Ziel: Es soll die Haeufigkeit von Pankreasgangvarianten und ihre klinische Relevanz in einer epidemiologischen Kohortenstudie unter Nutzung der nicht-invasiven sekretinstimulierten Magnet-Resonanz-Cholangio-Pancreatographie (sMRCP) untersucht werden. Material und Methoden: 995 Freiwillige, 457 Frauen und 538 Maenner, wurden prospektiv mittels sMRCP untersucht. Hierbei wurde eine Navigator-getriggerte T2-gewichtete 3D-Turbo-Spin-Echo-MRCP nach der Gabe von 1 IE/kg Sekretin an einem 1,5-Tesla-MR-Tomographen erstellt. Zwei Reader evaluierten die Bilddaten auf ihre anatomischen Pankreasgangvarianten. Zusaetzlich wurden die exokrine Pankreasfunktion sowie morphologische Zeichen einer chronischen Pankreatitis wie Anomalitaeten des Hauptganges, Seitenasterweiterungen und Parenchymzysten untersucht und mit den Gangvarianten korreliert. Ergebnis: 93,2% aller sMRCP waren von diagnostischer Bildqualitaet. Invariante Pankreasgangtypen wurden in 90,4% (n=838/927) der Faelle beobachtet. Ein Pancreas divisum fand sich in 9,6% (n=89/927). Anomalitaeten des Hauptpankreasganges, Seitenasterweiterungen und Parenchymzysten fanden sich in 2,4%, 16,6% und 27,7% der Faelle und waren nicht signifikant haeufiger bei Vorliegen eines Pancreas divisum (p=0,122; p=0,152; p=0,741). Des Weiteren fand sich keine Assoziation zwischen den Pankreasgangvarianten und einer Einschraenkung der exokrinen Pankreasfunktion (p=0,367). Schlussfolgerung: Die sMRCP ermoeglicht die Bestimmung der Haeufigkeit von anatomischen Pankreasgangvarianten einschlieĂlich des Pancreas divisum. Das Pancreas divisum ist nicht mit den morphologischen Zeichen einer chronischen Pankreatitis oder einer Einschraenkung der exokrinen Pankreasfunktion assoziiert.
Ein wichtiger Aspekt der Pankreatitisforschung ist neben der AufklĂ€rung der Pathophysiologie das Erkennen von Prognosefaktoren, die eine Aussage ĂŒber den Verlauf einer Pankreatitis zu einem möglichst frĂŒhen Zeitpunkt nach Beginn der Erkrankung ermöglichen. Dies ist insbesondere wichtig um solche Patienten zu identifizieren, die spĂ€ter einen schweren Krankheitsverlauf haben, Komplikationen entwickeln und daher möglichst frĂŒhzeitig einer intensiven Ăberwachung und Therapie zugefĂŒhrt werden mĂŒssen. Eine frĂŒhe verlĂ€ssliche Prognose wĂŒrde es ermöglichen vorhandene Ressourcen möglichst nur dort einzusetzen, wo sie gebraucht werden. Das Auftreten von Morbus Crohn ist mit Mutationen des NOD2 Gens assoziiert. NOD2 ist ein intrazellulĂ€rer Rezeptor zur Erkennung von krankheitsassoziierten bakteriellen Strukturen. NOD2 vermittelt die Induktion von α-Defensinen, antimikrobiellen Peptiden der Darmschleimhaut und ist somit mitverantwortlich fĂŒr die Aufrechterhaltung der Darmbarriere. Da die bakterielle Translokation auch im Rahmen einer akuten Pankreatitis eine lebensbedrohliche Komplikation darstellen kann wurde in der vorliegenden Studie untersucht, ob Mutationen des NOD2 Gens (R702W, G908R, 3020InsC) in Zusammenhang mit dem Verlauf der akuten Pankreatitis stehen. Dazu wurde die DNA von 192 Patienten mit leichtem oder schwerem Verlauf einer akuten Pankreatitis und 120 gesunden Kontrollprobanden, von den UniversitĂ€tsstandorten Greifswald und Magdeburg analysiert. Das Auftreten der drei NOD2-Mutationen wurde mit Taqman-Analyse und anschlieĂender genomischer Sequenzierung untersucht. Bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse der Patienten aus Greifswald konnte erstmals ein Zusammenhanges zwischen dem Verlauf der schweren akuten Pankreatitis und der R708W Mutation des NOD2 Gens belegt werden. FĂŒr die Kohorte der Patienten aus Magdeburg war die Assoziation der NOD2-Mutationen jedoch nicht signifikant, so dass insgesamt eine eindeutige Aussage bezĂŒglich der Fragestellung nicht abschlieĂend getroffen werden konnte. Die vorliegende Studie deutet darauf hin, dass NOD2-Mutationen als Risikofaktor bei einem schweren Pankreatitisverlauf fĂŒr deren letalen Ausgang anzusehen sind. Um die Rolle der NOD2-Mutationen endgĂŒltig zu klĂ€ren sollten jedoch weitere Studien mit gröĂeren Patientenzahlen durchgefĂŒhrt werden.
