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Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
Die Kv7-Kaliumkanalöffner Flupirtin und Retigabin waren wertvolle Alternativen bei der Pharmakotherapie von Schmerzen und Epilepsie. Beide Wirkstoffe werden aufgrund von unerwünschten Arzneimittelwirkungen derzeit jedoch nicht mehr eingesetzt. Die Flupirtin-induzierte Hepatotoxizität und die durch Retigabin hervorgerufenen Gewebeverfärbungen scheinen dabei auf den ersten Blick nicht zusammenzuhängen. Gleichwohl lassen sich wahrscheinlich beide Nebenwirkungen auf das gemeinsame oxidationsempfindliche Triaminoaryl-Grundgerüst zurückführen, welches zur Bildung von reaktiven Chinondiimin-Metaboliten neigt. Da hingegen der Wirkungsmechanismus, d. h. die Öffnung der Kv7-Kanäle, nicht an der Toxizität beteiligt zu sein scheint, hatte diese Arbeit zum Ziel, sicherere Alternativen für Flupirtin und Retigabin zu entwickeln. In einem Liganden-basierten Ansatz wurde eine Umgestaltung des Triaminoaryl-Kerns, den beide Wirkstoffe gemeinsam haben, vorgenommen, was zu Carba-Analoga führte, die durch eine erhöhte Oxidationsbeständigkeit sowie ein vernachlässigbares Risiko für die Bildung von chinoiden Metaboliten charakterisiert sind. Zusätzlich zu diesen verbesserten Sicherheitsmerkmalen offenbarten einige der neuartigen Derivate eine überlegene Kv7.2/3-Kanalöffnungsaktivität. Im Vergleich zu Flupirtin konnte die Potenz der Verbindungen um den Faktor 150 gesteigert werden, während die intrinsische Aktivität auf bis zu 176 % verbessert werden konnte, was die betreffenden Carba-Analoga zu vielversprechenden Kandidaten für eine weitergehende Entwicklung macht. Andererseits ermöglichten einige inaktive Verbindungen sowie die insgesamt deutlich abgestuften Kv7.2/3-Aktivitätsdaten die Etablierung von validen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Hypothesen zum Bindungsmodus, die mit Dockingergebnissen und Molekulardynamik-Simulationen korrelierten.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Die zielgerichtete Steuerung einer Arzneiform zu einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltraktes ist ein wesentlicher Punkt, wenn es um die Erhöhung der Bioverfügbarkeit und um die Verringerung von möglichen Nebenwirkungen geht. Im Zuge dessen macht man sich die physiologischen Unterschiede entlang des Verdauungstraktes zu Nutze, die unter anderem den pH-Wert, die Transitzeiten oder die Enzymausstattung betreffen. Verschiedene Faktoren wie Nahrungsaufnahme oder pathophysiologische Veränderungen können allerdings dazu führen, dass pH-, Zeit- oder Enzym-getriggerte Darreichungsformen versagen und ihren Wirkstoff entweder zu früh, zu spät oder gar nicht freisetzen. Durch die Entwicklung neuer Arzneiformen, die ihren Wirkstoff aufgrund eines definierten Drucks freigeben, könnten diese Probleme unter Umständen vermieden werden. Weiterhin kann die Bioverfügbarkeit besonders von schwer löslichen Wirkstoffen negativ beeinflusst werden durch den Zeitpunkt und die Dauer der Desintegration einer Arzneiform und das Fehlen der dafür erforderlichen Wassermengen im Gastrointestinaltrakt. Besonders bei Wirkstoffen mit einem engen Absorptionsfenster im oberen Dünndarm ist ein schneller Lösungsprozess des Wirkstoffs einer Arzneiform wichtig, um eine optimale Absorption zu gewährleisten. Aus diesem Grund bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Entwicklung neuer drucksensitiver Darreichungsformen, die ihren Inhalt bei einem definierten Druck von 300 mbar, wie er am Pylorus vorherrscht, schlagartig und komplett freisetzen. Dabei sollten die Arzneiformen vor ihrer Entleerung weder durch eine verlängerte Magenverweilzeit noch durch den sauren pH-Wert des Magens angegriffen werden, um eine verfrühte Wirkstofffreisetzung zu vermeiden. Die entwickelten Darreichungsformen sollten den Wirkstoff entweder in bereits gelöster Form oder dispergiert in einer flüssigen Grundlage enthalten, die sich nach Zerplatzen über die Dünndarm-Schleimhaut verteilen und durch eine verlängerte Kontaktzeit die Absorptionsrate erhöhen kann. Für die entwickelten Arzneiformen wurden Methoden zur Gehaltsbestimmung entwickelt, um die Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit einschätzen zu können. Weiterhin wurde ein dreistündiger Freisetzungsversuch in der Paddle-Apparatur zur Simulation einer verlängerten Magenverweilzeit durchgeführt. Bruchfestigkeitsuntersuchungen am Texture Analyser sollten die Beeinflussung der aufzuwendenden Kraft in Bezug zu individuellen Parametern, wie Polymerbeladung oder Konzentration beurteilen. Mit Hilfe der Stresstest-Apparatur wurde die direkte Einwirkung von Druck im Bereich zwischen 100 und 500 mbar untersucht, und unter Verwendung eines Magenentleerungsprogramms das Verhalten der Darreichungsformen im nüchternen Magen und bei der Pyloruspassage simuliert. Es wurden sechs unterschiedliche Darreichungsformen entwickelt, deren Eignung als drucksensitive Arzneiform anhand der genannten Prüfungen untersucht wurde. Die Entwicklung der Agar-Kugeln beruhte auf der Eigenschaft des Gelbildners spröde Matrizes zu bilden, deren Bruchverhalten durch Veränderung der Konzentration oder durch eine definierte Trocknungszeit beeinflusst werden konnte. Das Prinzip der Hartfett- und PEG-Kugeln beruhte darauf, dass Hilfsstoffe, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen, mit einem wasserunlöslichen Polymer überzogen wurden, der aus der Arzneiform bei Eintritt in den Körper einen flüssigkeitsgefüllten Ballon bildete. Die mit Ethylcellulose überzogenen Paraffin-Kapseln sollten durch das Einfügen einer Sollbruchstelle in Form von acht radial angeordneten Löchern zerplatzen und ihren Inhalt freigeben. Das wässrige Medium sollte durch die Löcher eindringen, die innere Gelatinekapsel anlösen und somit zu einer dünnen Polymer-Schicht führen, die auf Druck nachgeben und den Inhalt komplett freisetzen sollte. Die entwickelten Tristearin-Kapseln bestanden aus einer festen, spröden, wasserabweisenden Hülle aus einem hochschmelzenden Hartfett, mit welchem in flüssiger Form handelsübliche Gelatine-Kapseln innenbeschichtet werden konnten und wurden mit einem wirkstoffhaltigen Hydrogel gefüllt. Bei den Kaugummi-Tabletten sollte ein dünner Mantel aus lipophiler Kaugummi-Grundmasse die Arzneiform vor dem Einfluss wässriger Medien schützen. Ein enthaltener Kern aus Hartfett, welcher bei Körpertemperatur schmilzt, sollte zusätzlich dafür sorgen, dass das Gerüst der Tablette instabil wird und sie durch definierte Druckeinwirkung zum Platzen gebracht wird. Eingefügte Sollbruchstellen sollten das Platzen steuern und ein anschließendes Dippen in eine heptanhaltige Kaugummilösung sollte die Arzneiformen soweit stabilisieren, dass sie nicht bereits bei zu niedrigen Drücken zerbrachen. Unter den entwickelten Darreichungsformen erwiesen sich vor allem die Tristearin-Kapseln und die Hartfett-Kugeln als sehr geeignet für eine drucksensitive Freisetzung, während für die anderen Arzneiformen weitere Modifikationen notwendig wären.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Koronare Drug-eluting Stents sind röhrenförmige, netzartig aufgebaute, medizinische Implantate aus meist metallischen Grundkörpern, die zur Vermeidung eines erneuten Gefäßverschlusses mit Wirkstoff beschichtet sind. Derzeit finden die Beschichtungen der Stents typischerweise über speziell entwickelte Einzelbeschichtungsverfahren statt, die es ermöglichen, die feingliedrige und fragile Struktur der Implantate zu beschichten. Wesentliche Nachteile dieser Verfahren liegen allerdings in hohen Materialverlusten und geringer Fertigungs¬menge, die zu hohen Produktionskosten führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung von Stents eingesetzt werden kann. Die Wirbelschichttechnologie stellt ein etabliertes Verfahren zur Beschichtung von Partikeln im Großmaßstab mit geringen Verlusten dar. Obwohl in der Literatur das Verhalten verschiedener Partikel (Größe, Form, Dichte) in der Wirbelschicht beschrieben ist, wurde das Verhalten von netzartig aufgebauten Hohlkörpern noch nicht untersucht. Inwiefern sich die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung der fragilen Stents eignet, ist daher nicht vorhersagbar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Beurteilung hinsichtlich der Anwendbarkeit des Wirbelschichtverfahrens zur Beschichtung von Stents erfolgen. Dazu wurde das Fluidisierungs-verhalten der Körper unter Verwendung verschiedener Anströmböden untersucht. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Prozessparameter, verschiedener Beschichtungsrezepturen und Stenttypen auf die Qualität der Beschichtung untersucht. Dazu wurden die beschichteten Körper hinsichtlich Homogenität und Defekte der Oberfläche, ihrer Robustheit gegenüber mechanischen Einflüssen, der Schichtverteilung und Gehaltsgleichförmigkeit und des Wirkstofffreisetzungsverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Stents den Partikel der Geldart- Klasse D zugeordnet werden und die Beschichtungen der Stents erfolgte unter Verwendung eines speziell angefertigten konisch ausgeformten Anströmbodens. In Versuchen mit verschiedenen Beschichtungsmaterialien war es möglich typischer Weise auftretende Beschichtungsdefekte und präventive Gegenmaßnahmen zu identifizieren. So zeigte sich, dass es unter Verwendung von wässrig dispergierten Beschichtungsmaterialien die Bildung von Brücken oder Schwimmhäuten ausblieb, während diese typischer Weise unter Verwendung von organisch gelösten Beschichtungsrezepturen auftraten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es durch Anpassung der Prozessparameter möglich war Beschichtungen mit hoher Qualität zu erzeugen. Dabei wurden unabhängig von der Lackrezeptur leichter Abrieb, Risse oder Deformationen der Stentgrundkörper vor allem an den Stentenden beobachtet, da die Stents während des Beschichtungsprozesses einer starken mechanischen Belastung ausgesetzt waren. In Versuchen mit unterschiedlichen Auftragsmengen beziehungsweise Prozesszeiten und unterschiedlich langen Stents konnte gezeigt werden, dass die Defekte unter gleichbleibenden Bedingungen mit zunehmender Prozesszeit und abnehmender Stentlänge zunehmen. Zudem zeigte sich, dass auch die Prozessparameter und Flexibilität der Beschichtung Einfluss auf den Anteil defekter Stents nimmt. Durch Adaptierung des Beschichtungsprozesses ist es entsprechend möglich die Defekte zu reduzieren. In der Regel wurde ein etwas höherer abluminaler Schichtauftrag erzielt, wobei die Schicht homogen über die gesamte Stentlänge verteilt war. Es resultierten üblicherweise Abscheideraten des Beschichtungslackes von 40 - 50 % und darüber hinaus konnten durch die gleichzeitige Beschichtung einer hohen Stückzahl von Grundkörpern Fertigungsmengen von umgerechnet bis zu 25 Stents pro Minute erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Wirbelschichttechnologie ein vielversprechendes Verfahren zur Beschichtung von Stents im Großmaßstab darstellt, das in Bezug auf Ausbeute und Fertigungsmenge den derzeit herkömmlich verwendeten Beschichtungstechnologien überlegen ist, wobei die Qualität der erzeugten Beschichtungen vergleichbar mit der Beschichtungsqualität herkömmlich beschichteter Stents ist.