss der Körperposition für Modellierungen bei der Arzneimittelentwicklung sowie für die klinische Praxis mit liegenden Patienten unterstreichen, ist eine weitere Abklärung des Einflusses der Körperposition unter anderem auch im postprandialen Zustand empfehlenswert.
Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören zu den Haupttodesursachen in der westlichen Bevölkerung. Die Morbidität und Mortalität der Herzinsuffizienz und ischämischer Erkrankungen sind trotz vielfältiger Therapieansätze weiterhin sehr hoch. Bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) konnte hinsichtlich der Genexpression des Carnitin-Transporters OCTN2 eine deutliche Reduktion festgestellt werden. Diese korrelierte signifikant mit einer verminderten Ejektionsfraktion (EF) und stellt somit einen möglichen Risikofaktor für die Entwicklung bzw. Progression einer DCM dar. Physiologisch ist die OCTN2-vermittelte Carnitin-Aufnahme von besonderer Bedeutung für die Energiegewinnung der Zelle über die Betaoxidation. Zusätzlich zu dieser endogenen Verbindung können jedoch auch zahlreiche Arzneistoffe, wie Mildronat, von OCTN2 transportiert werden und die Carnitin-Aufnahme hemmen. Ein Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es demzufolge, den Einfluss einer verminderten OCTN2-Funktion auf die Entwicklung einer DCM, anhand hämodynamischer Analysen (MRT und Konduktanz-Katheter-Technik) zu überprüfen. Dafür wurden Mäuse, die homo- oder heterozygot eine Mutation im Octn2-Gen (Slc22a5) aufwiesen (sogenannte juvenile viscerale Steatose-Mäuse) und entsprechende Kontrolltiere als Modell verwendet. Die heterozygot-defizienten Tiere unterschieden sich dabei sowohl hinsichtlich des Gehalts an freiem Carnitin im Serum und im Herzgewebe als auch hinsichtlich der hämodynamischen Parameter (wie z. B. EF, LVRI und dP/dtmin) nur wenig von den Kontrollen. Die Modulation des Carnitin-Spiegels durch pharmakologische Intervention mit Mildronat ging zwar mit einer Verminderung des Carnitin-Spiegels einher, resultierte jedoch nicht in einer pathophysiologisch veränderten Herzfunktion. Interessanterweise deuten einige kardiale und molekularbiologische Parameter (wie z. B. EF und NT-proBNP-Gehalt) unter Hemmung des OCTN2 tendenziell sogar auf eine leicht verbesserte Herzfunktion hin. Außerdem wurde in diesem Tiermodell auch der Einfluss der OCTN2-Funktion und damit der Carnitinversorgung für das Ausmaß der Gewebeschädigung beim akuten Myokardinfarkt untersucht. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls keine negativen Auswirkungen bei verminderter OCTN2-Funktion. Sie sprachen im Gegenteil für eine protektive Wirkung eines reduzierten Carnitin-Spiegels hinsichtlich Ischämie-bedingter kardialer Schädigungen. So zeigte sich ein deutlicher Gendosis-Effekt hinsichtlich Carnitin-Spiegel und Infarktareal, der durch Carnitin-Applikation teilweise wieder aufgehoben werden konnte. Insgesamt ist aus den Untersuchungen zur kardialen Bedeutung von OCTN2 hervorgegangen, dass eine moderate Beeinträchtigung der Transportfunktion und damit der Carnitin-Spiegel keinen negativen Einfluss auf die Herzfunktion besitzt.
Transportproteine und metabolisierende Enzyme sind wesentliche Bestandteile der intestinalen Absorptionsbarriere und entscheidend für die Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Exkretion von Nährstoffen, Arzneimitteln oder Xenobiatika. Es gibt Hinweise darauf, dass sowohl deren Expression als auch Funktion im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen beeinträchtigt sind. Um die Auswirkung von Colitis Ulcerosa auf das lokale Expressionsmuster klinisch relevanter intestinaler Transporter und Enzyme abschätzen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit u.a. deren Genexpression, Proteingehalt sowie mögliche krankheitsbezogene Regulationsmechanismen untersucht. Mit Biopsien aus entzündetem und nicht entzündetem Gewebe von 10 Colitis Ulcerosa-Patienten als auch mit gesundem Kolongewebe ohne Entzündungszeichen wurden mittels real-time quantitative PCR mRNA- (9 Enzyme, 15 Transporter, 9 Zytokine) und microRNA- (N = 54) Expressionsanalysen durchgeführt. Der Proteingehalt wurde durch validierte HPLC-MS/MS targeted proteomics Verfahren ermittelt. Die Genexpression folgender Enzyme und Transporter zeigten sich während intestinaler Entzündung signifikant reduziert: CYP2B6, CYP2C9, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15, ABCB1, ABCG2, SLC16A1 und SLC22A3. Ein signifikanter Anstieg der mRNA-Level im entzündeten Gewebe von Colitis Ulcerosa-Patenten konnte für ABCC1, ABCC4, ORCTL2 und OATP2B1 nachgewiesen werden. Bezogen auf den Proteingehalt ließen sich die auf mRNA Ebene beobachteten Expressionsunterschiede nur für MCT1 bestätigen. Korrelationsanalysen demonstrierten den möglichen Einfluss von Zytokinen und microRNAs auf die Regulation intestinaler Enzym- und Transporterexpression. Insbesondere scheinen TNFα, IL17 A sowie miR-142-3p/5p, miR-146a-5p und miR 223-3p starken Einfluss auf krankheitsbezogene Expressionsmuster zu besitzen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Colitis Ulcerosa mit komplexen Veränderungen in der intestinalen Expression von metabolisierenden Enzymen, Transportern, Zytokinen und microRNAs einhergeht, welche sowohl Auswirkungen auf die medikamentöse Therapie als auch auf die Pathogenese der Erkrankung selbst haben können.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Die Sicherheit und Wirksamkeit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von Transportproteinen beeinflusst. Die zelluläre Lokalisation von Transportern hat hierbei wesentlichen Einfluss darauf, ob diese als funktionelle Aufnahme- oder Effluxtransporter fungieren. Für den menschlichen Darm ist die Lokalisation einiger Transporter noch unklar. Ein Beispiel hierfür ist der organic cation transporter (OCT1), welcher für die intestinale Aufnahme zahlreicher kationischer Arzneistoffe, wie beispielsweise Morphin verantwortlich gemacht wird. Bisher gibt es allerdings widersprüchliche Aussagen über die exakte Lokalisation dieses Transporters in der Zellmembran von Enterozyten. Folglich ist die tatsächliche Bedeutung dieses Proteins für die Absorption von Arzneistoffen bis heute ungeklärt.
Daher war das Ziel dieser Arbeit die Expression, Lokalisation und Funktion von OCT1 in Enterozyten anhand verschiedener labortechnischer Methoden näher zu charakterisieren.
Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde versucht die Lokalisation von OCT1 im Zellmodell zu bestimmen. Ebenfalls im Zellmodell erfolgte die Untersuchung des vektoriellen Transportes von Morphin mittels Transwellassay. Diese, sowie entsprechende Analysen vitalen intestinalen Gewebes in der Ussing-Kammer, wurden genutzt, um indirekt Rückschlüsse auf die Transporterlokalisation zu ziehen.
Trotz eindeutiger und der Hypothese entsprechender Expression und Funktion in MDCKII-OCT1/P-gp-Zellen, konnten im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Caco-2-Zellen generiert werden.
Caco-2-Zellen sollten als Zellmodell für Enterozyten, insbesondere hinsichtlich der Charakterisierung von OCT1, neu bewertet werden, da aktuellen Erkenntnissen entsprechend möglicherweise keine signifikante Expression von OCT1 in diesen Zellen vorliegt. Auch das genutzte OCT1-Modellsubstrat Morphin ist möglicherweise problematisch. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei den vorliegenden Daten aufgrund der geringen Versuchszahl nur um vorläufige Ergebnisse handeln kann, welche in zukünftigen Arbeiten verifiziert werden sollten.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die vorliegende Arbeit zwar keine neuen Erkenntnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Enterozyten erbringen konnte, jedoch die Bedeutung eines kritischen Umgangs mit etablierten Methoden und deren Ergebnissen unterstreicht.
Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorgängen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-tät zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen präsentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das größte Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-ständig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich möglicherweise auch auf die OATPs über-tragen lassen. Für diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformationsänderung führt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein befördert. Eine Möglichkeit derartige Konformationsänderungen, die mit einer Verschiebung der Abstände innerhalb des Moleküls einhergehen, zu untersuchen, stellt der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt.
Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er für die Untersuchung mittels FRET zugänglich werden würde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, während EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellulären Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellulären Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung führte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membranäre Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zunächst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abhängigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellulä-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-stände innerhalb des Moleküls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise Übereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abstände mit denen computergestützter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzuklären. Außerdem stützen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen ließen. Es konnte für fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abhängigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgeprägte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid führte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten Änderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abständen der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem ähn-lichen Prinzip folgt, wie es für den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 führen zu einer Abstandsänderung innerhalb des Moleküls, die sich am ehesten über eine Konformationsänderung erklären ließe.
Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsfähigen FRET-Fusionsproteins möglich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Außerdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren für Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten geklärt werden.
OCT1 and OCT2 are polyspecific membrane transporters that are involved in hepatic and renal drug clearance in humans and mice. In this study, we cloned dog OCT1 and OCT2 and compared their function to the human and mouse orthologs. We used liver and kidney RNA to clone dog OCT1 and OCT2. The cloned and the publicly available RNA-Seq sequences differed from the annotated exon-intron structure of OCT1 in the dog genome CanFam3.1. An additional exon between exons 2 and 3 was identified and confirmed by sequencing in six additional dog breeds. Next, dog OCT1 and OCT2 were stably overexpressed in HEK293 cells and the transport kinetics of five drugs were analyzed. We observed strong differences in the transport kinetics between dog and human orthologs. Dog OCT1 transported fenoterol with 12.9-fold higher capacity but 14.3-fold lower affinity (higher KM) than human OCT1. Human OCT1 transported ipratropium with 5.2-fold higher capacity but 8.4-fold lower affinity than dog OCT1. Compared to human OCT2, dog OCT2 showed 10-fold lower transport of fenoterol and butylscopolamine. In conclusion, the functional characterization of dog OCT1 and OCT2 reported here may have implications when using dogs as pre-clinical models as well as for drug therapy in dogs.