Die lysosomale Hydrolase Cathepsin B (CTSB) spielt in der Pathogenese der akuten Pankreatitis eine zentrale Rolle. Sie gilt als wichtiges Aktivatorenzym von Trypsinogen, welches einen kaskadenartigen Aktivierungsprozess weiterer Zymogene (inaktiver Vor- stufen von Proteasen) auslöst. Seit 1987 geht man davon aus, dass es in der frĂŒhen Phase der Pankreatitis zu einer Umverteilung der CTSB-AktivitĂ€t von den Lysosomen in das sekretorische Kompartiment der Azinuszelle kommt. Ziel meiner Arbeit war es, diese Umverteilung am Modell der Caerulein-induzierten Pankreatitis in FVB-MĂ€usen nĂ€her zu untersuchen. DafĂŒr nutzte ich die Methode der subzellulĂ€ren Fraktionierung, die mittels Sucrosegradient und verschiedener Zentrifugierungsschritte die Komparti- mente (Zymogene, Lysosomen und Cytosol) der Azinuszelle ihrer Dichte nach trennt. In den einzelnen Kompartimenten habe ich sowohl fluorometrisch die AktivitĂ€t, als auch mittels Western Blot den Proteingehalt von CTSB im Verlauf der Pankreatitis gemes- sen. ErgĂ€nzend untersuchte ich die Prozessierung der Hydrolase unter Verwendung eines neuen hochspezifischen Inhibitors (NS-196-CTSB-Inhibitor) von Cathepsin B. Meine Er- gebnisse bestĂ€tigen die AktivitĂ€tsumverteilung des CTSB von der lysosomalen Fraktion unter physiologischen Bedingungen in die Zymogengranula-angereicherte Fraktion in der Pankreatitis bereits nach 1 h. DarĂŒber hinaus zeigte sich eine signifikante Erhöhung der GesamtaktivitĂ€t in der frĂŒhen Phase der Erkrankung. Der CTSB-Proteingehalt blieb allerdings in der genannten Zeitspanne in den drei Kompartimenten mehr oder weniger unverĂ€ndert und stieg erst nach 8 h an. Weiterhin konnte ich feststellen, dass die Pro- zessierung von CTSB hauptsĂ€chlich im lysosomalen und sekretorischen Kompartiment der Azinuszelle stattfindet und sich wĂ€hrend der akuten experimentellen Pankreatitis nicht erhöht. Im Cytosol fand sich trotz erheblicher Proteinmengen nur wenig prozes- siertes CTSB und kaum messbare AktivitĂ€t. Diese Ergebnisse lassen daher den Schluss zu, dass die Umverteilung der CTSB-AktivitĂ€t weder auf einer Kompartimentverschie- bung von Protein noch auf einer verĂ€nderten Prozessierung des Enzyms basiert, sondern auf einer Zunahme der AktivitĂ€t der gleichen Menge von prozessiertem CTSB. Insofern erfolgt keine Umverteilung des Proteins CTSB in das sekretorische Kompartiment, noch eine verĂ€nderte Prozessierung von CTSB im sekretorischen Kompartiment, sondern eine Zunahme der AktivitĂ€t von CTSB in diesem Kompartiment. Mögliche Ursachen hier- fĂŒr wĂ€ren eine Ănderung der biophysikalischen Umgebung (z.B. pH, Ca++) oder eine VerĂ€nderung im Gehalt physiologischer CTSB-Inhibitoren (z. B. Cystatine).
