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Untersuchungen zum Aufbau eines Assays zur in vitro Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms
(2009)
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktionalisierung von RNAs im Hinblick auf die Selektion eines Ribozyms, das die Desaminierung von Cytidin zu Uridin katalysieren kann, durchgeführt. Die Desaminierung von Cytidin verläuft proteinkatalysiert. Cytidindesaminasen (CDAs) sind im Nukleotidmetabolismus aller Lebewesen zu finden. In höheren Eukaryoten spielen CDAs beim RNA editing eine Rolle. In Säugetieren sind sie bedeutsam für die Immunabwehr. Ein Cytidindesaminase-Ribozym wäre in der Lage die gezielte Veränderung einer RNA-Sequenz zu katalysieren. Diese Eigenschaft wäre ein weiteres Indiz für eine präbiotische RNA-Welt und könnte auch in der Gentherapie nützlich sein. Bei der in vitro Selektion ist die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek ein zentraler Punkt. 5’-Transkriptionspriming ist dafür besonders gut geeignet, da es kotranskriptionell, während der Transkription der RNA, stattfindet. Während der Transkription kann die T7 RNA Polymerase ein 5’-modifiziertes Guanosinmonophosphat am 5’-Ende, also am Anfang einer RNA-Sequenz, einbauen. Cytidin, das zu prozessierende Substrat der Selektion, wurde mit einem Guanosinmonophosphat verbunden. Solche modifizierten Guanosinmonophosphat-Verbindungen werden Initiatormoleküle genannt, da sie nur zu Beginn einer RNA-Transkription am 5’-Ende einer RNA eingebaut werden können. Um eine Selektion zu ermöglichen, wurde das Cytidin mit einer Markierung versehen. Es wurden zwei verschiedene Initiatormoleküle synthetisiert. Der eine Initiator bestand aus einer Guanosinmonophosphateinheit und einer Cytidineinheit, die eine Biotinmarkierung trug. Die Biotinmarkierung ermöglicht eine Selektion an der festen Phase durch die starke Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin. Bei erfolgreicher Reaktion der RNA wird diese von der Festphase getrennt und kann durch Waschen der Festphase isoliert werden. Der andere Initiator trug statt der Biotinmarkierung eine Fluoreszeinmarkierung. Die Selektion mit diesem Initiator würde in Lösung stattfinden. Fluoreszein-markierte RNAs besitzen eine andere gelektrophoretische Mobilität als unmarkierte RNAs. Bei der Selektion spalten aktive RNAs die Fluoreszeinmarkierung ab. Durch Gelaufreinigung der Selektionsansätze könnten sie so auf Grund ihrer veränderten gelelektrophoretischen Mobilität isoliert werden. Zur Synthese der Moleküle wurden zwei unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewandt. Die erste Synthesestrategie bediente sich der Phosphoramiditchemie an der festen Phase und lieferte den Biotin-markierten Initiator in nanomolaren Mengen. Die zweite Strategie führt zur Synthese des Fluoreszein-markierten Initiators und beinhaltete eine 18-stufige Synthese in Lösung, die eine Ausbeute des Initiators im µ-molaren Bereich ermöglichte. Die Funktionalisierung von RNA mit dem Biotin-markierten Initiator wurde qualitativ nachgewiesen mit Hilfe einer auf Northern Blotting und Chemilumineszenzdetektion aufbauenden Methode. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin zur spezifischen Bindungen an die Biotinmarkierung inkubiert. Durch Zugabe eines Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemiluminszenzsignal induziert, welches mit einem empfindlichen Photosystem detektiert und dokumentiert werden kann. Der erfolgreiche Einbau der Fluoreszein-markierten Initiatormoleküle wurde qualitativ mit Hilfe denaturierender Gelelektrophorese und Fluoreszenzanregung bei einer Wellenlänge von 365 nm nachgewiesen. Zur quantitativen Bestimmung des Einbaus wurde eine auf fluoreszenzspektroskopischen Anwendungen basierende Methode etabliert und erfolgreich angewendet. Dazu wurde eine zu 100% 5’-Fluoreszein-markierte RNA mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens synthetisiert. Zur Erstellung einer Eichgerade mit dieser Referenz-RNA wurden Proben mit bekannten Konzentrationen mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers vermessen. Die jeweiligen gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Fluoreszenzemissionsmaxima der Proben wurden in einem Diagramm über der dazugehörigen Konzentration aufgetragen. Die so erstellte Eichgerade ermöglichte es anhand der gemessenen Fluoreszenzintensität einer Probe markierter RNAs die Konzentration der Probe zu ermitteln. Zur Bestimmung und Optimierung der Einbaueffizienz des Fluoreszein-markierten Initiators wurden Transkriptionspriming-reaktionen unter Variation der Transkriptionsbedingungen durchgeführt. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde so eine Einbaurate von 18% erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass grundsätzlich beide Inititatormoleküle zur Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek und den damit verbundenen Selektionsstrategien, Festphase oder Selektion in Lösung, angewendet werden können. Die Fluoreszein-basierende Selektionsstrategie hätte den Vorteil einer direkteren Identifizierung und spezifischeren Quantifizierung der funktionalisierten RNA-Bibliothek.