Pentathiepins are polysulfur-containing compounds that exert antiproliferative and cytotoxic activity in cancer cells, induce oxidative stress and apoptosis, and inhibit glutathione peroxidase (GPx1). This renders them promising candidates for anticancer drug development. However, the biological effects and how they intertwine have not yet been systematically assessed in diverse cancer cell lines. In this study, six novel pentathiepins were synthesized to suit particular requirements such as fluorescent properties or improved water solubility. Structural elucidation by X-ray crystallography was successful for three derivatives. All six underwent extensive biological evaluation in 14 human cancer cell lines. These studies included investigating the inhibition of GPx1 and cell proliferation, cytotoxicity, and the induction of ROS and DNA strand breaks. Furthermore, selected hallmarks of apoptosis and the impact on cell cycle progression were studied. All six pentathiepins exerted high cytotoxic and antiproliferative activity, while five also strongly inhibited GPx1. There is a clear connection between the potential to provoke oxidative stress and damage to DNA in the form of single- and double-strand breaks. Additionally, these studies support apoptosis but not ferroptosis as the mechanism of cell death in some of the cell lines. As the various pentathiepins give rise to different biological responses, modulation of the biological effects depends on the distinct chemical structures fused to the sulfur ring. This may allow for an optimization of the anticancer activity of pentathiepins in the future.
Course of disease and risk factors for hospitalization in outpatients with a SARS-CoV-2 infection
(2022)
We analyzed symptoms and comorbidities as predictors of hospitalization in 710 outpatients in North-East Germany with PCR-confirmed SARS-CoV-2 infection. During the first 3 days of infection, commonly reported symptoms were fatigue (71.8%), arthralgia/myalgia (56.8%), headache (55.1%), and dry cough (51.8%). Loss of smell (anosmia), loss of taste (ageusia), dyspnea, and productive cough were reported with an onset of 4 days. Anosmia or ageusia were reported by only 18% of the participants at day one, but up to 49% between days 7 and 9. Not all participants who reported ageusia also reported anosmia. Individuals suffering from ageusia without anosmia were at highest risk of hospitalization (OR 6.8, 95% CI 2.5–18.1). They also experienced more commonly dyspnea and nausea (OR of 3.0, 2.9, respectively) suggesting pathophysiological connections between these symptoms. Other symptoms significantly associated with increased risk of hospitalization were dyspnea, vomiting, and fever. Among basic parameters and comorbidities, age > 60 years, COPD, prior stroke, diabetes, kidney and cardiac diseases were also associated with increased risk of hospitalization. In conclusion, due to the delayed onset, ageusia and anosmia may be of limited use in differential diagnosis of SARS-CoV-2. However, differentiation between ageusia and anosmia may be useful for evaluating risk for hospitalization.
Eine Thrombose ist eine Gefäßerkrankung, bei der eine lokalisierte, intravasale Blutgerinnung zur Bildung eines Thrombus in einem Gefäß führt. Die Aktivierung der
Blutgerinnungskaskade und damit der Gerinnungsfaktoren führt zu einer Bildung sowie Quervernetzung von Fibrin und so zur Entstehung eines Thrombus. Dieser wird
physiologisch über die Fibrinolyse abgebaut. Die Serinprotease PAI-1 inhibiert diese und wirkt somit prothrombotisch. Jüngste Studien haben gezeigt, dass S1P als Schlüsselmolekül des Immunsystems und des Metabolismus auch das Gerinnungssystem beeinflusst und in einer wechselseitigen Beziehung mit dem Gerinnungsfaktor Thrombin und seinen PARs steht. Die S1P-Konzentration im Körper korreliert dabei eng mit dem BMI. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Wirkung des Signallipids S1P auf die PAI-1-Expression von Fettzellen und damit die Stellung der Adipozyten bei S1P-vermittelten thrombotischen Ereignissen in vitro. Weiterhin wurde
erstmalig die Wechselwirkung von Thrombin und S1P bei der Produktion von PAI-1 in Fettzellen untersucht. Hierfür wurden 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten differenziert
und mit S1P stimuliert. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Steigerung der PAI-1-mRNA. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls von anderen Arbeitsgruppen
bestätigt. Der S1P-Effekt ließ sich auch mittels Western Blot-Analyse auf Proteinebene darstellen. Dabei zeigte sich eine starke Steigerung der PAI-1-Expression und
Sekretion von 3T3-L1-Zellen. S1PR-2- und S1PR3-Inhibitoren senkten den S1Pvermittelten Anstieg, sodass S1P über eine S1PR-2- und, bisher in der Literatur noch
nicht beschrieben, auch über eine S1PR-3-Aktivierung einen prothrombotischen Einfluss ausübt. Weiterhin konnte nach Stimulation mit S1P erstmalig eine Expressionssteigerung von PAR-1 und damit eine Wechselwirkung zwischen dem Signalweg von Thrombin und S1P in Adipozyten beobachtet werden. Es wurde die
Hypothese aufgestellt, dass Thrombin über den PAR-1 die Aktivität der Enzyme des S1P-Metabolismus steigert und so über eine endogene S1P-Produktion zu einer zusätzlichen Steigerung von PAI-1 führt. Diese konnte bisher noch nicht bestätigt werden, da lediglich eine geringe, jedoch nicht signifikante Steigerung von PAI-1 nach Thrombin-Stimulation beobachtet werden konnte. Somit ist das Fettgewebe ein wichtiges Bindeglied zwischen dem inflammatorischen Lipid S1P sowie dem Enzym PAI-1 und damit als Gewebe ein bisher stark unterschätzter Einflussfaktor bei der Entstehung und Aufrechterhaltung thrombotischer Ereignisse.
Das Glioblastom ist ein WHO Grad 4-Tumor und einer der häufigsten und zugleich agressivsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Trotz multimodaler Therapie, die eine neurochirurgische Resektion sowie eine adjuvante Radiochemotherapie und als neuen Therapieansatz eine Kombination aus Temozolomid und tumor treating fields umfasst, ist die Prognose weiterhin schlecht, sodass der Suche nach neuen therapeutischen Zielstrukturen eine maßgebliche Bedeutung zukommt. Für verschiedene Tumorentitiäten konnte gezeigt werden, dass die Überexpression einzelner onkogener Kinasen die Tumorprogression vorantreibt, wobei bei Glioblastomen gezeigt werden konnte, dass die Serin-Threonin-Kinase Pim1 eine wichtige Rolle in der Pathogenese einnimmt.
In den Fokus rücken zunehmend auch stammzellähnliche Tumorzellen, die eine Subpopulation innerhalb von Glioblastomen darstellen und das aggressive biologische Verhalten sowie die Resistenz gegenüber der Standardtherapie und eine hohe Rezidivrate vermitteln können.
In dieser Arbeit sollte dementsprechend basierend auf den bisherigen Erkenntnissen zu Pim1 sowie zur Bedeutung von Tumorstammzellen im malignen Geschehen der Einfluss der Serin-Threonin-Kinase Pim1 auf das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen näher untersucht werden.
Durch den Vergleich von adhärent wachsenden Tumorzellen der Glioblastomzelllinie LN-18 mit stammzellähnlichen LN-18 Neurosphären konnte eine erhöhte relative mRNA-Expression von Pim1 und EGFR sowie der potentiellen Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Musashi-1 nachgewiesen werden. Die relative Proteinexpression von Pim1 sowie der Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Sox2 war in den Neurosphären im Vergleich zu den adhärent wachsenden LN-18 Zellen ebenfalls gesteigert. Diese Daten konnten durch die Immunfluoreszenz-Färbungen bestätigt werden.
Ein effizienter siRNA-vermittelter knockdown von Pim1 auf Proteinebene konnte in dieser Arbeit nicht erzielt werden, sodass keine Aussagen zu einer Regulation von Stammzell- und Differenzierungsmarker nach zielgerichteter genetischer Abschaltung von Pim1 getroffen werden konnten. Hier sind weiterführend Optimierungen notwendig oder der Einsatz spezieller CRISPR-Cas9-Verfahren zur genetischen Ausschaltung sinnvoll.
Die pharmakologische Inhibition von Pim1 mit LY294002 und TCS Pim1-1 führte zu einer signifikanten Reduktion der Neurosphärenformation sowie der Zellviabilität bei LN-18 Zellen, wodurch die in Vorarbeiten an adhärenten Glioblastomzellen gewonnenen Daten um Untersuchungen an stammzellartigen Glioblastomzellen erweitert wurden.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit erhobenen Daten nahe, dass Pim1 das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen beeinflusst, indem Pim1 Einfluss auf die Expression von Stammzellmarkern nimmt und seine Inhibition die Aufrechterhaltung einer Glioblastomstammzellpopulation beeinträchtigt, indem die Neurosphärenformation und die Viabilität der Zellen stark reduziert werden. Somit stellt Pim1 eine geeignete Zielstruktur für eine zielgerichtete Therapieoption beim Glioblastom dar, beispielsweise in Kombination mit der klassischen Radiochemotherapie. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit eine selektive Pim1-Inhibition tatsächlich Einfluss auf die Prognose von Patienten mit Glioblastom nimmt.