Die optimale Behandlung von Patienten mit einer akuten Pankreatitis hĂ€ngt stark von der frĂŒhen Prognose des Verlaufs der Erkrankung ab. In 80% der FĂ€lle verlĂ€uft die akute Pankreatitis mild und die Patienten verlassen innerhalb einer Woche beschwerdefrei das Krankenhaus. Bei. 20% der Patienten nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Komplikationen wie z.B. SIRS, Sepsis. Diese Patienten entwickeln (infizierte) Pankreasnekrosen, (Multi)-Organversagen und benötigen eine intensivmedizinische Betreuung. In 10-20% endet die schwere akute Pankreatitis tödlich. Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine validen Marker die zuverlĂ€ssig den Schweregrad der akuten Pankreatitis vorhersagen. Mustererkennungsrezeptoren sind Teil des angeborenen Immunsystems und dienen als Sensoren fĂŒr pathogen bakterielle Bestandteile. Nach Erkennen der Bakterien werden pro- und anti-inflammatorische Immunantworten eingeleitet, die fĂŒr die Eliminierung der Bakterien zustĂ€ndig sind. Zur Familie der Mustererkennungsrezeptoren gehören u.a. die Toll-like Rezeptoren und die Nod-like Rezeptoren. Viele Studien konnten Assoziationen zwischen Mutationen in Mustererkennungsrezeptoren und immunologischen Erkrankungen aufzeigen. Die am besten untersuchten Assoziationen sind die zwischen Morbus Crohn und Mutationen in Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) oder Nod-like Rezeptor 2 (NOD2). Mutationen in diesen Rezeptoren fĂŒhren zu einem Funktionsverlust der Rezeptoren und verhindern eine effektive Eliminierung von Bakterien. Dadurch wird z.B. die entzĂŒndliche Darmerkrankung Morbus Crohn begĂŒnstigt. WĂ€hrend der akuten Pankreatitis, einer primĂ€r sterilen Inflammation, bilden sich bei einem schweren Verlauf, durch in das Pankreas translozierende Darmbakterien, (infizierte) Pankreasnekrosen. Die Annahme, dass ein Funktionsverlust der Mustererkennungsrezeptoren TLR4 oder NOD2 den Schweregrad der akuten Pankreatitis und das Ausbilden infizierter Pankreasnekrosen beeinflusst, sollte in dieser Arbeit sowohl bei Patienten mit akuter Pankreatitis als auch im Tiermodell der Nod2-knock-out Maus ĂŒberprĂŒft werden. Mutationen im Toll-like Rezeptor 4 wurden in dieser Arbeit weder als Risikofaktoren fĂŒr die akute Pankreatitis, noch den Schweregrad der akuten Pankreatitis oder das Ăberleben identifiziert. Wir detektierten in Patienten mit akuter Pankreatitis und gesunden Blutspendern fĂŒr die TLR4 Mutationen Asp299Gly und Thr399Ile vergleichbare Allelfrequenzen. Anders verhielt es sich fĂŒr die Mutationen im Nod-like Rezeptor 2. Die Mutation Arg702Trp dieses Mustererkennungsrezeptors konnte als ein Risikofaktor fĂŒr eine erhöhte MortalitĂ€t bei Patienten mit einer schweren akuten Pankreatitis identifiziert werden. Wir können zeigen, dass sich das Risiko, an einer schweren akuten Pankreatitis zu versterben bei heterozygoten MutationstrĂ€gern auf 2,5 und bei Homozygoten auf das 9-fache erhöht. Mutationen in Arg702Trp fĂŒhrten allerdings nicht vermehrt zur Entwicklung von Sepsis oder (infizierten) Pankreasnekrosen. Lediglich die HĂ€ufigkeit ein Multiorganversagen zu entwickeln, war bei MutationstrĂ€gern signifikant erhöht. Die beiden anderen untersuchten NOD2 Mutationen (Gly908Arg und Leu1007fsinsC) hatten keinen signifikanten Effekt auf die Entwicklung einer akuten Pankreatitis. Untersuchungen der Rolle einer Nod2-Defizienz im experimentellen Mausmodell der schweren nekrotisierenden Pankreatitis zeigten einen im Vergleich zum Menschen unterschiedlichen PhĂ€notyp hinsichtlich des Verlaufs der schweren akuten Pankreatitis. Die lokalen SchĂ€den am Pankreas, aber auch die systemischen Reaktionen waren in den ersten 36h nach Induktion der nekrotisierenden Pankreatitis nicht wesentlich verĂ€ndert. Das LangzeitĂŒberleben (14 Tage) der Nod2-defizienten MĂ€use war jedoch deutlich verbessert. Wir