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein auf dem Promotor Pdes basierendes Kälte-induzierbares Expressionssystem für B. subtilis konstruiert und sukzessive optimiert. Dazu wurden verschiedene Kälte-regulatorische DNA-Sequenzen aus B. subtilis an das entsprechende Zielgen fusioniert, was neben der Kälte-Induzierbarkeit in einem positiven Einfluss auf die Expressionsstärke durch eine effizientere Translation bzw. Stabilisierung der mRNA resultierte. Vorausgehend wurde in vergleichenden Versuchen die Eignung unterschiedlicher Galaktosidasen zur Verwendung als Reporterenzyme für B. subtilis untersucht. Hierbei wurde erstmals die heterologe Expression einer Kälte-angepassten β-Galaktosidase aus P. haloplanktis TAE79 in B. subtilis durchgeführt und diese durch die Integration der DB-Sequenz sowie einer stem-loop-Struktur aus der 5‘-UTR des B. subtilis cspB-Gens gesteigert. Somit konnte nachgewiesen werden dass sowohl die additiven Sequenzen der cspB-DB und der cspB-sl-UTR als auch des bkdB-Terminators zu einer deutlich erhöhten Synthese der entsprechenden Zielproteine führt. Anhand der Überexpression einer Xylanase aus B. subtilis sowie einer α-Glucosidase aus S. cerevisiae wurde abschließend die Eignung des konstruierten Systems für die sekretorische und intrazelluläre Proteinsynthese in B. subtilis demonstriert. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung von B. subtilis als Wirtsorganismus auch für die Überproduktion kritischer, schwer zu faltender Proteine.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus verschiedenen Arzneiformen hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Einerseits werden diese Methoden im Rahmen der routinemäßigen Qualitätskontrolle genutzt, andererseits können diese Methoden auch in einer frühen Phase der Entwicklung einer neuartigen Darreichungsform hilfreich sein. Weiterhin werden heutzutage auch biorelevante Aspekte in Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung eingebracht, um aus den Ergebnissen der In-vitro-Wirkstofffreisetzung mögliche In-vivo-Profile vorherzusagen. Aufgrund der steigenden Anzahl an langwirksamen Arzneimitteln auf dem Markt wird die Nachfrage nach beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung auch von Seiten der Behörden steigen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von diskriminierenden und beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unterschiedlicher Partikelgrößen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Methode sollte es demnach möglich sein, trotz Beschleunigung der Methode zwischen den verschiedenen Partikelgrößen, welche in einem Bereich von 8-41 μm lagen, zu unterscheiden. Zunächst wurde die Sättigungslöslichkeit von LNGB in verschiedenen Medien, welche später in den Freisetzungsuntersuchungen eingesetzt werden sollten, bestimmt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von LNGB in den Freisetzungsmedien wurde diesen eine variierende Menge an SDS zugesetzt, um die Löslichkeit zu steigern. Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung wurden Methoden sowohl für die Blattrührer-Apparatur als auch für die Durchflusszelle entwickelt.
In einer ersten Versuchsreihe in der Blattrührer-Apparatur wurde der Einfluss der zugesetzten Tensid-Menge auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Um in den Versuchen mindestens dreifache Sink-Bedingungen einzuhalten, wurden alle nachfolgenden Versuche mit einem Zusatz von 0,75 % SDS zu dem entsprechenden Freisetzungsmedium durchgeführt. In einem systematischen Screening wurde der Einfluss der Umdrehungsgeschwindigkeit, des Freisetzungsmediums und der Temperatur in der Blattrührer-Apparatur untersucht. In allen durchgeführten Versuchen konnten signifikante Unterschiede in den MDTs zwischen der Gruppe der kleineren Partikel (Suspensionen mit sehr kleinen und kleinen LNGB-Partikeln) und der Gruppe der größeren Partikel (Suspensionen mit mittleren und großen LNGB-Partikeln) beobachtet werden. Den größten Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen zeigte die Erhöhung der Temperatur von 37,0 °C auf 50,0 °C.
Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung in der Durchflusszelle wurde sowohl eine Methode unter Verwendung eines offenen Systems als auch eine Methode für die Verwendung der Durchflusszelle im geschlossenen System entwickelt. Für beide Modi wurde der Einfluss der Flussrate (10 mL/min vs. 20 mL/min) untersucht. Die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen im offenen System brachte einige Nachteile mit sich. So wurden innerhalb der ersten Minuten trotz entsprechender Filterpackung die LNGB-Partikel aus der Zelle herausgespült. Darüber hinaus wurde durch die relativ hohe Flussrate eine große Menge an Freisetzungsmedium benötigt. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der Temperaturerhöhung auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unter Verwendung der Durchflusszellen-Methoden nur im geschlossenen System untersucht. Ähnlich wie bei den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung in der Blattrührer-Apparatur zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung aus den Suspensionen bei 37,0 °C und 50,0 °C. Eine Unterscheidung zwischen der Gruppe der kleineren LNGB-Partikel und den größeren LNGB-Partikeln war bei den verschiedenen Flussraten und auch unter den Testbedingungen der erhöhten Temperaturen möglich.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen bioprädiktiven Freisetzungsmodells für Vaginalringe. Dieses neue Modell sollte in der Lage sein, den sogenannten burst release, welcher für Vaginalringe des Reservoir-Typs beobachtet werden kann, in vitro zu erfassen. Als burst release wird eine im Vergleich mit der täglichen Freisetzungsrate initial höhere Freisetzungsrate bezeichnet, welche zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Die untersuchten Formulierungen, der NuvaRing® und der Cyclelle®-Ring, sind Vertreter der Vaginalringe vom Reservoir-Typ. Vaginalringe vom Reservoir-Typ bestehen aus einem Kernpolymer, welches die beiden Steroidhormone EE und ENG enthält. Das Kernpolymer wird wiederum von einer wirkstofffreien Membran umgeben, welche die Wirkstofffreisetzung der Steroidhormone aus dem Kernpolymer maßgeblich steuert. Während der Lagerung solcher Vaginalringe vom Reservoir-Typ diffundieren EE und ENG in die Membran, bis in dieser die beiden Wirkstoffe in einem gesättigten Zustand vorliegen. Aufgrund der Sättigung der Membran kommt es nach Einsetzen des Vaginalrings zum Auftreten des burst release. In bisherigen Versuchen zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen mit einfachen Shake-flask-Methoden wurde der burst release nicht erfasst, da häufig nur alle
24 h eine Probennahme und anschließend ein kompletter Tausch des Freisetzungsmediums erfolgte.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell sollte biorelevanter gestaltet werden als die bisherigen Shake-flask-Methoden. Daher wurden in dem neuen Modell zwei weitere Kompartimente integriert, welche die Absorption der Steroidhormone ähnlich der In-vivo-Situation, berücksichtigen sollten. Da die Daten, welche mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erhoben wurden, später mit In-vivo-Plasmaspiegeln aus klinischen Studien mit dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring korreliert werden sollten, wurden die Probennahmezeitpunkte für die In-vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus den klinischen Studien adaptiert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von EE und ENG und der geringen Volumina, welche im neuen Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, wurde den Freisetzungsmedien 0,5 % SDS zugesetzt, um zehnfache Sink-Bedingungen zu gewährleisten. Die Wirkstofffreisetzung aus dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring wurde sowohl mit der modifizierten Shake-flask-Methode als auch mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell bestimmt. Der burst release wurde mit dem neuen Freisetzungsmodell besser als mit der modifizierten Shake-flask-Methode erfasst. Auch die deklarierten täglichen Freisetzungsraten von 120 μg ENG und 15 μg EE aus den untersuchten Vaginalringformulierungen wurden in dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erreicht. Nach dem sogenannten burst release setzten beide untersuchte Formulierungen EE und ENG nach einer Kinetik 0. Ordnung frei. Die In-vitro-Freisetzungsdaten, welche einer Kinetik 0. Ordnung folgten, wurden mit den dekonvulierten In-vivo-Plasmaspiegeln korreliert. Für beide In-vitro-Methoden konnte für EE ein linearer Zusammenhang gefunden werden.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prüfung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen dar. Mit Hilfe des neuen Modells konnte der burst release aus Vaginalringen vom Reservoir-Typ besser erfasst werden als mit den bisher verwendeten Shake-flask-Methoden. Trotz der geringen Volumina, welche im neu entwickelten Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, konnten durch den Zusatz von 0,5 % SDS zehnfache Sink-Bedingungen in beiden Kompartimenten erreicht und während der Versuche eingehalten werden. Erste Korrelationen mit den aus In-vivo-Plasmaspiegeln berechneten absorbierten EE-Fraktionen und den kumulativ freigesetzten EE-Mengen zeigten einen linearen Zusammenhang zwischen der in vivo absorbierten Fraktion und der in vitro kumulativ freigesetzten Wirkstoffmenge.