In vielen wissenschaftlichen Studien konnte die Bedeutung des NO-cGMP-PKG-Signalweges für die Regulation der Spannung von glatten Muskelzellen gezeigt werden. Im Mittelpunkt standen dabei oftmals die Guanylatzyklase, die Proteinkinase G oder zelluläre Kalziumkanäle und deren Bedeutung für die Muskeltätigkeit. In der vorliegenden Arbeit sollte über Modulatoren der zelluläre cGMP-Spiegel in glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten verändert und durch Messung der Kontraktionsstärken dessen Einfluss auf das Kontraktionsverhalten nachgewiesen werden. Dabei sollte sowohl die Auswirkung von cGMP-Veränderungen auf die Spannung bei maximaler Stimulation als auch auf die Sensitivität für Phenylephrin untersucht werden. Nach Inkubation der Aorten mit einem cGMP-Modulator und Stimulation mit Phenylephrin wurden die Kontraktionen von Aortenringen über Schreiber direkt aufgezeichnet. Als Modulatoren wurden das Urikosurikum Probenecid, der Phosphodiesterasehemmer Sildenafil und der Inhibitor der löslichen Guanylatzyklase ODQ eingesetzt. Ein besonderer Fokus sollte darauf gelegt werden, inwiefern die Hemmung der MRP-Transportproteine 4 und 5 durch Probenecid- und Sildenafilinkubation auf den cGMP-Spiegel und damit die Spannung der glatten Muskelzellen auswirkt. In den Aufzeichnungen der Kontraktionen zeigte sich unter ODQ-Einfluss eine deutlich gesteigerte Spannung in g pro g Aortengewebe (Mw=2761,44*; SEM=236,4; n=9) bei maximaler Stimulation mit Phenylephrin im Vergleich zur Kontrolle (1515,15; 186; n=9). Unter Vorinkubation mit Sildenafil konnten sowohl mit der geringeren Konzentration von 1 µM (689,15*; 163,3; n=5) als auch bei 50 µM (187,17*; 154,5; n=5) signifikant niedrigere Spannungen festgestellt werden. In höherer Konzentration kommt neben der Inhibition der PDE auch der hemmende Einfluss von Sildenafil auf die MRP-Transporter zum Tragen. Auch nach der Inkubation mit Probenecid konnte sowohl mit 10 µM (783,70; 150,7; n=5) als auch mit 100 µM (693,64*; 128,4; n=5) eine verminderte Kontraktion der Gefäße festgestellt werden. Die Untersuchung der Sensitivität der Aorten auf Phenylephrin über Vergleiche der EC50-Werte ergab, dass insgesamt durch den Einsatz von cGMP-Modulatoren keine Veränderungen der Sensitivität verursacht werden. Schlussfolgernd ergibt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit, dass glatte Gefäßmuskulatur über cGMP-Modulatoren hinsichtlich der Maximalspannungen beeinflussbar ist und dass der cGMP-Transport über MRP 4 und 5 für die Kontraktion von glatten Muskelzellen physiologisch bedeutsam zu sein scheint, was neue Möglichkeiten des medikamentösen Eingreifens in die Gefäßregulation eröffnen könnte.
Zusammenfassung In der basalen Populationsstudie SHIP-0 (Study of Health in Pomerania) zeigten sich Assoziationen zwischen dem Zustand parodontaler Gewebsschädigung und dem Magnesiumserumspiegel. Außerdem ließen sich in SHIP-0 bei Einnahme magnesiumhaltiger Medikamente auch positive Wirkungen auf den Zahnhalteapparat erkennen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, diese Tendenzen im Rahmen der 5-Jahres-Folgestudie SHIP-1 zu verifizieren. Zu diesem Zwecke wurden die an SHIP-1 teilnehmenden Probanden zur Beziehung ihres basalen Magnesium/Kalzium-Verhältnisses zur Progression ihres parodontalen Zustands untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Bei einem hohen Magnesiumserumspiegel findet eine Verlangsamung der parodontalen Gewebedestruktion statt. 2. Es bestehen deutliche Dosis-Wirkungsbeziehungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses im Serum zum parodontalen Status. 3. Der Magnesium-Effekt tritt unabhängig von vorhandenen zusätzlichen Risikofaktoren auf. Dies betrifft vor allem Bildung, Diabetes, Rauchen und das Alter. 4. Die Kombination aus weiblichem Geschlecht und Diabetes ist die wichtigste Ursache für ein geringes Magnesium/Kalzium-Verhältnis. 5. Ein hohes Gesundheitsbewusstsein, gekennzeichnet durch eine hohe Bildung und Nichtrauchen, ist mit einem hohen Magnesium/Kalzium-Status assoziiert. 6. Es nahmen von 4290 Probanden der SHIP-0 nur noch 3300 an SHIP-1 teil, deren Risikofaktorenverteilung sich verändert hat. Das follow-up ist daher nicht mehr bevölkerungs-repräsentativ, da besonders risikobelastete Patienten fernblieben. Diese Arbeit gibt damit einen Ausblick auf die möglichen Wirkungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses und dessen Einfluss auf den Zahnhalteapparat. Ob sich durch Magnesiumeinnahme ein positiver Effekt auf die parodontale Situation erreichen lässt, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden.
Die unterschiedlichen gesetzlichen Bestimmungen hinsichtlich der Durchführung von Obduktionen in den beiden gewählten Untersuchungsabschnitten wirkten sich erheblich sowohl auf die Obduktionshäufigkeit als auch auf die Zusammensetzung des Obduktionsmaterials aus. Das Verhältnis von natürlichen zu nichtnatürlichen Todesfallen hatte sich im zweiten gegenüber dem ersten Untersuchungsabschnitt eindeutig zugunsten der natürlichen Todesfälle verschoben. Die gleichfalls festgestellte prozentuale Zunahme der Fälle mit alkoholinduzierten Organbefunden von 10,5% im ersten auf' 26,4% im zweiten Zeitraum dürfte auf den vorher genannten Umständen nur zum Teil zurück -zuführen sein. Ansonsten dokumentiert sich dadurch eine tatsächliche Zunahme alkoholbedingter Organschäden. Als Indiz für einen zunehmenden Alkoholmissbrauch ist nicht allein nur die Zunahme der alkoholbedingten Organveränderungen im zweiten Untersuchungsabschnitt anzusehen, sondern auch die im gleichen Zeitraum registrierte höhere Anteile der alkoholassoziierten Todesfälle, der Anstieg der durchschnittlichen Blutalkoholkonzentration bei Todeseintritt sowie auch das geringere Durchschnittsalter der Obduzierten mit alkoholbedingten Organveränderungen.
Viele periphere Blutzellen exprimieren ABC-Transporter an ihrer Zelloberfläche. Insbesondere konnten ABCC4 (MRP4) und ABCC5 (MRP5), die in Plasmamembranen verschiedener peripherer Blutzellen identifiziert wurden, spezifische Funktionen für die entsprechenden Zellpopulationen, wie z.B. die Mediatorspeicherung in den dichten Granula der Thrombozyten zugewiesen werden. Alle reifen Blutzellen stammen von derselben Stammzelle ab, sodass man annehmen muss, dass sich die spezifische Funktionalität und die dazugehörige zelluläre Ausstattung erst im Verlauf der Differenzierung ausbilden. Inwiefern sich diese Prozesse während der Differenzierung auf die Expression und Lokalisation von MRP4 und MRP5 auswirken, wurde bisher nicht untersucht. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Zellmodell zur Isolierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt. Dies beinhaltete zudem die Behandlung CD34-positiver Zellen mit bestimmten Wachstumsfaktoren zur Differenzierung in die thrombozytäre und die myelomonozytäre Richtung. Darüber hinaus wurden die Leukämiezelllinien K562 und HL60 mit PMA, DMSO und Butyrat ausdifferenziert. Erstere in Richtung Thrombozyten, letztere in Richtung Makrophagen, Granulozyten und Monozyten. Der Differenzierungsnachweis wurde mittels FACS-Analyse geführt und die Expression von MRP4 und MRP5 im Anschluss auf mRNA und Protein-Ebene, mittels Real-Time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Akkumulationsassay erforscht. In den thrombozytär differenzierten CD34-positiven Zellen fand sich ein signifikant positiv korreliertes Verhältnis von MRP4 zu CD41a (Glykoprotein IIb/IIIa), hingegen eine negative Korrelation von MRP5 zu CD41a. Außerdem konnte im Laufe der Differenzierung in der Immunfluoreszenz eine zunehmende intrazelluläre Expression von MRP4 und eine Kolokalisation mit LAMP-2, einem Lysosomen- und Dense-Granula-Marker, gezeigt werden. Die myelomonozytären Zellen wiesen eine signifikante Reduktion an MRP4 und ebenfalls eine Verminderung der MRP5-Expression auf. In der Differenzierung der leukämischen Zelllinien wurde eine generelle Zunahme von MRP4 und MRP5 mit der Entdifferenzierung der Zellen in allen Linien gefunden. Die komplexen Vorgänge im Verlauf der menschlichen Hämatopoese umfassen also auch Veränderungen an MRP4- und MRP5-Expression in Qualität und Quantität. Sowohl in der physiologischen als auch in der pathologischen Zellentwicklung findet sich eine Regulation dieser beiden Transporter. Die Ergebnisse der Arbeit stützen die Annahme, dass MRP4 eine wichtige Rolle im Metabolismus der Thrombozyten spielt, hier besonders in der Speicherung und Freisetzung von cGMP, ADP und Serotonin. Die Transporterexpression in den Leukämiezelllinien steigt mit der Entdifferenzierung der Zellen. Aus dieser Erkenntnis ergeben sich therapeutische Überlegungen, Differenzierungsagenzien zur Überwindung der Multi-Drug-Resistenz mit Chemotherapeutika zu kombinieren.
Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist außerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutplättchen nachgewiesen und kann zelltypabhängig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulär lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von Überträgersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Änderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormoleküle über eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molekül ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle für Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Dafür erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschließende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. Während eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 über seine PDZ-Domäne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leukämiezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kofärbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulären Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Änderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulär. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgeführt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beiträgt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begünstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
Die Physiologie des Magens mit den unterschiedlichen Gegebenheiten im proximalen und distalen Magen stellt einen relevanten Einflussfaktor auf die Pharmakokinetik von oral applizierten Wirkstoffen dar. Innerhalb der peroralen Pharmakotherapie nimmt die Sondenapplikation von Arzneimitteln dabei eine Sonderrolle ein, da je nach Lokalisation des Sondenendes die Applikation tendenziell eher in proximale oder distale Anteile des Magens erfolgt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Pharmakokinetik bei Sondenapplikation hinsichtlich der Variablen Sondenlage‚ Nahrungsaufnahme und Nüchternmotilität. Hierzu wurde in einer kontrollierten, randomisierten, drei-armigen Cross-Over-Studie an zwölf gesunden, männlichen Probanden 540 mg einer Paracetamol-Suspension über einen Zeitraum von sechs Stunden jeweils in den distalen und proximalen Magen infundiert. Unsere Ergebnisse konnten zeigen, dass die Bedingungen „proximale Applikation“ und „Nahrungsaufnahme“ die Wahrscheinlichkeit einer Retention im proximalen Magen erhöht. Merkmale hierfür waren größere Abweichungen der Invasionskinetik von der Applikationsrate im Sinne einer verspäteten Anflutung, vermehrt Schwankungen der Invasionsrate und mehr Nachflutungen in der Eliminationsphase. Umgekehrt ging die distale Applikation mit einer größeren Kontinuität der Invasion einher. Hinsichtlich der Invasionskinetik häuften sich bei Nahrungskarenz und proximaler Sondenlage Merkmale, die für einen Einfluss der interdigestiven Motilität auf die Pharmakokinetik sprechen. Limitiert wurde die Aussagekraft zum Einfluss der Nüchternmotilität durch das Fehlen einer simultanen Aufzeichnung der Motilität, zum Beispiel mittels elektrischer Impedanzmessung. Die angewandte Methodik mit kontinuierlicher Infusion der Prüfsubstanz, regelmäßigen Messungen der Serumkonzentration und Berechnung der Invasionskinetik mittels schneller Fouriertransformation erwies sich zur Untersuchung der Fragestellung als gut geeignet und kann als Grundlage zukünftiger Forschungen dienen.
Die optimale Behandlung von Patienten mit einer akuten Pankreatitis hängt stark von der frühen Prognose des Verlaufs der Erkrankung ab. In 80% der Fälle verläuft die akute Pankreatitis mild und die Patienten verlassen innerhalb einer Woche beschwerdefrei das Krankenhaus. Bei. 20% der Patienten nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Komplikationen wie z.B. SIRS, Sepsis. Diese Patienten entwickeln (infizierte) Pankreasnekrosen, (Multi)-Organversagen und benötigen eine intensivmedizinische Betreuung. In 10-20% endet die schwere akute Pankreatitis tödlich. Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine validen Marker die zuverlässig den Schweregrad der akuten Pankreatitis vorhersagen. Mustererkennungsrezeptoren sind Teil des angeborenen Immunsystems und dienen als Sensoren für pathogen bakterielle Bestandteile. Nach Erkennen der Bakterien werden pro- und anti-inflammatorische Immunantworten eingeleitet, die für die Eliminierung der Bakterien zuständig sind. Zur Familie der Mustererkennungsrezeptoren gehören u.a. die Toll-like Rezeptoren und die Nod-like Rezeptoren. Viele Studien konnten Assoziationen zwischen Mutationen in Mustererkennungsrezeptoren und immunologischen Erkrankungen aufzeigen. Die am besten untersuchten Assoziationen sind die zwischen Morbus Crohn und Mutationen in Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) oder Nod-like Rezeptor 2 (NOD2). Mutationen in diesen Rezeptoren führen zu einem Funktionsverlust der Rezeptoren und verhindern eine effektive Eliminierung von Bakterien. Dadurch wird z.B. die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn begünstigt. Während der akuten Pankreatitis, einer primär sterilen Inflammation, bilden sich bei einem schweren Verlauf, durch in das Pankreas translozierende Darmbakterien, (infizierte) Pankreasnekrosen. Die Annahme, dass ein Funktionsverlust der Mustererkennungsrezeptoren TLR4 oder NOD2 den Schweregrad der akuten Pankreatitis und das Ausbilden infizierter Pankreasnekrosen beeinflusst, sollte in dieser Arbeit sowohl bei Patienten mit akuter Pankreatitis als auch im Tiermodell der Nod2-knock-out Maus überprüft werden. Mutationen im Toll-like Rezeptor 4 wurden in dieser Arbeit weder als Risikofaktoren für die akute Pankreatitis, noch den Schweregrad der akuten Pankreatitis oder das Überleben identifiziert. Wir detektierten in Patienten mit akuter Pankreatitis und gesunden Blutspendern für die TLR4 Mutationen Asp299Gly und Thr399Ile vergleichbare Allelfrequenzen. Anders verhielt es sich für die Mutationen im Nod-like Rezeptor 2. Die Mutation Arg702Trp dieses Mustererkennungsrezeptors konnte als ein Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität bei Patienten mit einer schweren akuten Pankreatitis identifiziert werden. Wir können zeigen, dass sich das Risiko, an einer schweren akuten Pankreatitis zu versterben bei heterozygoten Mutationsträgern auf 2,5 und bei Homozygoten auf das 9-fache erhöht. Mutationen in Arg702Trp führten allerdings nicht vermehrt zur Entwicklung von Sepsis oder (infizierten) Pankreasnekrosen. Lediglich die Häufigkeit ein Multiorganversagen zu entwickeln, war bei Mutationsträgern signifikant erhöht. Die beiden anderen untersuchten NOD2 Mutationen (Gly908Arg und Leu1007fsinsC) hatten keinen signifikanten Effekt auf die Entwicklung einer akuten Pankreatitis. Untersuchungen der Rolle einer Nod2-Defizienz im experimentellen Mausmodell der schweren nekrotisierenden Pankreatitis zeigten einen im Vergleich zum Menschen unterschiedlichen Phänotyp hinsichtlich des Verlaufs der schweren akuten Pankreatitis. Die lokalen Schäden am Pankreas, aber auch die systemischen Reaktionen waren in den ersten 36h nach Induktion der nekrotisierenden Pankreatitis nicht wesentlich verändert. Das Langzeitüberleben (14 Tage) der Nod2-defizienten Mäuse war jedoch deutlich verbessert. Wir stellten in den Nod2 knock-out Tieren sowohl eine persistierende intestinale Barrierestörung, als auch eine epitheliale Barrierestörung der Lunge fest. Als Konsequenz war bereits in den unbehandelten Nod2-defizienten Tiere eine erhöhte bakterielle Translokation und eine erhöhte Neutrophilentransmigration ins Gewebe sichtbar. Durch die Barrierestörungen entwickeln die Nod2 knock-out Mäuse eine Toleranz gegenüber den infiltrierenden Bakterien. Diese Toleranzentwicklung kommt 48h nach Induktion der Pankreatitis zum Tragen. Zu diesem Zeitpunkt stellt sich bei den Nod2-defizienten Mäusen ein hypoinflammatorischer Zustand ein. Im Vergleich dazu verstarben die Wildtyp-Mäuse an den Folgen sekundärer Infektionen und einem daraus resultierenden Organversagen. Die NOD2 Mutation Arg702Trp ist somit ein Risikofaktor und potentieller genetischer Prognosemarker für eine erhöhte Mortalität in Folge einer schweren akuten Pankreatitis. Der Funktionsverlust von NOD2 beeinflusst den systemischen Verlauf der schweren akuten Pankreatitis und trägt zu einer deregulierten inflammatorischen Antwort und verschlechterten bakteriellen Kompensation bei. Der lokale Schaden am Pankreas während der schweren akuten Pankreatitis ist dagegen vergleichbar zwischen Patienten mit und ohne NOD2 Arg702Trp Mutation. Ursächlich für das bessere Überleben der NOD2 knock-out Mäuse ist vermutlich die induzierte Barrierestörung, die eine bakterielle Toleranz in diesen knock-out Mäusen induziert. Dadurch wird unter schwerer akuter Pankreatitis eine Entgleisung des Immunsystems verhindert und die bakterielle Translokation in die Organe deutlich effizienter kompensiert. Vergleichende Untersuchungen mit einem knock-out/knock-in Model der NOD2 Mutation Arg702Trp könnten dazu beitragen den Pathomechanismus dieser spezifischen NOD2-Mutation im Menschen weiter aufzuschlüsseln.
Der Nukleäre Rezeptor SHP1 ist ein zentrales Stellglied zahlreicher biologischer Prozesse. So reguliert SHP1 über direkte Protein-Protein-Interaktion mit Nukleären Rezeptoren Stoffwechselwege, wie den Gallensäure-, Cholesterin- und Lipidmetabolismus sowie die Glucosehomöostase und den Arzneimittelstoffwechsel. Erweiternd konnte kürzlich ein tumorsupprimierender Effekt des SHP1 gezeigt werden. So wurde die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms im Mausmodell in Abwesenheit des SHP1 beschrieben. Es ist bekannt, dass SHP1 nicht nur in hepatischem Gewebe, sondern auch in Lunge, Herz, Milz, Dünndarm, Pankreas, Niere, Nebenniere und Hirn exprimiert ist. In einer orientierenden Expressionsanalyse konnten wir eine verminderte SHP1 Expression in Tumorentitäten der Organe Niere, Lunge und Magen zeigen. Diese Ergebnisse konnten in den Proben einer Kohorte von an einem klarzelligen Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten verifiziert werden. Es zeigte sich eine signifikant verminderte SHP1 Expression im klarzelligen Nierenzellkarzinom (RCC) im Vergleich zu Nierengewebe. Nachfolgend konnten wir mittels adenoviral vermittelter Überexpression des SHP1 in einem Zellmodell des RCC einen antiproliferativen Effekt des SHP1 im RCC zeigen. Bisher wurde die Vermittlung dieser antiproliferativen Komponente über eine Hemmung des CyclinD1 durch SHP1 vermutet. Zwar konnten wir im Einklang hiermit eine verminderte CyclinD1 Expression im RCC gegenüber Niere detektieren, nach Überexpression des SHP1 zeigte sich jedoch keine Suppression des CyclinD1, so dass davon auszugehen ist, dass die antiproliferative Wirkung des SHP1 im RCC über andere Zielstrukturen vermittelt wird. Da sich das RCC durch eine hohe Chemotherapieresistenz auszeichnet und SHP1 in den Arzneimittelstoffwechsel involviert ist, untersuchten wir den Einfluss des SHP1 auf die Chemosensitivität des RCC. Hier konnten wir zunächst keinen Einfluss des SHP1 auf die Viabilität des zellulären Modells des RCC durch die Substanzen Vinblastin, Temsirolimus und Sunitinib zeigen. Dennoch ist ein Einfluss des SHP1 auf die Proliferationshemmung durch diese Substanzen nicht auszuschließen. Abschließend untersuchten wir Ursachen für die verminderte SHP1 Expression im RCC. Hier zeigte sich, dass sowohl eine verminderte Expression von Aktivatoren des SHP1 als auch genetischen Varianten in der Promotorregion des SHP1 zunächst nicht ursächlich für die Minderexpression im RCC zu sein scheinen. Zusammenfassend konnten wir den Nukleären Rezeptor SHP1 als Tumorsuppressorgen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms, dessen Pathogenese nach dem heutigen Wissensstand nicht geklärt ist, identifizieren. Basierend auf der antiproliferativen Wirkung könnte der SHP1 zukünftig ein Zielmolekül einer pharmakologischen Therapie des RCC darstellen.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugänglich, neue Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knock-down“ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen Veränderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
Dynamics of Vascular Protective and Immune Supportive Sphingosine-1-Phosphate During Cardiac Surgery
(2021)
Introduction
Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a signaling lipid and crucial in vascular protection and immune response. S1P mediated processes involve regulation of the endothelial barrier, blood pressure and S1P is the only known inducer of lymphocyte migration. Low levels of circulatory S1P correlate with severe systemic inflammatory syndromes such as sepsis and shock states, which are associated with endothelial barrier breakdown and immunosuppression. We investigated whether S1P levels are affected by sterile inflammation induced by cardiac surgery.