stellten in den Nod2 knock-out Tieren sowohl eine persistierende intestinale Barrierestörung, als auch eine epitheliale Barrierestörung der Lunge fest. Als Konsequenz war bereits in den unbehandelten Nod2-defizienten Tiere eine erhöhte bakterielle Translokation und eine erhöhte Neutrophilentransmigration ins Gewebe sichtbar. Durch die Barrierestörungen entwickeln die Nod2 knock-out MĂ€use eine Toleranz gegenĂŒber den infiltrierenden Bakterien. Diese Toleranzentwicklung kommt 48h nach Induktion der Pankreatitis zum Tragen. Zu diesem Zeitpunkt stellt sich bei den Nod2-defizienten MĂ€usen ein hypoinflammatorischer Zustand ein. Im Vergleich dazu verstarben die Wildtyp-MĂ€use an den Folgen sekundĂ€rer Infektionen und einem daraus resultierenden Organversagen. Die NOD2 Mutation Arg702Trp ist somit ein Risikofaktor und potentieller genetischer Prognosemarker fĂŒr eine erhöhte MortalitĂ€t in Folge einer schweren akuten Pankreatitis. Der Funktionsverlust von NOD2 beeinflusst den systemischen Verlauf der schweren akuten Pankreatitis und trĂ€gt zu einer deregulierten inflammatorischen Antwort und verschlechterten bakteriellen Kompensation bei. Der lokale Schaden am Pankreas wĂ€hrend der schweren akuten Pankreatitis ist dagegen vergleichbar zwischen Patienten mit und ohne NOD2 Arg702Trp Mutation. UrsĂ€chlich fĂŒr das bessere Ăberleben der NOD2 knock-out MĂ€use ist vermutlich die induzierte Barrierestörung, die eine bakterielle Toleranz in diesen knock-out MĂ€usen induziert. Dadurch wird unter schwerer akuter Pankreatitis eine Entgleisung des Immunsystems verhindert und die bakterielle Translokation in die Organe deutlich effizienter kompensiert. Vergleichende Untersuchungen mit einem knock-out/knock-in Model der NOD2 Mutation Arg702Trp könnten dazu beitragen den Pathomechanismus dieser spezifischen NOD2-Mutation im Menschen weiter aufzuschlĂŒsseln.
Die Rolle von Sequenzvarianten im Cathepsin L als Risikofaktoren der chronischen Pankreatitis
(2016)
Die chronische Pankreatitis ist meist eine wiederkehrende EntzĂŒndung der BauchspeicheldrĂŒse mit intrapankreatischer Aktivierung der Verdauungsenzyme. Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (PSTI = SPINK1) finden sich hĂ€ufig bei Patienten mit chronischer Pankreatitis. Die hĂ€ufigste SPINK1 Mutation p.N34S ist aber auch bei 1-2 % der gesunden Normalbevölkerung nachweisbar. Experimentelle Daten belegen, dass das p.N34S mutierte Protein durch CTSL schneller degradiert wird. In dieser Arbeit wird untersucht, ob Mutationen im CTSL Gen das Risiko von p.N34S+ Individuen erhöhen, an einer EntzĂŒndung der BauchspeicheldrĂŒse zu erkranken. HierfĂŒr werden mittels TaqMan-Analyse die Probanden der SHIP-Studie (SHIP-0 n=4308, im Weiteren Kontrollen) und Individuen mit chronischer ideopathischer Pankreatitis (n=2299, im Weiteren Patienten) fĂŒr N34S-Mutation in SPINK1 genotypisiert. Hiernach wird bei den p.N34S+ Individuen das CTSL mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung untersucht. Wir finden eine nichtsynonyme Mutation (c.5A>C, p.N2T), eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters (c.98delA, p.K33fs) und einen SNP c.-461C>A (rs3118869), fĂŒr den eine Modifikation der Expression in anderem Zusammenhang publiziert ist. Die p.N2T Mutation wird bei einem Patienten und zwei Kontrollen nachgewiesen, die Verschiebung des Leserasters nur bei einem Patienten. Der SNP kann bei 42 Patienten und 46 Kontrollen nachgewiesen werden. FĂŒr keine der gefundenen Varianten zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der Verteilung. Auch in der Haplotypenanalyse kann kein signifikanter Verteilungsunterschied gezeigt werden. Ein Einfluss von CTSL Mutationen auf das Risiko an einer Pankreatitis zu erkranken, erscheint fĂŒr TrĂ€ger der p.N34S Mutation im SPINK1 Gen möglich, kann an dem untersuchten Kollektiv aber nicht bewiesen werden.