Die Bedeutung der endothelialen Mechanotransduktion für vaskuläre Implantate: Das Apelin/APJ-System.
(2014)
Bei der Behandlung atherosklerotischer Gefäße mit vaskulären Implantaten spielt nicht nur die endotheliale Dysfunktion eine wichtige Rolle. Auch die Fähigkeit des Implantatmaterials, sich an die Gefäßwand anzupassen und dessen Biokompatibilität, sind von großer Bedeutung. Die Entwicklung von wirkstofffreisetzenden Stents (DES) konnte die Risiken nach Stentimplantation signifikant reduzieren. Jedoch gibt es Hinweise darauf, dass diese polymerbeschichteten DES Ursache für die Entstehung von Stent Thrombosen (ST) sein können - eine potentiell tödliche Komplikation. Die mechanischen Eigenschaften eines Materials, das in ein Gefäß eingebracht wird, können einen großen Einfluss auf die umliegenden Zellen haben. Die Bedeutung einer solchen Veränderung in der Umgebung einer Zelle und der Einfluss auf deren mechanische Eigenschaften und biologische Funktionen wird immer häufiger als Ursache für die Entstehung von In-Stent-Restenose (ISR) und ST diskutiert. Das Endothel dient als einzigartige Barriere zwischen dem fließenden Blut und der Gefäßwand, wodurch es permanent mechanischen Reizen ausgesetzt ist. Mechanosensitive Strukturen auf der Zelloberfläche übersetzen diese Stimuli in biochemische Signale. Die anschließende Translation in downstream Effekte moduliert die Zellfunktion. Zu dem mechanosensorischen Komplex um PECAM-1 gehören auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), welche an der flussabhängigen Regulation der NO-Freisetzung beteiligt sind. Im kardiovaskulären System werden der GPCR APJ und sein spezifischer Ligand Apelin vor allem von Endothelzellen und endokardialen Zellen exprimiert. Die Apelin-Isoformen Apelin-12 und Apelin-13 wurden in diesem Zusammenhang bisher als bioaktiv beschrieben. Obwohl das apelinerge System in vielen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, wurde es bisher nicht als Überträger mechanischer Reize in Betracht gezogen. In diesem Kontext ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, zunächst die physiologische Rolle des Apelin/APJ-Systems als Mechanotransducer in humanen Endothelzellen in einem in vitro Zellperfusionsystem zu charakterisieren. Weiterhin soll der Einfluss von Stentpolymeren auf die Zellfunktion und die endotheliale Mechanotransduktion untersucht werden.
Im Fokus dieser Arbeit standen die Wechselwirkungen zwischen nicht-thermischem Atmosphärendruck-Plasma und in-vitro kultivierten Keratinozyten (HaCaT-Keratinozyten) und Melanomzellen (MV3). Für die Untersuchungen wurden drei Plasmaquellen unterschiedlicher Bauart genutzt; ein Plasmajet (kINPen 09) und zwei Quellen, die das Plasma mittels der dielektrisch behinderten Entladung (Oberflächen-DBE, Volumen-DBE) generieren. Um grundlegende Effekte von Plasma auf Zellen analysieren zu können, wurde zunächst der Einfluss von physikalischem Plasma auf die Vitalität; die DNA und die Induktion von ROS untersucht. Folgende Methoden wurden verwendet: - Vitalität: - Neutralrotassay, Zellzählung (Zellzahl, Zellintegrität) - BrdU-Assay (Proliferation) - Annexin V und Propidiumiodid- Färbung, Durchflusszytometrie (Induktion von Apoptose) - DNA: - Alkalischer Comet Assay (Detektion von DNA-Schäden) - DNA-Färbung mit Propidiumiodid, Durchflusszytometrie (Zellzyklusanalyse) - ROS: - H2DCFDA-Assay, Durchflusszytometrie (Bestimmung der ROS-positiven Zellen) Neben den Folgen die die Plasmaquellen induzieren wurde weiterhin untersucht, welchen Einfluss das Behandlungsregime (direkt, indirekt, direkt mit Mediumwechsel), das Prozessgas (Argon, Luft) und die zellumgebenden Flüssigkeiten (Zellkulturmedien: IMDM, RPMI; Pufferlösungen: HBSS, PBS) auf das Ausmaß der Plasma-Zell-Effekte hatten. Die Verwendung aller Plasmaquellen führte in HaCaT-Keratinozyten und Melanomzellen (MV3) zu Behandlungszeit-abhängigen Effekten: - Verlust an vitalen Zellen und verminderte Proliferationsfähigkeit - Induktion von Apoptose nur nach den längsten Plasmabehandlungszeiten - DNA-Schäden 1 h nach Plasmabehandlung, nach 24 h deutlich weniger bzw. nicht mehr nachweisbar, Hinweise für DNA-Reparatur vorhanden - Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase zulasten der G1-Phase 24 h nach Plasmabehandlung - Anstieg der ROS-positiven Zellen 1 h und 24 h nach Plasmabehandlung Es wurde gezeigt, dass in RPMI-Medium kultivierte Zellen sensitiver, in Form von verminderter Vitalität und vermehrten DNA-Schäden, reagierten als in IMDM-Medium gehaltene Zellen. Aber auch während der Plasmabehandlung in Pufferlösungen (HBSS, PBS) gehaltene HaCaT-Zellen wiesen DNA-Schäden auf. Die direkte und indirekte Plasmabehandlung führte zu nahezu gleichen Ergebnissen. Ein Wechsel des Zellkulturmediums direkt nach der Plasmabehandlung schwächte alle gemessenen Effekte ab. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass neben der Art der Flüssigkeit und Behandlungszeit auch der Inkubationszeitraum der Zellen mit der in Plasma in Kontakt gekommenen Flüssigkeit von essentieller Bedeutung ist. Die durch Plasma induzierten reaktiven Spezies gelangen in die Flüssigkeit und interagieren mit den Wassermolekülen und den organischen Molekülen der Zellkulturmedien, welche langlebige Radikale (z.B. H2O2) bilden, die dann ihrerseits mit zellulären Molekülen reagieren. Die anderen Plasmakomponenten wie UV-Licht und elektrische bzw. magnetische Feldern scheinen nur eine untergeordnete Rolle in der Plasma-Zell-Interaktion zu spielen, da diese nur bei der direkten Behandlung mit den Zellen in Berührung kommen und die starken Auswirkungen nach der indirekten Behandlung nicht verursachen können. Die in diesen Untersuchungen verwendete Oberflächen-DBE konnte mit Luft oder mit Argon als Prozessgas betrieben werden. Wurde Argon als Prozessgas genutzt, kam es zu milderen Auswirkungen im Vergleich zur Plasmabehandlung im Luftmodus. Mit Luft generiertes Plasma weist neben ROS auch RNS in der Gasphase auf, letztere lassen sich im Argon-Plasma nicht nachweisen und stehen für Plasma-Zell-Interaktionen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu den humanen Keratinozyten wurden auch humane Melanomzellen mit Plasma (Oberflächen-DBE/Luft) behandelt. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen sind bei den MV3-Zellen geringere Behandlungszeiten nötig, um biologisch gleichwertige Effekte zu bewirken. Die hier verwendeten Testmethoden eignen sich für die biologische Charakterisierung von neuen Plasmaquellen bzw. für die Analyse von Plasma-Zell-Wechselwirkungen weiterer Zelllinien. Tiefergehende Untersuchungen, z.B. bezüglich der genaueren Spezifizierung der durch Plasma hervorgerufenen oxidativen DNA-Schäden und den daraus resultierenden Reparaturmechanismen, sollten folgen.
Bis heute ist die Haupterblindungsursache in den westlichen Industrienationen, die altersbedingte Makuladegeneration, nicht heilbar und aufgrund der zunehmenden Lebenserwartung der Bevölkerung wird die Anzahl an Neuerkrankungen zukünftig weiter steigen. Die intravitreale operative Medikamentengabe gilt als aktuelle Standardtherapie um das Fortschreiten eines Visusverlusts zu verzögern und kann in manchen Fällen eine deutliche Sehverbesserung bewirken. Überwiegend werden antiinflammatorische und antineovaskuläre Wirkstoffe in Form von intravitrealen Injektionen verabreicht, deren Nachteil jedoch ein verhältnismäßig kurzer Therapieeffekt in Hinblick auf die chronische Erkrankung des hinteren Augenabschnitts ist. Für längerfristig erfolgreiche Therapien sind zahlreiche Innovationen im Bereich der periokularen und intravitrealen Arzneistofffreigabesysteme in unterschiedlichen Phasen der Forschung und Entwicklung, deren Wirksamkeit und Sicherheit jedoch erst belegt werden muss. Für möglichst prädiktive Ergebnisse über das Verhalten von Arzneiformen in vivo sollten ausgewählte physiologische Parameter in Modellen und Testmethoden simuliert und nach aktuellem Wissensstand berücksichtigt werden können. Da die reale Situation des Glaskörpers älterer Patienten in Tiermodellen nur unzureichend widergespiegelt wird und die Nutzung von Simulationsmodellen zur Abschätzung des pharmakokinetischen Profils von Arzneistoffen oder Darreichungsformen aufgrund der lückenhaften Datenlage über den Glaskörper als Applikationsort oft limitiert ist, sollen zuverlässige In vitro-Testsysteme dazu beitragen, die unvollständige Datenlage mit In vitro Ergebnissen zu ergänzen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, humane Glaskörper aus der postmortalen Spende zu gewinnen und zu charakterisieren. Somit konnten die lückenhaften Literaturdaten zum humanen Glaskörper durch ausgewählte physikochemische Eigenschaften (pH Wert, Brechungsindex, Osmolalität, Gesamtproteingehalt, Wassergehalt) ergänzt werden. Zudem wurden Untersuchungen zur Glaskörperverflüssigung durchgeführt und erstmals eine altersbedingt zunehmende Inhomogenität des humanen Glaskörpers im Gegensatz zum Jungtiermodell (Schwein) gezeigt.