Materials and Methods
In this prospective observational study we included 46 cardiac surgery patients, with cardiopulmonary bypass (CPB, n=31) and without CPB (off-pump, n=15). Serum-S1P, S1P-sources and carriers, von-Willebrand factor (vWF), C-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT) and interleukin-6 (IL-6) were measured at baseline, post-surgery and at day 1 (POD 1) and day 4 (POD 4) after surgical stimulus.
Results
Median S1P levels at baseline were 0.77 nmol/mL (IQR 0.61-0.99) and dropped significantly post-surgery. S1P was lowest post-surgery with median levels of 0.37 nmol/mL (IQR 0.31-0.47) after CPB and 0.46 nmol/mL (IQR 0.36-0.51) after off-pump procedures (P<0.001). The decrease of S1P was independent of surgical technique and observed in all individuals. In patients, in which S1P levels did not recover to preoperative baseline ICU stay was longer and postoperative inflammation was more severe. S1P levels are associated with its sources and carriers and vWF, as a more specific endothelial injury marker, in different phases of the postoperative course. Determination of S1P levels during surgery suggested that also the anticoagulative effect of heparin might influence systemic S1P.
Discussion
In summary, serum-S1P levels are disrupted by major cardiac surgery. Low S1P levels post-surgery may play a role as a new marker for severity of cardiac surgery induced inflammation. Due to well-known protective effects of S1P, low S1P levels may further contribute to the observed prolonged ICU stay and worse clinical status. Moreover, we cannot exclude a potential inhibitory effect on circulating S1P levels by heparin anticoagulation during surgery, which would be a new pro-inflammatory pleiotropic effect of high dose heparin in patients undergoing cardiac surgery.
(1) Background: Sepsis is a leading cause of death and a global public health problem. Accordingly, deciphering the underlying molecular mechanisms of this disease and the determinants of its morbidity and mortality is pivotal. This study examined the effect of the rs951818 SNP of the negative costimulatory lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3) on sepsis mortality and disease severity. (2) Methods: 707 consecutive patients with sepsis were prospectively enrolled into the present study from three surgical ICUs at University Medical Center Goettingen. Both 28- and 90-day mortality were analyzed as the primary outcome, while parameters of disease severity served as secondary endpoints. (3) Results: In the Kaplan–Meier analysis LAG-3 rs951818 AA-homozygote patients showed a significantly lower 28-day mortality (17.3%) compared to carriers of the C-allele (23.7%, p = 0.0476). In addition, these patients more often received invasive mechanical ventilation (96%) during the course of disease than C-allele carriers (92%, p = 0.0466). (4) Conclusions: Genetic profiling of LAG-3 genetic variants alone or in combination with other genetic biomarkers may represent a promising approach for risk stratification of patients with sepsis. Patient-individual therapeutic targeting of immune checkpoints, such as LAG-3, may be a future component of sepsis therapy. Further detailed investigations in clinically relevant sepsis models are necessary.
Organic cation transporter 1 (OCT1, SLC22A1) is localized in the sinusoidal membrane of human hepatocytes and mediates hepatic uptake of weakly basic or cationic drugs and endogenous compounds. Common amino acid substitutions in OCT1 were associated with altered pharmacokinetics and efficacy of drugs like sumatriptan and fenoterol. Recently, the common splice variant rs35854239 has also been suggested to affect OCT1 function. rs35854239 represents an 8 bp duplication of the donor splice site at the exon 7-intron 7 junction. Here we quantified the extent to which this duplication affects OCT1 splicing and, as a consequence, the expression and the function of OCT1. We used pyrosequencing and deep RNA-sequencing to quantify the effect of rs35854239 on splicing after minigene expression of this variant in HepG2 and Huh7 cells and directly in human liver samples. Further, we analyzed the effects of rs35854239 on OCT1 mRNA expression in total, localization and activity of the resulting OCT1 protein, and on the pharmacokinetics of sumatriptan and fenoterol. The 8 bp duplication caused alternative splicing in 38% (deep RNA-sequencing) to 52% (pyrosequencing) of the minigene transcripts when analyzed in HepG2 and Huh7 cells. The alternatively spliced transcript encodes for a truncated protein that after transient transfection in HEK293 cells was not localized in the plasma membrane and was not able to transport the OCT1 model substrate ASP+. In human liver, however, the alternatively spliced OCT1 transcript was detectable only at very low levels (0.3% in heterozygous and 0.6% in homozygous carriers of the 8 bp duplication, deep RNA-sequencing). The 8 bp duplication was associated with a significant reduction of OCT1 expression in the human liver, but explained only 9% of the general variability in OCT1 expression and was not associated with significant changes in the pharmacokinetics of sumatriptan and fenoterol. Therefore, the rs35854239 variant only partially changes splicing, causing moderate changes in OCT1 expression and may be of only limited therapeutic relevance.
The tricyclic antidepressant amitriptyline is frequently prescribed but its use is limited by its narrow therapeutic range and large variation in pharmacokinetics. Apart from interindividual differences in the activity of the metabolising enzymes cytochrome P450 (CYP) 2D6 and 2C19, genetic polymorphism of the hepatic influx transporter organic cation transporter 1 (OCT1) could be contributing to interindividual variation in pharmacokinetics. Here, the impact of OCT1 genetic variation on the pharmacokinetics of amitriptyline and its active metabolite nortriptyline was studied in vitro as well as in healthy volunteers and in depressive disorder patients. Amitriptyline and nortriptyline were found to inhibit OCT1 in recombinant cells with IC50 values of 28.6 and 40.4 µM. Thirty other antidepressant and neuroleptic drugs were also found to be moderate to strong OCT1 inhibitors with IC50 values in the micromolar range. However, in 35 healthy volunteers, preselected for their OCT1 genotypes, who received a single dose of 25 mg amitriptyline, no significant effects on amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics could be attributed to OCT1 genetic polymorphism. In contrast, the strong impact of the CYP2D6 genotype on amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics and of the CYP2C19 genotype on nortriptyline was confirmed. In addition, acylcarnitine derivatives were measured as endogenous biomarkers for OCT1 activity. The mean plasma concentrations of isobutyrylcarnitine and 2-methylbutyrylcarnitine were higher in participants with two active OCT1 alleles compared to those with zero OCT1 activity, further supporting their role as endogenous in vivo biomarkers for OCT1 activity. A moderate reduction in plasma isobutyrylcarnitine concentrations occurred at the time points at which amitriptyline plasma concentrations were the highest. In a second, independent study sample of 50 patients who underwent amitriptyline therapy of 75 mg twice daily, a significant trend of increasing amitriptyline plasma concentrations with decreasing OCT1 activity was observed (p = 0.018), while nortriptyline plasma concentrations were unaffected by the OCT1 genotype. Altogether, this comprehensive study showed that OCT1 activity does not appear to be a major factor determining amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics and that hepatic uptake occurs mainly through other mechanisms.
Exogenous glucocorticoids increase the risk for osteoporosis, but the role of endogenous glucocorticoids remains elusive. Here, we describe the generation and validation of a loss- and a gain-of-function model of the cortisol producing enzyme 11β-HSD1 (HSD11B1) to modulate the endogenous glucocorticoid conversion in SCP-1 cells — a model for human mesenchymal stem cells capable of adipogenic and osteogenic differentiation. CRISPR-Cas9 was successfully used to generate a cell line carrying a single base duplication and a 5 bp deletion in exon 5, leading to missense amino acid sequences after codon 146. These inactivating genomic alterations were validated by deep sequencing and by cloning with subsequent capillary sequencing. 11β-HSD1 protein levels were reduced by 70% in the knockout cells and cortisol production was not detectable. Targeted chromosomal integration was used to stably overexpress HSD11B1. Compared to wildtype cells, HSD11B1 overexpression resulted in a 7.9-fold increase in HSD11B1 mRNA expression, a 5-fold increase in 11β-HSD1 protein expression and 3.3-fold increase in extracellular cortisol levels under adipogenic differentiation. The generated cells were used to address the effects of 11β-HSD1 expression on adipogenic and osteogenic differentiation. Compared to the wildtype, HSD11B1 overexpression led to a 3.7-fold increase in mRNA expression of lipoprotein lipase (LPL) and 2.5-fold increase in lipid production under adipogenic differentiation. Under osteogenic differentiation, HSD11B1 knockout led to enhanced alkaline phosphatase (ALP) activity and mRNA expression, and HSD11B1 overexpression resulted in a 4.6-fold and 11.7-fold increase in mRNA expression of Dickkopf-related protein 1 (DKK1) and LPL, respectively. Here we describe a HSD11B1 loss- and gain-of-function model in SCP-1 cells at genetic, molecular and functional levels. We used these models to study the effects of endogenous cortisol production on mesenchymal stem cell differentiation and demonstrate an 11β-HSD1 dependent switch from osteogenic to adipogenic differentiation. These results might help to better understand the role of endogenous cortisol production in osteoporosis on a molecular and cellular level.