Es wurden vier Nukleosid-Analoga hergestellt, deren Anwendungsbereiche gänzlich unterschiedlicher Natur sind. Sie stellen wichtige Hilfsmittel zur Erweiterung der Eigenschaften und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für die Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms geschaffen. Es wurde ein Assay für die in-vitro-Selektion vorgestellt und das zu diesem Zweck notwendige Schlüsselmolekül, ein Cytidin-Derivat, designt und mit einer Gesamtausbeute von 8 % synthetisiert. Das Nukleosid wurde in einer 16-stufigen Synthese mit zwei unterschiedlichen Linkereinheiten funktionalisiert und stellt ein effektives Werkzeug zur Selektion von Cytidindesaminase-Ribozymen dar. Das bifunktionalisierte Cytidin-Substrat wurde über seine 5’-OH Gruppe mit einem Hexaethylenglykol-Linker versehen, der eine primäre Aminogruppe aufwies. Über eine kurze Linkereinheit an der C4-Position der Nukleobase wurde ein Biotinrest angefügt. Die angestrebte Selektionsstrategie sieht die Oxidation des 3’-Endes einer RNA-Bibliothek mittels Natriumperiodat vor. Das resultierende Dialdehyd soll anschließend mit der primären Aminogruppe des Cytidin-Derivats umgesetzt werden. Ein Protokoll zur Anbindung des synthetisierten Cytidins an eine an ihrem 3’-Terminus oxidierte RNA wurde entwickelt und steht für die zukünftige Selektion zur Verfügung. Der Nachweis des Konjugats aus RNA und dem Cytidin-Derivat erfolgte mittels HPLC, sowie massenspektrometrisch. Die RNA-Bibliothek zur Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms wurde ausgehend von zwei Klenow-Primern hergestellt und steht ebenfalls bereit. Parallel zu den Arbeiten der Synthese des Cytidins, wurden im Rahmen zweier Kooperationen drei weitere Nukleosid-Analoga dargestellt. Das erste Kooperationsprojekt sah die Herstellung einer kurzen RNA vor. Es handelte sich dabei um die hochmodifizierte Anticodonschleife der tRNA(Lys) aus E. coli. Zur chemischen Festphasensynthese dieser 17mer RNA waren die Phosphoramiditbausteine von N6-Threonylcarbamoyladenosin (t6A) und 2-Thiouridin (s2U) erforderlich. Die Synthesen der Nukleosid-Analoga t6A und s2U, sowie deren Umwandlungen in die jeweiligen Phosphoramidite wurden vorgestellt. Die Darstellung von s2U erfolgte nach Protokollen von Vorbrüggen und Strehlke mit einer Gesamtausbeute von 78 %.Während des Schutzes der 2’-OH Gruppe mit TBDMS, bildete sich hauptsächlich das 3’-O-TBDMS-Isomer, das sich nur sehr schwer vom 2’-O-TBDMS-Isomer separieren ließ. Durch Verwendung der Schutzgruppe Di-tert-butylsilandiylditriflat zur Synthese des s2U-Phosphoramidits konnte das Problem der Bildung des 3’-O-TBDMS-Isomers behoben werden. Die erste Synthese eines t6A-Derivats orientierte sich an Vorschriften von Davis et al. und lieferte das Produkt mit einer Gesamtausbeute von 25 % über 7 Schritte. Darüber hinaus wurde eine zweite Synthesestrategie entworfen, die auf der Verwendung eines Isocyanats von L-Threonin basierte. Die Aminosäure Threonin wurde mit zwei verschiedenen Silylschutzgruppen versehen, die beide kompatibel mit der Phosphoramiditchemie während der chemischen RNA-Synthese waren. Das Isocyanat wurde mit guten Ausbeuten dargestellt und anschließend sowohl mit ungeschütztem, als auch mit geschütztem Adenosin zur Reaktion gebracht. In beiden Fällen wurde ein t6A-Derivat erhalten. Die Umsetzung mit einem geschützten Adenosin lieferte das t6A-Derivat mit einer Gesamtausbeute von 20% über 8 Stufen. Es wurde somit eine – in Bezug auf Ausbeute und Arbeitsaufwand – gleichwertige Alternativsynthese zur Darstellung von t6A-Derivaten entwickelt. Aus den beiden modifizierten Nukleosiden s2U und t6A wurden die Phosphoramidit-Bausteine generiert. Durch den erfolgreichen Einbau beider Nukleoside in eine 17mer RNA konnte die Anticodon-Schleife der tRNALys hergestellt werden. Die Bearbeitung des zweiten Kooperationsthemas erforderte die Herstellung eines isotopenmarkierten Pseudouridins. Es wurde eine vergleichende Synthese von 15N- markiertem Pseudouridin durch Adaption zweier unterschiedlicher Protokolle durchgeführt. Die erste Strategie, eine 7-stufige Synthese, lieferte die Zielverbindung mit einer Ausbeute von 2% über alle Schritte ausgehend von D-Ribose. Bezogen auf den 15N-Harnstoff betrug die Gesamtausbeute 14 %. Grund für die geringe Gesamtausbeute war eine unvermeidliche Isomerisierung der beta-Form der D-Ribose zum nicht reagierenden alpha-Anomer während der Lacton-Bildung, sowie der geringe Umsatz während der Reaktion mit dem 15N-angereicherten Harnstoff. Die zweite Strategie gab das 15N-markierte Pseudouridin mit einer Gesamtausbeute von 9 % über 9 Schritte. Für die Synthese von Uracil wurde eine alternative Vorschrift verwendet, bei der Propinsäure mit Harnstoff umgesetzt wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auf karzinogene Lösungsmittel, sowie anderer Reagenzien ohne Ausbeuteverluste verzichtet werden konnte.