Weiterhin wurden die von Loch et al. beschriebenen Prototypen des Glaskörper- (GK-) Modells und des Eye Movement Systems (EyeMoS) in weiterer Anlehnung an die Situation in vivo modifiziert und ausgewählte Darreichungsformen hinsichtlich ihres Freisetzungs- und Verteilungsverhaltens im simulierten Glaskörper charakterisiert. In Ergänzung zu den Modellen von Loch et. al wurde neben einem standardisierten Injektionsverfahren zudem die Körpertemperatur, vielfältige Augenbewegungsmuster und der Zustand nach einer Vitrektomie in den modifizierten In vitro Modellen berücksichtigt. Für Langzeituntersuchungen bis über Monate bietet die neuartige und kostengünstige Testapparatur die Möglichkeit, 6 GK-Modelle gleichzeitig bei simulierten Augenbewegungen zu integrieren. Am Beispiel von intravitrealen Modellimplantaten mit dem klinisch häufig eingesetzten Wirkstoff Dexamethason wurde der Einfluss ausgewählter In vitro-Testmethoden und -Parameter im Hinblick auf die Wirkstofffreisetzung aus Implantaten untersucht. Je nach verwendeter Testapparatur, Testmedium und einer Probenahme- oder Transfermethode wurden erhebliche Unterschiede in den Freisetzungsprofilen von Dexamethason oder Fluorescein-Natrium aus PCL- oder PLGA-Modellimplantaten beobachtet, wodurch die Notwendigkeit zum Verständnis der zugrundeliegenden und freisetzungsbestimmenden In vivo-Parameter sowie deren Transfer in zuverlässige In vitro-Testsysteme hervorgehoben wurde.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die simulierte Glaskörperverflüssigung, wie sie für ältere Patienten beschrieben ist, im Vergleich zum homogen aufgebauten Glaskörper eine schnellere Verteilung der Injektionslösungen im GK-Modell zur Folge hat. Suspensionszubereitungen zeigten anstatt einer homogenen Verteilung im GK-Modell eine ausgeprägte Neigung zur Sedimentation, was am Beispiel des klinisch relevanten Triamcinolonacetonids verdeutlicht wurde. Der simulierte Zustand nach einer Vitrektomie mit anschließender Injektion der wirkstoffhaltigen Suspension resultierte ebenfalls in einer Sedimentation der Triamcinolonacetonid-Partikel, deren potentiell netzhautschädigende Effekte in klinischen Langzeitstudien untersucht werden sollte.
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit kritische In vitro- und In vivo-Parameter, die die Wirkstofffreisetzung und -Verteilung aus intravitrealen Darreichungsformen beeinflussen und die von großer Bedeutung für die Abschätzung des pharmakokinetischen Profils einer Arzneiform sein können.
Der Einfluss von kaltem Atmosphärendruckplasma auf die Melaninsynthese in humanen Melanozyten
(2020)
Das zur Behandlung von chronischen Wunden zugelassene Plasmagerät kINPen®MED wurde in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich eines möglichen Effektes auf die Pigmentierung der Haut in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst Untersuchungen an Melanomzellen durchgeführt. Verschieden stark pigmentierte Melanomzelllinien wurden einer indirekten Plasmabehandlung ausgesetzt, das heißt mit plasmabehandeltem Zellkulturmedium inkubiert, und der Melaningehalt wurde vor und nach der Behandlung durch eine UVspektroskopische Analyse evaluiert. Im Vergleich zu den unbehandelten Zellen war der Melaningehalt aller getesteten Melanomzelllinien erhöht. Auch im Vergleich zu Zellen, die mit den Positivkontrollen IBMX beziehungsweise NH4Cl / Tyrosin behandelt wurden, zeigte sich ein verstärkter Effekt der Plasmabehandlung auf die Pigmentierung der Melanomzellen. Da Melanomzellen nicht in erster Linie das Ziel von therapeutisch indizierten Beinflussungen der Pigmentierung sind, wurde im nächsten Schritt die Bestimmung des Melaningehaltes von primären Melanozyten nach in vitro-Plasmabehandlung durchgeführt. Dazu wurde zunächst die Methode zur relativen Melaninquantifizierung grundlegend überarbeitet. Es wurden zwei verschiedene Methoden zur verbesserten Melaninanalytik entwickelt, die hinsichtlich der benötigten Probenmenge im Vergleich mit der UV- spektroskopischen Melaningehaltsbestimmung im Melanomzellmodell eine höhere Sensitivität aufweisen. Die erste Methode basiert, wie in der Literatur beschrieben, auf der Oxidation des Melanins in alkalischer Lösung durch Wasserstoffperoxid und anschließender Analyse der melaninspezifischen Abbauprodukte. Die bestehende Methode wurde um eine massenspektrometrische Detektion der Abbauprodukte erweitert, was eine Reduktion der benötigten Probenmenge um den Faktor 10 ermöglichte bei Erhalt der Differenzierungsmöglichkeit zwischen Eumelanin und Phäomelanin. Die Analyse von primären Melanozyten nach indirekter Plasmabehandlung im Vergleich mit unbehandelten
Melanozyten ergab eine geringe Steigerung des Eumelaningehaltes in Melanozyten eines stark pigmentierten Spenders, der Phäomelaningehalt blieb unverändert. Der als
Positivkontrolle verwendete cAMP-Abbau-Inhibitor IBMX erhöhte sowohl den Eu- als auch den Phäomelaningehalt. Die zweite Methode zur Bestimmung des relativen Melaningehaltes beruht auf der Autofluoreszenz des Melanins, die bei einer Anregungswellenlänge von 785 nm im NIRBereich zu beobachten ist. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie konnte eine Einzelzellanalyse der primären Melanozyten hinsichtlich ihrer Autofluoreszenzintensität durchgeführt werden. Dabei korrelierten die erzielten Ergebnisse der relativen Intensitätsänderung mit denen der massenspektrometrischen Quantifizierung der Melaninabbauprodukte. Gegenüber der unbehandelten Kontrolle war der Melaningehalt nach indirekter Plasmabehandlung geringfügig gesteigert. Nach Behandlung der Zellen mit IBMX als pharmakologischer Positivkontrolle sowie infolge einer Behandlung mit direkter UVStrahlung als physikochemischer Positivkontrolle war jedoch ein stärkerer Effekt auf die Steigerung der Melaninproduktion als bei der indirekten Plasmabehandlung zu beobachten. Die in vitro erhaltenen Ergebnisse konnten auf ein komplexeres Modell übertragen werden, indem eine direkte Plasmabehandlung von Hautproben ex vivo durchgeführt wurde. Außerdem wurde auf diese Weise ein Vergleich zwischen direkter Plasmabehandlung und UVStrahlung neben der unbehandelten Kontrolle möglich. Dazu wurden aus den Hautproben nach Behandlung und anschließender Inkubationszeit Kryoschnitte angefertigt. Um das enthaltene Melanin sichtbar zu machen, wurden die Schnitte einer Silbernitratfärbung unterzogen. Die an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommenen Bilder wurden anschließend mit Hilfe zweier Softwares ausgewertet und die Ergebnisse verglichen. Insgesamt lässt sich trotz starker Schwankung der Ergebnisse beobachten, dass eine wiederholte direkte Plasmabehandlung eine Steigerung der Pigmentierung bewirkt, wenn auch in schwächerem Ausmaß, als dies nach UV-Bestrahlung zu beobachten ist. Insgesamt konnte durch Analyse des Melaningehaltes mit grundlegend unterschiedlichen Methoden wiederholt beobachtet werden, dass eine Plasmabehandlung einen geringen Effekt auf die Pigmentierung humaner Melanozyten ausübt. Dieser Effekt ist bei Behandlungszeiten, wie sie für den kINPen®MED zur Wundbehandlung empfohlen sind, im Vergleich zu einer UVBestrahlung beziehungsweise im Vergleich mit einer pharmakologischen Induktion der Melanogenese deutlich niedriger. Eine Intensivierung der Pigmentierung im Rahmen einer Wundbehandlung ist demnach nicht zu erwarten. Nichtsdestotrotz übt die Plasmabehandlung einen, wenn auch geringen, Effekt auf die Melaninproduktion in der humanen Haut aus. Um etwaige beteilige Enzyme an der gesteigerten Melaninproduktion zu erkennen, wurden Genexpressionsanalysen durchgeführt. Durch die Untersuchung der differenziellen Expression mittels Microarray konnte für 287 annotierte Gene eine Änderungen der Expression festgestellt werden, davon konnten 2 Gene identifiziert werden, für die ein Zusammenhang mit der Pigmentierung beschrieben ist. Veränderte Expressionslevel der hauptsächlich an der Melaninsynthese beteiligten Enzyme wurden durch die Plasmabehandlung der Melanozyten nicht detektiert. Die Untersuchung einiger ausgewählter, an der Melanogenese beteiligter Enzyme mittels qPCR führte zum selben Ergebnis: durch die getesteten Parameter der indirekten Plasmabehandlung wurden keine biologisch relevanten Änderungen des Transkriptionslevels hervorgerufen. In der vorliegenden Arbeit wurde umfassend gezeigt, dass das Medizinprodukt kINPen®MED in den durchgeführten in vitro Tests einen vergleichsweise geringen Effekt auf die Pigmentierung ausübt, der den Positivkontrollen unterlegen ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass der kINPen®MED keinen geeigneten Modulator der Pigmentierung darstellt. Gleichzeitig unterstreichen die Resultate die Unbedenklichkeit der sachgemäßen Anwendung des kINPen®MED an der humanen Haut hinsichtlich etwaiger Melanin-bedingter Veränderungen. Es ist weder eine sichtbare Verstärkung der Pigmentierung noch eine Depigmentierung zu erwarten. Zudem wurde durch die Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Melaninanalytik ein Beitrag zur zukünftigen Testung von Pigmentierungsmodulatoren in Zellkulturmodellen geleistet.