Organic cation transporter OCT1 is strongly expressed in the sinusoidal membrane of hepatocytes. OCT1 mediates the uptake of weakly basic and cationic compounds from the blood into the liver and may thereby facilitate the first step in hepatic metabolism or excretion of many cationic drugs. OCT1 is a polyspecific transporter and has a very broad spectrum of structurally highly diverse ligands (substrates and inhibitors). The exact transport mechanism and the amino acids involved in polyspecific ligand binding of OCT1 are poorly understood.
The aim of this work was to utilize the polyspecificity to better understand the structure-function relationships of OCT1 and to gain first insights into potential mechanisms conferring the polyspecificity. We followed two strategies, analyzing the effects of variability in both ligand and transporter structure on OCT1 function. The effects of ligand structure were analyzed by comparing uptake and inhibitory potencies of structurally similar drugs of the group of opioids. The effects of transporter structure were analyzed by comparing the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants or artificial mutations on OCT1 uptake and inhibition of several substrates. Most importantly, the effects of interspecies variability in transporter structure were analyzed by comparing uptake kinetics between human and mouse OCT1 orthologs. To this end, we used stably or transiently transfected HEK293 cells overexpressing OCT1 and different chimeric and mutant variants thereof.
Focusing on OCT1 ligands, we compared the uptake and inhibitory potencies of structurally similar opioids. Only minor changes of the ligand structure strongly affected the interaction with OCT1. The presence of the ether linkage between C4 and C5 of the morphinan ring was associated with reduced OCT1 inhibitory potencies, while passive membrane permeability was the major negative determinant of OCT1-mediated uptake among structurally highly similar morphinan opioids. Only minor structural changes strongly increased the inhibitory potency by 28-fold from the lowest IC50 of 2004 µM for oxycodone to 72 µM for morphine. Additional removal of the ether linkage between C4-C5 increased the inhibitory potency by a total of 313-fold to the lowest IC50 of 6 µM for dextrorphan. Consequently, our data demonstrates that despite its polyspecificity, OCT1-mediated uptake and inhibition of this uptake is still somewhat very specific.
Focusing on OCT1 protein structure, we first analyzed the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants on OCT1 uptake and inhibition. OCT1 transport was strongly affected by OCT1 genetic variants and these effects were often substrate-specific. Correlation of these effects revealed several substrates that were similarly affected by the variants and may therefore be suggested to share similar or overlapping binding sites in OCT1. In addition, the effects of the genetic variants OCT1*2 and OCT1*3 on different substrates correlated well which may suggest that the structural variability caused by these two variants similarly affects substrate uptake. OCT1 genetic variants also affected the inhibition of OCT1, with both substrate and genotype-specific differences. Ranitidine inhibited the uptake of several substrates, among them the clinically relevant drugs metformin and morphine. Moreover, the inhibition was more potent (about 2-fold) on the uptake mediated by the common genetic variant OCT1*2 than on the uptake mediated by the reference OCT1*1.
Second, we analyzed the effects of artificial mutations of key amino acids. Tyr222 and Asp475 in rat OCT1 had strongly substrate-specific and also species-specific effects on both OCT1-mediated uptake and inhibition. Mutation of these amino acids strongly decreased OCT1-mediated uptake, which further underscored an important role especially of Asp475. Interestingly, despite a proposed essential role of this amino acid, we observed Asp475-independent transport. This transport was observed in mouse, but not in human OCT1 and was substrate-specific. TMH10 was identified to be involved in determining the Asp475-independent uptake of mouse OCT1.
Finally and most importantly, we analyzed the effects of sequence differences between human and mouse OCT1 on the transport kinetics of several OCT1 substrates. The transport kinetics differed strongly between human and mouse OCT1 orthologs. These differences were substrate-specific and affected both the affinity (KM) and capacity (vmax) of transport. Human OCT1 had an 8-fold higher capacity of trospium transport, while mouse OCT1 had an 8-fold higher capacity of fenoterol transport. Furthermore, mouse OCT1 had a 5-fold higher affinity for metformin transport compared to human OCT1. The difference between Phe32 in human and Leu32 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by human compared to mouse OCT1, while the difference between Cys36 in human and Tyr36 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by mouse compared to human OCT1. Furthermore, Leu155 in human OCT1, corresponding to Val156 in mouse OCT1 in TMH2, in concert with TMH3 were identified to confer the differences in affinity for metformin transport between the species.
It may be speculated that ligand binding in OCT1 involves a core binding region that includes Asp474/475 and that polyspecific ligand binding is enabled by providing further binding partners (different amino acids) in more peripheral regions that different ligands can selectively interact with. This mechanism may also be a first step in explaining the substrate-specific effects of genetic variants with clinical relevance. Based on our findings, these “polyspecificity regions” may include TMH1, TMH2, and TMH3. Further analyses are warranted to characterize and narrow down these regions to unravel the structure-function relationships and with that the polyspecificity of OCT1.
To summarize, variability in both ligand and transporter structure strongly affected OCT1 function and we were able to identify ligand structures that affect inhibitory potency and protein structures that confer species-specific differences in OCT1 transport. This work emphasizes again the complexity of OCT1 transport and structure-function relationships. We also showed that, in spite of the difficulties for experimental analysis and data interpretation that arise from the polyspecific nature of OCT1, polyspecificity can also be used as a tool to better understand the structure-function relationships of this transporter.
Das Pankreaskarzinom ist eine maligne Tumorerkrankung mit sehr schlechter Prognose. In der Therapie werden, bislang allerdings nur mit begrenztem Erfolg, verschiedenste Chemotherapeutika verwendet. Die Gründe für dieses Therapieversagen sind noch weitgehend unklar, jedoch wird vermutet, dass die Aufnahme und Elimination der jeweiligen Zytostatika in die malignen Zellen eine Rolle spielen. Daher sind in dieser Arbeit die beiden ABC-Transporter MRP4 und MRP5, die als Effluxtransporter für diese Zytostatika diskutiert werden, hinsichtlich ihrer mRNA- und Proteinexpression, ihrer zellulären Lokalisation sowie ihrer möglichen Funktion in vier Pankreaskarzinomzelllinien (Capan-1, Capan-2, PaTu 8988 T und PaTu 8902) näher charakterisiert worden. Dabei zeigten sich zunächst zelllinienspezifische Unterschiede in der Transporterexpression, wobei MRP5 im Gegensatz zu MRP4 in allen untersuchten Zelllinien relativ stark exprimiert war. Die Membranständigkeit ließ sich an fast allen unters uchten Zelllinien eindeutig nachweisen. In folgenden Zytotoxizitätsversuchen wurden die beiden Capanzelllinien, ausgewählt aufgrund ihres unterschiedlichen Ursprungs, hinsichtlich möglicher Unterschiede im Ansprechen auf unterschiedliche Substanzen untersucht. Mit Blick auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Therapieresistenz beim Pankreaskarzinom und der MRP4, 5 Transporterexpression erschienen hier vor allem Purin- und Pyrimidinanaloga interessant. Hierbei wurden, im Vergleich zu ersteren, wesentlich niedrigere IC50-Werte für die Pyrimidinanaloga ermittelt, was durch eine Interaktion zwischen Purinanaloga und den MRP-Transportern erklärbar wäre. Eine anschließende Inhibierung der Effluxtransporter durch Probenecid führte ebenfalls gerade bei den Purinanaloga zu einer verstärkten Empfindlichkeit, während hier die anderen untersuchten Wirkstoffe keine Reduktion bzw. sogar ein Anstieg der Zellviabilität bewirkten. Zusammenfassend scheint die Expression der beiden Effluxtr ansporter für die beim Pankreaskarzinom auftretende Zytostatikaresistenz von Bedeutung zu sein. Diese Arbeit gibt dabei insbesondere Hinweise auf eine Beteiligung des ABC-Transporters MRP5 möglicherweise auch von MRP4 an diesen Prozessen. Welche Bedeutung diese Ergebnisse jedoch für das in vivo geschehen haben werden bleibt abzuwarten.
Der ß-Adrenozeptorenblocker Talinolol (TAL) und das Herzglykosid Digoxin (DIG) sind geeignete Substrate, um die Expression von intestinalem P-Glykoprotein beim Menschen zu untersuchen.. Basierend auf der Tatsache, dass Digoxin-Plasmaspiegel bei hyperthyreoten Patienten niedriger sind als bei euthyreoten Personen, sollte mit der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf die intestinale P-gp-Expression haben. Dazu wurde an 8 gesunden Probanden (4 männl., 4 weibliche, 22-29 Jahre) die Pharmakokinetik von intravenös (30 mg) und oral (100 mg) appliziertem Talinolol vor und nach 17tägiger Gabe von Thyroxin untersucht. Mittels Immunhistochemie und RT-PCR wurde die intestinale P-gp-Expression in Dünndarmbiopsien, welche den Probanden vor und nach Thyroxin-Gabe entnommen wurden, bestimmt. Ergebnisse: (1) Durch 17tägige Gabe von Thyroxin lässt sich bei gesunden Probanden das Bild einer subklinischen Hyperthyreose erzielen. (2) Nach der Behandlung mit Thyroxin war sowohl in der Immunhistochemie als auch in der RT-PCR ein Anstieg der P-gp-Expres-sion zu beobachten. (3) Die pharmakokinetischen Daten nach oraler Gabe von Talinolol weisen darauf hin, dass Thyroxin ein Induktor des Transportproteins P-gp sein könnte (Abnahme der Bioverfügbarkeit, signifikante Abnahme der Halbwertszeit). Nach intravenöser Applikation konnte keine Veränderung der Pharmakoki-netik von Talinolol gezeigt werden. Schlussfolgerung: Die vorliegenden Ergebnissen zeigen, dass Thyroxin die Expression von intestinalem P-gp induziert. Aufgrund dieses Effektes ist damit zu rechnen, dass die Therapie mit Arzneimitteln, die durch P-gp transportiert werden, bei hyperthyreoten Patienten beeinflusst wird.