Die akute Pankreatitis ist durch eine vorzeitige intraazinÀre Proteasen-Aktivierung gekennzeichnet, wobei diese im Verlauf der Erkrankung durch eine zunehmende Immunantwort mit in das Pankreas infiltrierenden Immunzellen ergÀnzt wird. Eine besondere Bedeutung hat die intrazellulÀre Aktivierung der Serinprotease Trypsinogen, die in AbhÀngigkeit der lysosomalen Hydrolase Cathepsin B (CTSB) verlÀuft.
Wir konnten zeigen, dass verschiedene lysosomale Proteine (Cathepsin D (CTSD), Cathepsin C (CTSC)) nach pathologischem Stimulus in das sekretorische Kompartiment (Zymogengranula) umverteilt werden. Cathepsin D ist in der Lage, das SchlĂŒsselenzym Cathepsin B zu aktivieren, indem es das Pro-Enzym zu aktivem Enzym spaltet. Der Ort dieser proteolytischen Aktivierung sind die sekretorischen Vesikel. Eine pharmakologisch induzierte Permeabilisierung der Lysosomen mit nachfolgendem Ausbleiben der Umverteilung der Enzyme in das sekretorische Kompartiment zeigte, dass die vorzeitige Zymogen-Aktivierung in der FrĂŒhphase der Pankreatitis erhalten geblieben ist und unabhĂ€ngig vom Lysosom verlĂ€uft. Eine CTSB-AbhĂ€ngigkeit bleibt jedoch bestehen. Ein Fehlen von CTSD in den Azinuszellen fĂŒhrt zu einem nur transient milderen Verlauf der akuten Pankreatitis, wie anhand von CTSDf/f/p48Cre/+ MĂ€usen demonstiert werden konnte, die einen Pankreas-spezifischen CTSD Knockout besitzen. Ein anhaltend milderer Verlauf der Pankreatitis fand sich in CTSD-/- MĂ€usen, der auf eine verminderte Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine in Immunzellen zurĂŒckzufĂŒhren ist. Auch bei Defizienz von CTSC war der Schweregrad der akuten Pankreatitis milder, wie in CTSC-/- MĂ€usen experimentell demonstiert werden konnte. UrsĂ€chlich hierfĂŒr ist vor allem ein reduziertes Einwandern neutrophiler Granulozyten in das Pankreas und in die extrapankreatischen Organe (Lunge), die auf eine geringere AktivitĂ€t der Serinprotease Neutrophilen Elastase und verminderte Spaltung des Zell-Kontakt MolekĂŒls E-Cadherin beruhen. Umgekehrt beeinflusste das Fehlen von CTSC in den Azinuszellen nicht die vorzeitige Proteasen-Aktivierung.
Unsere Arbeit unterstreicht die Bedeutung lysosomaler Enzyme in der akuten Pankreatitis und zeigt, dass diese Enzyme maĂgeblichen Einfluss auf die Funktion von Immunzellen haben, die den Verlauf der Erkrankung wesentlich mitbestimmen. Unsere Arbeit zeigt auĂerdem, dass der primĂ€re Ort der intrazellulĂ€ren und vorzeitigen Proteasen-Aktivierung alleinig im sekretorischen Kompartiment stattfindet und nicht von einer Fusion mit dem lysosomalen Kompartiment abhĂ€ngig ist.