Marine Organismen haben sich im Laufe der Evolution hervorragend an die besonderen Bedingungen unter Wasser angepasst. Diese Tatsache führte aufgrund von Adaptationsprozessen unter anderem zur Bildung neuer biologisch aktiver Naturstoffe, die sich in ihrer Struktur und Wirkung häufig von bekannten terrestrischen Naturstoffen unterscheiden. Während Makroorganismen marinen Ursprungs schon länger intensiv untersucht werden, nahm das Interesse an marinen Mikroorganismen erst in den letzten zehn Jahren stark zu. Pilze im marinen Habitat wurden sehr spät beschrieben. Die ersten Funde wurden 1869 bekannt, doch erst in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde langsam klar, dass auch im marinen Lebensraum eine reichhaltige Pilzflora zu finden ist. Hierbei stellen besonders Mikroorganismen des marinen Habitats wichtige potentielle Quellen auf der Suche nach neuen pharmakologisch aktiven Wirkstoffen dar, da ihre biotechnologische Fermentation in nahezu unbegrenzter Menge möglich ist, ohne dass eine Ausbeutung begrenzter natürlicher Ressourcen erfolgen muss. Im Vordergrund dieser Arbeit stand daher die Isolierung bioaktiver Naturstoffe aus marinen Pilzen. Die Pilze wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert, mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und die Extrakte chemisch analytisch sowie auf ihre antimikrobielle Aktivität hin untersucht. Biologisch aktive sowie analytisch aussichtsreich erscheinende Extrakte wurden zur Isolierung der in ihnen enthaltenen Sekundärstoffe ausgewählt. Die Naturstoffisolierung sowie die nachfolgende Strukturaufklärung erfolgten mithilfe verschiedener chromatographischer sowie spektroskopischer Methoden (HPLC, LC-MS, NMR, DC, verschiedene säulenchromatographische Techniken). Isolierte Reinsubstanzen wurden auf ihre biologische Aktivität gescreent. Aus dem Ethylacetat-Extrakt des taxonomisch bis jetzt nicht einordenbaren marinen Pilzes 222 konnten insgesamt elf verschiedene Verbindungen strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich 6-Deoxybostrycoidin (1), 5-Deoxyanhydrofusarubin (2) und Altechromone A (3) als bereits bekannte Verbindungen heraus. Die acht Verbindungen Balticol A-F (4, 5, 6, 7, 8, 9), Balticofuran (10) und Balticolid (11) stellten sich als neue Naturstoffe heraus. In Biotests zeigte 6- Deoxybostrycoidin antibakterielle Aktivität gegen humanpathogene Keime (Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis) und fischpathogene Keime (Vibrio anguillarum, und Pseudomonas anguilliseptica). Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin¬dun¬g gegen fischpathogene Erreger wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Die neuen Verbindungen Balticol A-F (4-8) und Balticolid (11) zeigten starke antivirale Aktivität gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A. Am stärksten war die Wirkung von Balticol E (8) mit einem IC50-Wert von 0,01 µg/ml gegen HSV 1. Balticol D (7) zeigte auch antiinflammatorische Eigenschaften. Die neue Verbindung Balticofuran A (10) zeigte gute Radikalfängereigenschaften. Aus dem Pilz Lophiostoma sp. konnten drei Verbindungen isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich Oxasetin (12) , Erogosterolperepoxid (13) und Cerebrosid C (14) als bereits bekannte Verbindungen heraus, die aber zum ersten Mal aus Lophpiostoma sp. isoliert wurden. Das antibakteriell aktive Oxasetin war vorher nur aus dem Pilz Vaginatispora aquatica beschrieben worden. Oxsetin erwies sich im Test als antiviral aktiv gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A . Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin-dun¬g gegen fischpathogene Erreger und die antivirale Aktivität wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben.
Das In vitro-Testsystem der Gefäß-simulierenden Durchflusszelle (vessel-simulating flow-through cell, vFTC) ermöglicht die Untersuchung der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Arzneistoff-freisetzenden Stents (drug-eluting stents, DES) zwischen dem Perfusionsmedium, dem Hydrogelkompartiment und dem in der Stentbeschichtung verbliebenden Wirkstoffanteil. Die vorliegende Forschungsarbeit hatte zum Ziel, die physikochemischen Eigenschaften des Gefäß-simulierenden Gelkörpers (ein 3 %iges Alginat-Gel) unter Erhaltung definierter Materialeigenschaften wie Elastizität, Festigkeit und Formstabilität der Hydrogelkompartimente unter Perfusionsbedingungen zu verändern und den Einfluss der Einbettungsbedingungen auf die Wirkstofffreisetzung und -verteilung von mit Modellwirkstoffen-beschichteten Stents in der vFTC zu untersuchen. Die Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des Alginat-basierten Hydrogelkompartimentes konnte durch Integration des hydrophoben Adsorbens LiChroprep® RP-18 sowie durch den Austausch der wässrigen Phase durch die o/w-Emulsion Lipofundin erfolgreich abgeschlossen werden. Dabei zeigte die 5 %ige LiChroprep-Formulierung eine schnelle Gelierung, ergab formstabile Gelkörper und beobachte Auswaschungseffekte des inkorporierten Adsorbens (bei einem Masseanteil im Gel von ≤ 10 %) unter Perfusion in der vFTC blieben aus. Eine maximale Änderungen der Verteilungseigenschaften ergab sich für die Kombination der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren mit dem LiChroprep-Gel (Verteilungskoeffizient von ~ 5). Im Rahmen der Freisetzungs- und Verteilungsuntersuchungen in der vFTC konnte eine Anreicherung im LiChroprep-Gel (gegenüber dem Alginat-Gel) beziehungsweise eine Änderung der Wirkstoffverteilung zwischen den Kompartimenten Freisetzungsmedium, Hydrogel und Stentbeschichtung jedoch nicht bestätigt werden. Die numerische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente zeigte jedoch, dass im Fall von Triamteren der Einfluss einer Gelhydrophobisierung auf die Freisetzung und Verteilung mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit des Modellwirkstoffes aus der Stentbeschichtung zunimmt. Für die In vitro-Testung von DES in der vFTC über einen verlängerten Versuchszeitraum von 28 Tagen konnten geeignete, Langzeit-stabile Gelformulierungen aus Agar, Agarose, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gefunden werden. Diese unterschieden sich hinsichtlich ihrer Herstellungstechnik, ihren Quellungseigenschaften, ihrer makroporösen Gelstruktur, ihren Verteilungs- und Diffusionseigenschaften sowie den Materialeigenschaften, Gelfestigkeit und Elastizität. Der Vergleich der mit Hilfe des Texture Analyser ermittelten Kraft-Deformations-Profile der Gelkörper vor und nach 28-tägiger Perfusion in der vFTC zeigte, dass die untersuchten Materialeigenschaften, Festigkeit und Elastizität, im Fall der Agarose-, Polyacrylamid- und Polyvinylalkohol-Gelkörper trotz kontinuierlicher Scherbeanspruchung durch Perfusion des Gellumens nahezu unverändert waren. Aufgrund der schnellen und simplen Herstellungstechnik, der milden Gelierungsbedingungen, der elastischen Eigenschaften und der nahezu unveränderten mechanischen Stabilität unter Flussbedingungen in der vFTC erscheint das Agarose-Gel der vielversprechendste Kandidat der für die vFTC neu entwickelten Gelformulierung zu sein. Die Untersuchung der Diffusions- und Verteilungseigenschaften in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten ergab eine Gleichverteilung der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren zwischen dem Agar-, dem Agarose- beziehungsweise dem Polyacrylamid-Gel und dem flüssigem Kompartiment, während für die Polyvinylalkohol-Formulierung eine minimale Anreicherung (Verteilungskoeffizient von ~ 2) im Hydrogel gezeigt werden konnte. Die Wirkstoffdiffusion im Gel variierte von 2 x 10-4 mm2/s für Polyvinylalkohol, 5 x 10-4 mm2/s für Alginat und Polyacrylamid bis 8 x 10-4 mm2/s für Agarose. Die theoretische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente-Methode ergab in Abhängigkeit unterschiedlicher Entleerungsgeschwindigkeiten aus dem Wirkstoffreservoir und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verteilungs- und Diffusionseigenschaften von Triamteren in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten die schnellste Wirkstofffreisetzung in das Gel und die höchste Wirkstoffanreicherung im Gel im Fall des Polyvinylalkohol-Gelkörpers. In Abhängigkeit unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Modellgel (bei konstantem Verteilungskoeffizienten- und gleichbleibenden Entleerungsgeschwindigkeiten aus der Polymerbeschichtung) konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Wirkstofffreigabe ins Freisetzungsmedium mit steigender Wirkstoffdiffusion im Hydrogel reduziert ist. Gleichzeitig ist die Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir gesenkt, während der absolut ins Hydrogel eluierte Wirkstoffanteil steigt sowie terminal anschließend langsamer ins Medium rückverteilt wird. So scheinen die physikochemischen Eigenschaften des Hydrogelkompartimentes im Rahmen der experimentell durchgeführten Gelmodifikationen/Gelbildnersubstitution eine untergeordnete Rolle auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten der Modellwirkstoffe aus DES in der vFTC zu spielen. Die numerischen Modellierungen der experimentellen Wirkstofffreisetzung zeigen jedoch, dass eine Änderung der Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten im Hydrogel und in der Stentbeschichtung zu Konzentrationsunterschieden in den Verteilungskompartimenten führen kann. So nimmt mit zunehmender Hydrophobisierung des Hydrogelkompartimentes, mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir und einer verlangsamten Diffusion im Hydrogel der Einfluss des Hydrogelkompartimentes auf die Wirkstofffreisetzung und verteilung in der vFTC zunimmt.
Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten Methoden und Systeme kombinieren. Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus 30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen. Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen Schlauch zugeführt wurde, separiert. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt, während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen ausschließlich bei Körpertemperatur. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden. In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse¬systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden. Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten Pumpen lieferte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Herstellungsverfahren der wässrig-fermentativen Frischpflanzenextraktion nach HAB, Vs. 33 und 34 sowie die dabei ablaufenden biochemischen und mikrobiologischen Reaktionen zu betrachten. Neben der Extraktion findet begleitend eine Fermentation statt und die daraus entstehende Urtinktur wird bis zur Weiterverarbeitung mindestens 6 Monate gelagert. Diese drei Prozessschritte -Extraktion, Fermentation, Lagerung- können Einfluss auf die Qualität der Urtinktur nehmen. Es sollte daher geklärt werden, welche bio- und phytochemischen Reaktionen bei der Herstellung und anschließenden Lagerung einer wässrig-fermentierten Urtinktur ablaufen und welche Mikroorganismen daran maßgeblich beteiligt sind.
In diesem Zusammenhang wurden Extrakte aus Atropa belladonna, blühendes Kraut hergestellt und durch Variation bestimmter Herstellungsparameter die Robustheit des Verfahrens überprüft.
Folgende Parameter wurden variiert:
Rezepturbestandteile:
· Honig und Lactose-Monohydrat
· Molke
· Starterkultur
· Asche
Herstellungsschritte:
· Erntezeitpunkt
· Waschen der Pflanze
· Mazerationstemperatur
· Zeitpunkt des Abpressens
· Sauerstoffzutritt
· Dauer der Reifezeit
Weiterhin erfolgte ein Vergleich zwischen diesem Extraktionsverfahren mit der verbreiteten ethanolischen Frischpflanzenextraktion. In den Jahren 2006-2009 wurden insgesamt 106 wässrig-fermentierte Urtinkturen und 4 ethanolische Auszüge hergestellt.
Da im Verlauf der Lagerung in einigen wässrig-fermentierten Urtinkturen Abnahmen des Atropingehaltes beobachtet wurden, wurde zur Klärung das Verhalten von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen untersucht.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass an der Fermentation in erster Linie Milchsäurebakterien beteiligt sind, die durch Zuckerabbau Milchsäure, daneben auch Acetat und Ethanol, bilden. Als verantwortliche Milchsäurebakterien konnten vor allem der homofermentative Lactobacillus plantarum und der heterofermentative Lactobacillus brevis isoliert und identifiziert werden. Hierbei war in der Hauptfermentationsphase eine Dominanz von Lactobacillus plantarum erkennbar. Die Kultivierung von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen zeigte, dass das Wachstums- und Fermentationsverhalten der gewünschten Milchsäurebakterien durch Atropin nicht negativ beeinflusst wird.
Bei dem betrachteten Herstellungsverfahren kann ein Verlust des Wirkstoffs Atropin unter Einhaltung einer ausreichenden Säuerung ausgeschlossen werden. Damit ist die wässrig-fermentative Urtinkturherstellung hinsichtlich der Atropinextraktion unter Einhaltung bestimmter Herstellungsregeln als ebenso effektiv und robust anzusehen wie die ethanolische Frischpflanzenextraktion. Unterschiedliche Gehalte zwischen ethanolischen und wässrig-fermentierten Extrakten ließen sich bei Scopoletin, Flavonoiden und einer im Rahmen der Arbeit nachgewiesenen Substanz X feststellen.
Das untersuchte Herstellungsverfahren führte in den meisten Fällen zu einem stabilen Extrakt, wobei sich Mikroflora und Fermentationsverläufe trotz Variation der Herstellungsparameter ähnelten. Auf Grund der Variabilität der mikrobiologischen Flora des Pflanzenmaterials unterliegt die Fermentation unter den Bedingungen des Homöopathischen Arzneibuchs allerdings natürlichen Schwankungen. Dies führte in einigen Fällen zu einer nicht spezifikationskonformen Urtinktur. Deswegen wurden für eine optimierte Herstellung die Zugabe einer Starterkultur, der Zusatz von Molke, eine durchgängige Mazeration bei 37 °C, eine flexible Anpassung des Kohlenhydratbedarfs, Sauerstoffausschluss während der Mazerationswoche, eine kürzere, für den Fermentationsverlauf individuelle Lagerungszeit und die Berücksichtigung des Wassergehaltes des Pflanzenmaterials empfohlen. Da die Ergebnisse der Arbeit mit den Untersuchungen anderer pflanzlicher Materialien Sauerkraut, Sauerteig, Silage) in Einklang stehen, ist davon auszugehen, dass diese Empfehlungen auch bei anderen Pflanzen die Herstellsicherheit erhöhen und zu einer reproduzierbaren Extraktqualität führen.
Eukaryotische Mikroalgen werden seit einigen Jahrzehnten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffproduzenten intensiv untersucht, wobei bisher nur wenige potentiell nutzbare Verbindungen identifiziert wurden. Trotzdem lässt alleine die riesige Artenvielfalt die Vermutung zu, dass es Produzenten interessanter Sekundärstoffe geben muss. In den letzten Jahren zeigte sich außerdem, dass Mikroalgen Lieferanten von Wertstoffen, beispielsweise im Bereich der regenerativen Energien, sein können. Hier sind vor allem die hohen Kultivierungskosten und die geringe Produktausbeute noch zu überwindende Hürden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 70 eukaryotische Mikroalgenstämme auf ihre Eignung als Produzenten neuartiger Wirk- und Wertstoffe untersucht. Außerdem wurde durch Variation der Kultivierungsbedingungen ermittelt, ob die Kultivierungskosten gesenkt und die Ausbeuten an relevanten Produkten aus Mikroalgen gesteigert werden können. Die untersuchten Mikroalgen stammten aus der Stammsammlung der Pharmazeutischen Biologie der Universität Greifswald, aus kommerziellen Stammsammlungen oder wurden aus Gewässerproben der Greifswalder Umgebung isoliert. Neue Isolate wurden mit molekulargenetischen Methoden identifiziert. Alle Mikroalgen wurden zunächst unter Standardbedingungen kultiviert, die Biomasse-Raum-Zeit-Ausbeute bestimmt und bewertet. Anschließend wurde die biochemische Zusammensetzung der Biomasse analysiert. Dazu wurden im Rahmen der Arbeit sechs Methoden zur Gesamtlipid-, Gesamtkohlenhydrat- und Gesamtproteingehaltsbestimmung sowie zur Analytik der Lipid- und Kohlenhydratzusammensetzung etabliert.
Die Algen zeigten bei Kultivierung unter Standardbedingungen Biomasseausbeuten bis 90 mg L-1 d-1. Die höchsten Wachstumsraten erreichten verschiedene Scenedesmus spp. Die biochemische Zusammensetzung der Algenbiomasse war sehr variabel. Häufig war jedoch der Proteinanteil mit ca. 50 % am höchsten, gefolgt von Kohlenhydraten mit etwa 30 % und einem Lipidanteil von ca. 10 %. Anhand der Modellalge Scenedesmus obtusiusculus konnte gezeigt werden, dass die Biomassezusammensetzung durch Variation der Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden kann. So führten erhöhte Beleuchtung sowie Nitrat- und Eisenmangel zu vermehrter Lipid- und Kohlenhydratakkumulation. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein neues Kulturmedium entwickelt, in dem die Modellalge lipid- und kohlenhydratreiche Biomasse ohne Wachstumseinbußen im Vergleich zum Standardmedium produziert. Durch Verwendung natürlicher Wasserquellen als Basis für das Kulturmedium konnten darüber hinaus die Kultivierungskosten deutlich reduziert werden. Durch die gleichzeitige Steigerung der Produktausbeute und Senkung der Kultivierungskosten konnte gezeigt werden, dass auch eine großtechnische Produktion von Wertstoffen aus Mikroalgen wirtschaftlich sein kann.
Zur Bewertung des Potenzials der Mikroalgen als Produzenten von interessanten Sekundärstoffen wurde beispielhaft die antimikrobielle Aktivität von Extrakten der Algenbiomasse untersucht. Es zeigte sich, dass vor allem lipophile Extrakte gegen grampositive Bakterien wirksam waren, wofür wahrscheinlich die in den Extrakten nachgewiesenen mehrfach ungesättigten FS verantwortlich sind. Einige Mikroalgenarten wiesen zudem einen hohen Betaglucangehalt auf. Diesen Polysacchariden werden, wenn bestimmte Strukturvoraussetzungen erfüllt sind, diverse gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen konnten bei einigen Algenarten mit einem Gehalt von bis zu 35 % deutlich höhere Werte im Vergleich mit anderen betaglucanreichen Lebensmitteln wie Getreide (bis 10 %) oder Pilzen (bis 25 %) erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass Mikroalgen neben ihrer Eignung als Wertstoffproduzenten auch interessante Wirkstoffe liefern können.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Neu isolierte und synthetisierte Wirkstoffe müssen neben ihrer biologischen Wirksamkeit auch auf ihre Unbedenklichkeit für den Menschen hin untersucht werden. Ein Bestandteil der Untersuchungen zur Unbedenklichkeit ist die Prüfung auf mögliche Immuntoxizität. Die Risikobewertung und -klassifizierung von (immun-)toxischen Substanzen erfolgt derzeit in Tierversuchen, die, abgesehen von ethischen Bedenken, zeit- und kostenintensiv sind und deren Übertragbarkeit auf den Menschen nicht vollständig gewährleistet ist.
Im Fokus dieser Arbeit stand die Etablierung und Anwendung eines Methodensets basierend auf funktionalen in vitro Methoden zur Charakterisierung immunologischer Wirkungen ausgewählter Naturstoffe. Dieses sollte der Beurteilung der immuntoxischen Wirkungen der getesteten Naturstoffe und der Entwicklung eines Entscheidungsbaums, der die Vorhersage des immuntoxischen Potentials mithilfe von in vitro Versuchen gestattet, dienen. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien (Jurkat-Zellen als Beispiel für T-Zellen, THP-1-Zellen als Beispiel für Monozyten) und für einige Versuche vergleichsweise primäre Blutzellen eingesetzt. Es wurden Methoden zur Untersuchung folgender Parameter etabliert und angewendet: Vitalität, Zellzyklusverteilung, Induktion von Apoptose, iROS, DNA-Schäden (Genotoxizität), Zytokinfreisetzung und mitochondriale Funktion. Folgende Naturstoffe wurden für die Untersuchungen ausgewählt: Mannitol und Urethan als Negativkontrollen, Cyclosporin A, Deoxynivalenol und Mycophenolsäure als Positivkontrollen, ausgehend von Hinweisen auf Wirkungen im Immunsystem Tulipalin A, Helenalin, Vincristin, Cannabidiol, Agaritin und p-Tolylhydrazin als Testsubstanzen.