About 30 % of epileptic patients are non-responsive to multidrug antiepileptic therapy. One of non-responsiveness in epilepsy hypothesis claims that non-responsiveness occurs because of reduced access of antiepileptic drugs to their targets, as a result of increased efflux of antiepileptic drugs away from these targets. Transporters believed to be involved in non-responsiveness in epilepsy are mainly but not exclusively the members of the ABC superfamily including P-gp (MDR1, ABCB1), MRP1 (ABCC1), MRP2 (ABCC2) and others. These proteins are normally found in the blood-brain barrier and the blood-cerebrospinal fluid barrier where they function as protectors. There is emerging evidence that P-gp, MRP1 and MRP2 are up-regulated in epileptogenic brain tissue. The risk of non-responsiveness could be related also to the MDR1 or MRP2 gene polymorphisms. We hypothesised that changes in expression and function of multidrug transporters involved in non-responsiveness of epilepsy might be detectable not only in the brain but also in other tissues such as lymphocytes. Therefore we evaluated the expression of MDR1, MRP1 and MRP2 and function of P-gp in lymphocytes in patients with epilepsy and healthy subjects. Three groups of epileptic patients and 15 healthy subjects as a control group were included in the study. The patients’ group was defined as follows: Monotherapy – patients treated with carbamazepine monotherapy, without seizures - corresponded to group responders. Combined therapy – patients after monotherapy (two different medicines have been tried) and combined therapy (two trials of combined therapy), not free of seizures. Monotherapy and combined therapy groups each embraced 15 patients. Neurosurgery – patients who had undergone neurosurgery, afterwards were or were not additionally treated with carbamazepine, with or without seizures. This group comprised 24 patients. Combined therapy and neurosurgery groups composed the group of non-responders. The mRNA expression of MRP1, MRP2 and MDR1 by means of quantitative real-time PCR as well as MRP2 and P-gp protein content by Western blot in lymphocytes was measured. For P-gp functional analysis rhodamine efflux from lymphocytes and natural killer (NK) cells was performed. The influence of the polymorphisms C3435T, G2677T/A in the MDR1 gene and C24T, G1249A, C3972T in the MRP2 gene for the transporters expression, function and their association with non-responsive epilepsy phenotype was investigated. Our results showed that MRP1 expression in lymphocytes was significantly lower in epileptics than in healthy subjects. Non-responders had lower MRP1 mRNA content in lymphocytes than responders. We did not find any difference in MRP2 expression between epileptics and healthy volunteers. MRP2 mRNA levels in lymphocytes were higher in non-responders than in responders. However, at protein level epileptic patients had significantly lower MRP2 content in lymphocytes than controls. MRP2 protein content did not differ in responders and non-responders. There was no reliable correlation between MRP2 mRNA expression and MRP2 protein content in lymphocytes. Epileptics had significantly lower MDR1 expression in lymphocytes than healthy individuals. MDR1 expression was decreasing according to the consumption of antiepileptic drugs and seizures frequency: patients after neurosurgery had significantly lower MDR1 expression than patients after combined therapy and monotherapy. MDR1 expression was significantly lower in non-responders than in responders. At protein level epileptics had lower P-gp content than controls. Detected P-gp amount in lymphocytes did not differ between responders and non-responders. Rhodamine efflux from lymphocytes and NK cells did not differ significantly between epileptics and healthy subjects, but it was higher in patients after neurosurgery than in patients after monotherapy. Rhodamine efflux from NK cells, which are known to express the highest levels of P-gp, was significantly higher in non-responders than in responders. In this study, we showed that MRP1 mRNA expression in lymphocytes was significantly correlated to its expression in the brain. We detected also a significant co-correlation between MRP1 expression in the hippocampus and MDR1 expression in lymphocytes. We found no evidence regarding the impact of the MDR1 polymorphisms on mRNA expression, P-gp content and rhodamine efflux from lymphocytes. Our data showed lack of evidence regarding the impact of the MRP2 polymorphisms on mRNA expression and protein content. We did not detect any association between MDR1 or MRP2 polymorphisms and non-responsiveness in epilepsy or epilepsy in the main. In conclusion, our results suggest that lymphocytes are an appropriate surrogate for studies on changes of multidrug transporters expression in epilepsy. Lymphocytes as an easily accessible tissue might serve as a marker for responsiveness to antiepileptic drug therapy in epilepsy studies.
Doxorubicin is a frequently used anticancer drug to treat many types of tumors, such as breast cancer or bronchial carcinoma. The clinical use of doxorubicin is limited by its poorly predictable cardiotoxicity, the reasons of which are so far not fully understood. The drug is a substrate of several efflux transporters such as P-gp or BCRP and was recently reported to be a substrate of cation uptake transporters. To evaluate the potential role of transporter proteins in the accumulation of doxorubicin at its site of action (e.g., mammary carcinoma cells) or adverse effects (e.g., heart muscle cells), we studied the expression of important uptake and efflux transporters in human breast cancer and cardiac tissue, and investigated the affinity of doxorubicin to the identified transporters. The cellular uptake studies on doxorubicin were performed with OATP1A2*1, OATP1A2*2, and OATP1A2*3-overexpressing HEK293 cells, as well as OCT1-, OCT2-, and OCT3- overexpressing MDCKII cells. To assess the contribution of transporters to the cytotoxic effect of doxorubicin, we determined the cell viability in the presence and absence of transporter inhibitors in different cell lines. Several transporters, including P-gp, BCRP, OCT1, OCT3, and OATP1A2 were expressed in human heart and/or breast cancer tissue. Doxorubicin could be identified as a substrate of OCT1, OCT2, OCT3, and OATP1A2. The cellular uptake into cells expressing genetic OATP1A2 variants was markedly reduced and correlated well with the increased cellular viability. Inhibition of OATP1A2 (naringin) and OCT transporters (1-methyl-4-phenylpyridinium) resulted in a significant decrease of doxorubicin-mediated cytotoxicity in cell lines expressing the respective transporters. Similarly, the excipient Cremophor EL significantly inhibited the OCT1-3- and OATP1A2-mediated cellular uptake and attenuated the cytotoxicity of doxorubicin. In conclusion, genetic and environmental-related variability in the expression and function of these transporters may contribute to the substantial variability seen in terms of doxorubicin efficacy and toxicity.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.
Die Variabilität von Arzneimitteln wird nicht nur durch die Spezifität der Substanzen für die Zielstrukturen bestimmt, sondern auch durch die interindividuelIe Variabilität von eliminierenden Prozessen. Im Hinblick auf die demographische Entwicklung mit zunehmendem Alter Schwangerer scheint auch die Notwendigkeit einer therapeutischen Intervention der Schwangerschaft wahrscheinlicher. Effekte von maternal gegebenen Arzneimitteln auf das sich entwickelnden Kind sind die Hauptrisiken einer schwangerschafts-assoziierten Therapie. Die Plazenta bildet die Schnittstelle zwischen Mutter und Kind und ist sowohl an der Versorgung, als auch an der Protektion des Kindes beteiligt. Es konnte bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden, dass Transportproteine welche auch die Mitglieder der ABC (ATP-binding cassette) Transporter Familie einschließen, an der Schutzfunktion beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Expression Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der ABC-Transporter in der Plazenta untersucht. Näher betrachtet wurden P-Glykoprotein (ABCB1), Breast Cancer Restance Protein (ABCG2), Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) und MRP5. Quantitative Real-Time Reaktion ergab tue Expression der Transport in allen untersuchten 60 Proben von Früh- und Termingeburten. Nachgewiesen werden konnte eine mit den Gestationsalter abnehmende Expression von MRP5, während die MRP2 und P-Glykoprotein mRNA mit dem Gestationsalter anstieg. Western Blot Analysen von Membranpräparation zeigte ähnliche Ergebnisse. Mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie konnte MRP5 hauptsächlich in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten und in der Umgebung voll fetalen Gefäßen nachgewiesen werden, während die anderen 'Transporter hauptsächlich in der apikalen Syzytiotrophohlasten- Mernbran lokalisiert waren. Darüber hinaus wurde die Veränderung der Expression der Transporter in isolierten Zytotrophoblasten untersucht. Diese Vorläuferzellen des Synzytiotrophoblasten differenzieren in vitro und bilden ein multinukleäres Synzytium. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Differenzierung die Expression der Transporter mit der hCG-Sekretion - einem biochemischem Marker der Differenzierung- ansteigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression der hier untersuchten Transporter vorn Gestationsalter abhängig ist und sich mit der Differenzierung der Cytotrophoblasten verändert.
Die Zellen des menschlichen Körpers sind von einer Membran umgeben, durch die das Cytoplasma vom Umgebungsmilieu abgegrenzt wird. Für die Aufrechterhaltung ihrer Stoffwechselfunktionen sind sie jedoch auf eine ständige Aufnahme und Abgabe verschiedenster Moleküle angewiesen. Für immer mehr Substanzen kann inzwischen gezeigt werden, dass deren Membranpassage durch spezifische Transportproteine vermittelt wird. Auch das Herzgewebe ist Ziel- und Wirkort einer Reihe endogener und exogener Moleküle wie beispielsweise Hormone oder Arzneistoffe, die für den Eintritt in die Zelle Transportproteine, sogenannte Carrier, benötigen. Die vorliegende Arbeit sollte daher dazu beitragen, die Expression des Anionentransporters "Organic Anion Transporting Polypeptide B" (OATP-B/OATP2B1), eines Mitglieds der Transporterfamilie OATP (SCL21), im humanen Herzen aufzuklären. Dazu wurde zunächst ein sequenzspezifischer Antikörper gegen das OATP-B hergestellt und an Plazentagewebe charakterisiert. Mit diesem Antiserum wurde anschließend im Westernblot und immunhistologisch die Expression und die zelluläre Lokalisation des OATP-B Proteins in humanen Herzgewebeproben untersucht. Weiterhin wurde die mRNA Expression des OATP-B in 46 Vorhof- und 15 Ventrikelproben überwiegend herzkranker Patienten mittels Real time PCR bestimmt und Unterschiede in der Expression im Hinblick auf anamnestische und klinische Daten statistisch analysiert. In allen untersuchten Proben wurde OATP-B nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine starke Expression im Bereich des Endothels kleiner Gefäße, Kardiomyozyten wiesen eine deutlich schwächere OATP-B Expression auf. Zwischen Vorhof- und Ventrikelproben zeigte sich kein signifikanter Unterschied, ebenso hatten kardiale Erkrankungen oder allgemeine Merkmale wie das Körpergewicht, Alter oder Geschlecht, keinenn Einfluss auf die OATP-B Expression. Es fand sich jedoch bei Patienten, die CSE-Hemmer und hierbei insbesondere Atorvastatin einnahmen, eine signifikant geringere Expression der OATP-B mRNA als bei Patienten ohne CSE-Hemmer Medikation (p < 0,05). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das OATP-B regelmäßig im humanen Herzen exprimiert ist, so dass eine Beteiligung des OATP-B an der kardialen Aufnahme seiner Substrate wie beispielsweise Steroid-Sulfate und CSE-Hemmer wahrscheinlich ist. Außerdem deuten die statistischen Ergebnisse auf mögliche Regulationsprozesse durch CSE-Hemmer bei der Expression des OATP-B hin.