Die hereditĂ€re Pankreatitis (HP) ist eine autosomal dominant-vererbte Form der Pankreatitis mit einer Penetranz von 70 - 80%. Wiederholte PankreatitisschĂŒbe wĂ€hrend der Kindheit und Jugend fĂŒhren zur fortschreitenden Entwicklung einer chronischen Pankreatitis. Das Lebenszeit-Risiko, ein Pankreas-Karzinom zu entwickeln, ist um das 60- bis 70-fache erhöht. Bis heute wurden 20 verschiedene Mutationen im kationischen Trypsinogen-Gen bei Familien und Individuen mit Pankreatitis berichtet. Die drei hĂ€ufigsten Mutationen bei hereditĂ€rer Pankreatitis sind R122H, R122C und N29I. Diese sind mit ca. 80% aller FĂ€lle assoziiert. In dieser Studie wurden klinische Charakteristika von 65 HP-Patienten mit Mutationen im kationischen Trypsinogen-Gen (PRSS1-positiv) mit 113 Patienten verglichen, die eine positive Familienanamnese, aber keine Mutation im Trypsinogen-Gen (PRSS1-negativ) aufwiesen. Dabei zeigte sich bei Patienten der PRSS1-positiven Gruppe ein prozentual hĂ€ufigeres Auftreten sowohl von morphologischen VerĂ€nderungen als auch von exokriner und endokriner Pankreasinsuffizienz. Desweiteren ist in der Gruppe der Personen mit PRSS1-Mutation ein frĂŒherer Krankheitsbeginn in den ersten beiden Lebensdekaden zu beobachten. Obwohl der klinische Krankheitsverlauf gut beschrieben ist, liegen nur wenige Daten zur Rolle der ERCP in der Diagnostik und Behandlung von Patienten mit hereditĂ€rer Pankreatitis und zur FrĂŒherkennung von Pankreasmalignomen vor. In unserem Patientenkollektiv, wurde bei 30 Patienten eine diagnostische oder therapeutische ERCP durchgefĂŒhrt. Die groĂe Mehrheit dieser Patienten (83%) wies hochgradige VerĂ€nderungen im Pankreatogramm nach der Cambridge Klassifikation auf. Bei deutlich erhöhtem Pankreas-Karzinom-Risiko fĂŒr Patienten mit hereditĂ€rer Pankreatitis wird nach einem effektivem Verfahren zur Malignomdetektion gesucht. Die ERCP-Ergebnisse von 16,6% der HP-Patienten zeigten einen Pankreasgang-Abbruch, der einen frĂŒhen Hinweis fĂŒr eine MalignitĂ€tsentwicklung darstellen kann. Insgesamt entwickelte keiner der untersuchten HP-Patienten in der 4-jĂ€hrigen Beobachtungsperiode ein Pankreas-Karzinom. Die ValiditĂ€t der ERCP als alleinige Screeningmethode zur FrĂŒherkennung von Pankreasmalignomen bei Hochrisikopatienten ist daher fraglich. Bei 77,7 % der Patienten mit wiederholten endoskopischen Interventionen fand sich in der ERCP ein Krankheitsprogress. Das Spektrum therapeutischer ERCP-Interventionen bei Patienten mit hereditĂ€rer Pankreatitis entspricht dem bei Patienten mit Pankreatitis anderer Ătiologie. Endoskopische Interventionen halten die Krankheitsprogression nicht auf. Nur wenige Patienten können davon eventuell langfristig profitieren. Patienten der PRSS1-positiven Gruppen wurden frĂŒher und prozentual hĂ€ufiger operiert als die Vergleichsgruppe. Neben dem Nutzen der ERCP-Untersuchung wurden in dieser Studie auch die Risiken, eine postinterventionelle Komplikation zu erleiden, untersucht. Das Risiko fĂŒr ERCP-Komplikationen (z. B. Post-ERCP-Pankreatitis) ist in der PRSS1-positiven Gruppe nicht höher als in der PRSS1-negativen Gruppe oder bei Patienten mit alkoholtoxischer Pankreatitis.