Es zeigten sich nur geringfügige Unterschiede der Substanzwirkungen zwischen den Immunzelllinien, welche v.a. auf Zytokinebene nachweisbar waren. Die Substanzen besaßen zeit- und konzentrationsabhängige Effekte. Die Negativkontrolle Mannitol hatte eine geringe Wirkung auf die Immunzelllinien, während Urethan die Zytokinfreisetzung supprimierte/¬stimulierte. Die untersuchten Positivkontrollen zeigten einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung und führten weiterhin zu immuntoxischen Effekten durch eine konzentrationsabhängige Apoptoseinduktion. Die Testsubstanzen Vincristin, Agaritin und p-Tolylhydrazin besaßen nur eine geringe toxische Wirkung auf die Immunzellen. Weitere Substanzen wie Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A wiesen immunspezifisch und - unspezifisch vermittelte Immuntoxizität durch einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung, Apoptose und iROS auf.
Funktionale in vitro Untersuchungen zur Vitalität, Zellzyklusverteilung, Apoptose und Zytokinfreisetzung waren zum Nachweis bzw. Ausschluss von Immuntoxizität geeignet und neben Proteom- und Metabolomanalysen wesentlicher Bestandteil eines Entscheidungsbaums zur Klassifizierung von direkt immuntoxischen Substanzen. Es zeigte sich, dass die Zytokinmessung der wichtigste Parameter zur Klassifizierung von immuntoxischen Substanzen im subtoxischen Bereich ist. Es konnte sowohl Cyclosporin A als Positivkontrolle als auch Mannitol als Negativkontrolle in beiden Zelllinien bestätigt werden. Von den hinreichend untersuchten Testsubstanzen wurde Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A in Jurkat-Zellen sowie Cannabidiol und Tulipalin A in THP-1-Zellen unter Verwendung des Entscheidungsbaums als immuntoxisch klassifiziert.
Darüber hinaus konnte die hautsensibilisierende Wirkung von Farnesol und Tulipalin A durch Anwendung von weiteren in vitro Methoden bestätigt werden.
Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Vorscreening Testung neuer Substanzen ermöglichen und nicht nur zu einer Reduktion von Tierversuchen führen, sondern auch eine Zeit- und Kostenersparnis bedeuten.
Die Verlängerung des Magenaufenthalts von oralen Arzneiformen steht seit mehr als 30 Jahren im Fokus internationaler Forschungsgruppen. Trotz der Vermarktung diverser Systeme gelang es bislang nicht, eine sichere und reproduzierbare Gastroretention von Arzneiformen zu realisieren. Dies würde jedoch enorme Möglichkeiten für die Therapie mit oral applizierten Arzneimitteln mit sich bringen. Die Reduktion der Einnahmefrequenz, das Vermeiden von Plasmaspiegelspitzen sowie die gesteigerte Patientenadhärenz sind nur einige der denkbaren Vorteile. Die größte Hürde gastroretentiver Systeme ist dabei die Motilität des menschlichen Magens. Starke Kontraktionswellen sind für eine rasche Entleerung insbesondere unter Nüchternbedingungen verantwortlich. Daneben kommt es zu höchsten Belastungen auf Arzneiformen, was wiederum die Wirkstofffreisetzung beschleunigen kann, mit drastischen Folgen für den Patienten. In der präklinischen Testung neu entwickelter Systeme fehlt häufig der Bezug zur Physiologie des Magens und die Vorhersagekraft von Freisetzungstests ist dementsprechend gering. Ziel der Arbeit war daher die Charakterisierung der relevanten Parameter im Magen im Rahmen einer Humanstudie. Die aus dieser Humanstudie gewonnenen Daten zu pH-Werten, Temperaturen und insbesondere Drücken im Magen sollten anschließend genutzt werden, um die im Arbeitskreis verfügbaren, biorelevanten Freisetzungsmodelle weiterzuentwickeln. Abschließend sollten verschiedene, kommerziell erhältliche gastroretentive Arzneiformen unter Berücksichtigung der Magenphysiologie auf ihr Freisetzungsverhalten getestet werden. Die Ergebnisse der Humanstudie zeigten die enorme Abhängigkeit der Magenaufenthaltszeit einer telemetrischen Kapsel vom prandialen Status der Probanden. Nach Einnahme der Standardmahlzeit, wie sie in klinischen Studien zu Nahrungsmitteleffekten Verwendung findet, kam es zu Magentransitzeiten von über 20 h. Dagegen wurde die Kapsel unter Nüchternbedingungen spätestens nach 2,7 h aus dem Magen entleert. Die intragastralen Drücke nach postprandialer Einnahme der Kapsel betrugen mindestens 240 mbar und waren aufgrund des verlängerten Magenaufenthalts deutlich zahlreicher im Vergleich zur Nüchterneinnahme. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen zeigten, dass die herkömmlich verwendeten Freisetzungstestgeräte nicht in der Lage sind, biorelevante Belastungen auf eine telemetrische Kapsel auszuüben. Maximale Drücke von 14 mbar waren im eintauchenden Zylinder zu beobachten, welche wir jedoch auf den hydrostatischen Druck beim Eintauchen zurückführen konnten. Im Gegensatz dazu waren wir mit Hilfe unserer neuartigen In vitro-Freisetzungsmodelle in der Lage, vollständige Druckprofile nachzustellen, wie sie auch in vivo beobachtbar waren. Die Freisetzungsuntersuchungen der gastroretentiven Präparate Glumetza® 1000 und Madopar® Depot unter biorelevanten Bedingungen offenbarten die extreme Drucksensitivität dieser Systeme. Hierfür definierten wir auf Basis der In vivo-Daten drei realistische Druckprofile und stellten diese in vitro nach. Früh auftretende, leichte Belastungen während der Freisetzungstests führten bei der flotierenden Arzneiform Madopar® Depot bereits zur vollständigen Wirkstofffreisetzung. Glumetza® 1000 schien abhängig vom Quellungszustand auf die Belastungen zu reagieren, wobei spätestens stärkere Belastungen nach 6 h zur vollständigen Freisetzung des Wirkstoffs führten. Auf Basis dieser Ergebnisse ist anzuzweifeln, dass die bislang erhältlichen gastroretentiven Systeme über einen längeren Zeitraum im Magen intakt bleiben und kontrolliert ihren Wirkstoff freisetzen. Daneben können die entwickelten Testmethoden dazu genutzt werden, um die Entwicklung neuartiger gastroretentiver Systeme voranzutreiben.
In dieser Arbeit wurden systematisch mehrdimensionale chromatographische Systeme unter Verwendung von Alkyl-, Calixaren- und Resorcinarenphasen untersucht. Deren Analyse bildet einen grundlegenden Schritt on-line gekoppelte Trennungen in der HPLC schneller und effektiver planen und optimieren zu können. Neue Ergebnisse über den Einfluss der Säulenschaltsysteme auf die Retention der Analyten wurden dargestellt. Sowohl Erkenntnisse über die Retentionsmechanismen während der Schaltung als auch mathematische Modelle zur Beschreibung der Retention auf der sekundären stationären Phase wurden ermittelt. Um eine umfassende Betrachtung zu gewährleisten, wurden 43 Analyten verschiedener Struktur (unpolare, polare, ionische Analyten chemischer Leitstruktur sowie pharmazeutisch genutzte Stoffe) verwendet. Mit diesen Analyten erfolgten zunächst eindimensionale Analysen, um anschließend den exakten Einfluss der Säulenschaltungen zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden unter Berücksichtigung bestehender Retentionsmodelle interpretiert. Dabei zeigten sich Unterschiede zwischen konventionellen alkylgebundenen und neuartigen calixarengebundenen stationären Phasen. Erweiterungen und Präzisierungen der bestehenden Modelle wurden vorgeschlagen. Diese vertiefen das Verständnis der Retentionsmechanismen in der RPLC.
Die Bedingungen im Magen sowie der Prozess der Magenentleerung haben großen Einfluss auf das Anflutungsverhalten schnell freisetzender Arzneiformen. Die intra- und interindividuellen Schwankungen, für die hinsichtlich der Wirkstofffreisetzung bedeutenden Parameter, können daher maßgeblich zur Variabilität von Plasmakonzentrations-Zeit-Profilen beitragen. Über geeignete Formulierungen lassen sich solche Schwankungen minimieren. Voraussetzung dafür sind In vitro Modelle, die frühzeitig eine physiologisch relevante Charakterisierung von Formulierungskandidaten ermöglichen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein In vitro Freisetzungsmodell zu entwickeln, das für die Wirkstoffanflutung wesentliche physiologische Parameter des humanen Magens auf realistische Weise abbilden kann.