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein vermittelt häufig Resistenzen gegenüber Arzneimitteln. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-überexprimierenden Tumoren entdeckt. Auch viele gesunde Gewebe enthalten P-Glykoprotein. Einige der Substanzen, die von P-Glykoprotein transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von Herzerkrankungen. Die individuelle Expressionhöhe von P-Glykoprotein im Herzen könnte für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf von P-Glykoprotein transportierte Medikamente verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von P-Glykoprotein an 15 humanen Herzgewebeproben untersucht. Verwendet wurde die Methode der RT-PCR und die immunhistochemische Darstellung des Proteins. Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen Proben gezeigt werden. Immunhistochemisch ist P-Glykoprotein in den Endothelzellen der Arteriolen und Kapillaren lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an Transportprozessen. Intrakardiale Konzentrationen vieler Substanzen können abhängig von der individuellen P-Glykoprotein-Expression beeinflusst werden
Das wasserlösliche, quaternäre Kation Trospiumchlorid (TC) wird nur unvollständig aus dem Darmlumen resorbiert, weist ein hohes Verteilungsvolumen auf und wird in die Leber aufgenommen und über Urin und Stuhl eliminiert. Die Blut-Hirn-Schranke überwindet es nicht und hat dadurch in der Anwendung als Anticholinergikum in der Behandlung des Syndroms der Überaktiven Blase (OAB) einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Anticholinergika, da keine zerebralen Nebenwirkungen auftreten. Um relevante pharmakokinetische Transportmechanismen für TC abschätzen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit u. a. die mRNA-Expression von Transporterproteinen in humanem Blasenurothel gemessen und zellbasierte Transportassays zur Bestimmung der Affinität von TC zu verschieden pharmakokinetisch bedeutsamen Aufnahme- und Effluxtransportern durchgeführt. Die Analyse der mRNA-Expression identifizierte die folgenden Transporterproteine in humanem Blasenurothel: P-gp, MRP1 - 5, BCRP, OATP2B1, OATP4A1, OCT1, OCT3, OCTN1, OCTN2 und MATE1. TC zeigte eine Affinität zu OATP1A2, OCT1 und P-gp. Die Aufnahme von TC in primäre Blasenzellen konnte durch Naringin und Verapamil, Inhibitoren von OATP1A2 bzw. OCT1, gehemmt werden. In Immunfärbungen waren sowohl P-gp als auch OATP1A2 in apikalen, OATP1A2 auch in den darunter liegenden Urothelschichten lokalisiert. Die Affinität von TC zu den Aufnahmetransportern OATP1A2 und OCT1 und der Effluxpumpe P-gp ist möglicherweise der Grund für die inkomplette orale Absorption, die Verteilung in Leber und Nieren und die substantielle Sekretion über das Intestinum und die Niere. Das Fehlen zentraler, anticholinerger Effekte ist auf den Transport von TC durch P-gp zurückzuführen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das humane Urothel zahlreiche Transportproteine und AM-metabolisierende Enzyme, welche möglicherweise mit TC und anderen mit dem Urin ausgeschiedenen Medikamenten interagieren, exprimiert. Allerdings konnte nicht endgültig geklärt werden, wie genau eine anticholinerge Wirkung durch TC am Blasenurothel ausgelöst wird. Dies sollte Thema zukünftiger Untersuchungen sein.
Ziel der Arbeit war es, ein Probenkollektiv zu etablieren und die Expression, Lokalisation und Funktion pharmakologisch und physiologisch relevanter Membrantransporter systematisch zu untersuchen. Dafür wurde aus 70 humanen Plazenten mRNA, Protein und genomische DNA isoliert. Im Anschluss konnte die mRNA-Expression der Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC1 (MRP1), ABCC2 (MRP2), ABCC3 (MRP3), (ABCC5), ABCG2 (BCRP), SLC10A6 (SOAT), SLC22A4 (OCTN1), SLC22A5 (OCTN2), SLC22A11 (OAT4) und SLCO2B1 (OATP2B1) bestimmt und hinsichtlich ihrer Assoziation mit dem Gestationsalter und dem Geschlecht analysiert werden. Dabei zeigte sich eine signifikante gestationsabhängige Expressionsabnahme für das P-gp, BCRP, OATP2B1 und OAT4, darüber hinaus war die Expression von MRP1 in Plazenten männlichen Feten im Vergleich zu weiblichen Feten deutlich erhöht. Da fast alle Organe, mit Ausnahme der Leber, Niere und Gehirn, auf eine Carnitinaufnahme aus dem Blut angewiesen sind, spielen Carnitintransporter wie das SLC22A4 (OCTN1) und SLC22A5 (OCTN2) eine entscheidende Rolle: In der Plazenta sind sie bei der Versorgung des Fetus mit L-Carnitin unabdingbar. Auf mRNA-Ebene konnte in diesem Zusammenhang zunächst keine gestationsabhängige Expressionsänderung gezeigt werden, obwohl der Fetus zum Ende der Schwangerschaft einen deutlich erhöhten Carnitinbedarf hat. Die daraufhin durchgeführte Bestimmung der korrespondierenden OCTN2-Proteinexpression, die interessanter Weise nicht mit den mRNA-Werten korrelierte, zeigte tatsächlich eine erhöhte Transporterexpression zum Ende der Schwangerschaft hin. Für das OCTN2 wurden weiterhin Untersuchungen zum Einfluss eines bekannten Promotorpolymorphismus, dem -207G>C, der in anderen Studien mit der OCTN2 Expression assoziiert werden konnte, durchgeführt. Hier zeigte sich, dass diese genetische Variante zwar die mRNA Expression des Transporters beeinflusst, sich dieser Effekt aber wiederum nicht auf die Proteinebene übersetzt, so dass anzunehmen ist, dass die plazentare OCTN2 Expression auch von nicht transkriptionellen Faktoren (z.B. miRNA) bestimmt wird. Mit Blick auf die anderen untersuchten Transporter zeigte sich in vielen Fällen eine Korrelation in der Expression bestimmter Efflux- und Aufnahmetransporter. Ein Beispiel für ein solches Transporterpaar war dabei das BCRP und OATP2B1,das in der Folge weiter untersucht wurde, wobei insbesondere ein mögliches funktionelles Zusammenspiel im Mittelpunkt stand. Aufbauend auf der apikalen Expression des BCRP und der basalen des OATP2B1, wurde ein, auf MDCKII-Zellen basiertes, in vitro Zellsystem verwendet, um die Bedeutung dieser Transporter für den transzellulären Transport von Substanzen wie E1S und DHEAS zu zeigen. In der Tat war ein gerichteter Transporter dieser Substanzen nur zu beobachten, wenn beide Transporter in den Zellen exprimiert wurden. Diese Ergebnisse sind bezüglich der Hormonsynthese durch die Plazenta von Bedeutung, da diese während der Schwangerschaft einen zentralen Syntheseort darstellt, aber einige Vorläufermoleküle nicht selber synthetisieren kann. Zusammengefasst bietet die vorliegende Arbeit ein umfassendes Bild über die Regulation wichtiger physiologischer und auch pharmakologischer Membrantransporter im letzten Drittel der Schwangerschaft. Darüber hinaus konnte für ausgewählte Transporter das Zusammenspiel (OATP2B1 und ABCG2) und die Regulation (OCTN2) näher charakterisiert werden.
Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
The Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) is located in the basolateral membrane of hepatocytes, where it transports bile acids from the portal blood back into hepatocytes. Furthermore, NTCP has a role for the hepatic transport of some drugs. Extrapolation of drug transport data from rodents to humans is not always possible, because species differences in the expression level, localization, affinity, and substrate selectivity of relevant transport proteins must be considered. In the present study, a functional comparison of human NTCP (hNTCP) and mouse Ntcp (mNtcp) showed similar Km values of 67 ± 10 µM and 104 ± 9 µM for the probe substrate estrone-3-sulfate as well as of 258 ± 42 µM and 199 ± 13 µM for the drug rosuvastatin, respectively. IC50 values for the probe inhibitor cyclosporine A were 3.1 ± 0.3 µM for hNTCP and 1.6 ± 0.4 µM for mNtcp. In a drug and pesticide inhibitory screening on both transporters, 4 of the 15 tested drugs (cyclosporine A, benzbromarone, MK571, and fluvastatin) showed high inhibitory potency, but only slight inhibition was observed for the 13 tested pesticides. Among these compounds, only four drugs and three pesticides showed significant differences in their inhibition pattern on hNTCP and mNtcp. Most pronounced was the difference for benzbromarone with a fivefold higher IC50 for mNtcp (27 ± 10 µM) than for hNTCP (5.5 ± 0.6 µM).
In conclusion, we found a strong correlation between the transport kinetics and inhibition pattern among hNTCP and mNtcp. However, specific compounds, such as benzbromarone, showed clear species differences. Such species differences have to be considered when pharmacokinetic data are transferred from rodent to humans.