Im Rahmen erster Untersuchungen mit dem bereits etablierten Dynamic Open Flow Through Test Apparatus wurde geklärt, welchen Einfluss die Magenentleerungskinetik des Wassers auf das Anflutungsverhalten zweier N Acetylcystein Formulierungen (Granulat und Tablette) hat. In zuvor durchgeführten klinischen Studien war gezeigt worden, dass es aus pharmakokinetischer Sicht keine Unterschiede zwischen den Formulierungen gibt und beim Granulat selbst die Einnahme ohne Wasser keinen nennenswerten Einfluss auf die Pharmakokinetik hat. Die In vitro-Untersuchungen zeigten, dass diese Effekte vor allem auf die, unter den dynamischen Bedingungen der Magenentleerung, begrenzte Lösungsgeschwindigkeit des ansonsten gut wasserlöslichen Wirkstoffes zurückzuführen waren. Infolge der langsamen Freisetzung hatte die Entleerung des gleichzeitig eingenommenen Wassers nur geringen Einfluss auf die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Arzneistoffentleerung in das Duodenum. Vielmehr ist wahrscheinlich, dass der Migrating Motor Complex über die Entleerung ungelöster Partikel das Anflutungsverhalten dominiert.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde mit dem GastroDuo ein neues Modell entwickelt, in das Daten aus verschiedenen Humanstudien zur Charakterisierung der gastrointestinalen Parameter implementiert werden konnten. Über die Entwicklung verschiedener Testprogramme konnte die Simulation kritischer Parameter, sowohl des nüchternen als auch des postprandialen Magens, realisiert werden. Dadurch konnten in zwei Fallstudien, die bei postprandialer Applikation auftretenden pharmakokinetischen Besonderheiten verschiedener Fertigarzneimittel auf mechanistische Weise geklärt werden. So erklärten sich die resultierenden individuellen Plasmaspiegelverläufe der Fertigarzneimittel Viagra® und Adenuric® durch deren unterschiedliche Freisetzungs- und Entleerungscharakteristik. In den In vitro-Versuchen erwiesen sich diese Arzneiformen in ihrem Zerfalls- und Freisetzungsverhalten als unterschiedlich sensitiv gegenüber hydrodynamischen beziehungsweise mechanischen Einflüssen. So zeigten sich in den uns zur Verfügung gestellten pharmakokinetischen Daten für Viagra® vor allem Verläufe einer langsamen und kontinuierlichen Anflutung. Für Adenuric® wurde hingegen ein schnelles Anfluten beobachtet, was sich durch die schnelle Entleerung der fein dispergierten Arzneistoffpartikel über die Magenstraße in vitro erklären ließ.
Ähnliche Beobachtungen konnten für eine neu entwickelte Aspirin®-Formulierung gemacht werden. Diese zeigte aufgrund der angewandten Formulierungsstrategie ein, gegenüber der alten Formulierung, stark beschleunigtes Anfluten unter postprandialen Bedingungen. Wie die In vitro-Daten nahelegten, geschah dies aufgrund der zuverlässigen Entleerung über die Magenstraße. Bei der ursprünglichen Formulierung wurden hingegen deutlich niedrigere maximale Plasmakonzentrationen und ein wesentlich späteres Auftreten dieser maximalen Werte beobachtet. Diese Effekte ließen sich durch die langsame und unvollständige Entleerung aus den Magenzellen des GastroDuo bestätigen und erklären. In diesem Projekt konnte dementsprechend die Bedeutung der angewandten Formulierungsparameter und deren Wechselwirkung mit den physiologischen Begebenheiten aufgezeigt werden.
Abschließend wurde durch eine kombinierte In vitro /In vivo Studie die Eignung des GastroDuo für die prospektive Untersuchungen von Arzneiformen evaluiert. Dazu wurden vier verschiedene Darreichungsformen mit dem Modellarzneistoff Coffein mittels GastroDuo, sowie in einer Humanstudie untersucht. Durch den Nachweis von Coffein im Speichel der Probanden war eine Beurteilung des Zerfallsverhaltens in vivo möglich. Die Resultate der In vivo Studie wiesen gewisse Abweichungen von den erzielten In vitro Ergebnissen auf. Dabei wurde deutlich, dass eine Gewichtung der genutzten Testprogramme zwingend erforderlich ist, da die untersuchten Parameter in vivo mit verschiedenen Häufigkeiten und Auswirkungen auftreten.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass das GastroDuo als vielversprechendes Instrument für die Beurteilungen von schnell freisetzenden Darreichungsformen angesehen werden kann. Der modulare Aufbau ermöglicht die Testung definierter physiologischer Parameter unter kontrollierbaren Bedingungen. Allerdings erfordert dieser Aufbau jeweils einen Satz verschiedener Experimente. Nach unserer Auffassung ist dieser Ansatz jedoch unabdingbar um frühzeitig fundierte Aussagen über die Qualität von Arzneimitteln treffen zu können.
Die meisten der auf dem Markt befindlichen Arzneimittel sind so konzipiert, dass sie ihren Wirkstoff schnell und reproduzierbar im oberen Gastrointestinaltrakt abgeben, um die Absorption aus dem Dünndarm zu erlauben. Für das Zerfalls- und Freisetzungsverhalten dieser Arzneiformen spielt vor allem die gastrale Physiologie eine entscheidende Rolle. Das Zusammenspiel der Formulierung mit bestimmten Parametern des Magens, insbesondere der Magenentleerung, ist aber noch nicht völlig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb mit Hilfe von In vivo- und In vitro-Methoden untersucht, wie das Freisetzungsverhalten fester, oraler Arzneiformen nach nüchterner Applikation von der gastrointestinalen Physiologie beeinflusst wird.
Im ersten Teil der Arbeit beschäftigten wir uns mit den Ergebnissen einer Bioäquivalenzstudie, in der von einem Industriepartner zwei schnell freisetzende N-Acetylcystein-Formulierungen untersucht wurden. Dabei wurde der Originator, eine schnell freisetzende Tablette eingenommen mit Wasser, mit einem Granulat verglichen, welches einmal mit Wasser und einmal trocken eingenommen wurde. In beiden Studienarmen der Granulat-Formulierung konnte die Bioäquivalenz zum Originator gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Bioäquivalenzkriterien ebenso für die beiden Granulat- Studienarme erfüllt. Aufgrund der guten Permeabilität und der hohen Wasserlöslichkeit des N-Acetylcysteins war ein Einfluss der begleitenden Wassergabe auf die Pharmakokinetik erwartet worden. Die Ursachen für das Abweichen von dieser Erwartung wurden mittels In vitro-Freisetzungsmethoden weiter untersucht. Um die komplexen Bedingungen des Magens In vitro simulieren zu können, wurde das von Garbacz und Weitschies entwickelte biorelevante Freisetzungsmodell Dynamic Open Flow-Through Test Apparatus zur Untersuchung der beiden Formulierungen angewendet. Dabei konnte durch Simulation von biorelevanten Magenentleerungsprofilen gezeigt werden, dass die Wassergabe einen geringen Beitrag zum Transport des Arzneistoffes in den Dünndarm hat. Aufgrund dieser In vitro-Versuche konnten die Ergebnisse der Bioäquivalenzstudie umfassender erklärt werden.
Um die physiologischen Begebenheiten, welche für den Zerfall schnell freisetzender Arzneiformen kritisch sind, In vivo untersuchen zu können, wurde die Salivary Tracer Technique entwickelt. Diese Technik beruht auf der Einnahme einer geringen Dosis Koffein zusammen mit Wasser und anschließender Koffeinkonzentrationsmessung im Speichel. In einer MRT-Humanstudie konnten wir zeigen, dass die Entleerungskinetiken des eingenommenen Wassers aus dem Magen eng mit den Koffeinprofilen im Speichel korrelieren. Je nach Kinetik der Magenentleerung, erreichte gelöstes Koffein den Dünndarm und wurde dort schnell resorbiert und über das Blut in die Speicheldrüsen transportiert. Damit war die Magenentleerung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für das Anfluten von Koffein im Speichel. Somit war es möglich, indirekt, einfach und wenig kostenintensiv, die Magenentleerung einer akalorischen Flüssigkeit zu bestimmen, ohne auf die MRT mit entsprechend geschultem Personal zurückgreifen zu müssen.
In einem nächsten Schritt wurde die Salivary Tracer Technique genutzt, um die In vivo-Zerfallszeiten von Hartgelatinekapseln zu bestimmen. Als Referenz- und Goldstandardmethode diente wiederum die MRT, da es durch die Zugabe von Eisenoxid im MRT möglich war, die Hartgelatinekapseln sichtbar zu machen und deren Integrität zu beurteilen. Um parallel den Zerfall mit der Salivary Tracer Technique zu bestimmen, wurden die Kapseln zusätzlich mit 50 mg Koffein befüllt. In einer Humanstudie wurden die mit den beiden Markersubstanzen beladenen Kapseln auf nüchternen Magen appliziert. Direkt im Anschluss wurden die Probanden im MRT platziert und Messungen in kurzen Zeitintervallen durchgeführt. Nach jeder Messung mussten die Probanden selbständig eine Speichelprobe von geringem Volumen abgeben. Sobald eine Koffeinkonzentration, die größer als die dreifache Bestimmungsgrenze der analytischen Methode war, in einer Speichelprobe nachgewiesen werden konnte, wurde dieser Zeitpunkt als Zerfallszeitpunkt bestimmt. Der statistische Vergleich der Zerfallszeitpunkte der beiden Methoden zeigte eine robuste Korrelation der Werte. Ein geringer Versatz der Zerfallszeitpunkte bei der Salivary Tracer Technique ließ sich dadurch erklären, dass mittels MRT der Zerfall direkt im Magen bestimmt wurde, während für den Koffeinnachweis im Speichel noch das Verteilen, das Lösen und/oder die Entleerung des Koffeins aus dem Magen mit anschließender Resorption im Dünndarm erfolgen muss. Trotz des Versatzes der beiden Methoden von circa 4 min konnte die Studie belegen, dass die Salivary Tracer Technique geeignet ist, mit einer robusten Korrelation zu etablierten Methoden und mit moderatem Studienaufwand den Zerfall schnell freisetzender Arzneiformen zu bestimmen. Besonders der relative Vergleich mehrerer verschiedener Formulierungen in einem Cross-over-Design erscheint mit der Salivary Tracer Technique sinnvoll, da hierbei der Einfluss der Magenentleerung auf die Zerfallszeiten der verschiedenen Formulierungen gleichbleibend sein sollte.
Da eine In vivo-Testung von (Entwicklungs-)Formulierungen, trotz der vereinfachten Methodik, nicht immer möglich und angemessen ist, wurde das Fed Stomach Model als In vitro-Freisetzungsmodell im Rahmen dieser Arbeit weiterentwickelt. Die wesentlichen Modifizierungen des GastroDuos gegenüber dem Fed Stomach Model sind die dünnwandige, transparente Magenzelle, welche geringe Volumina von bis zu 25 mL simulieren kann sowie biorelevante Temperaturprofile des eingebrachten Mediums. Weiterhin wurde die Möglichkeit geschaffen, diese Medien anzusäuern und so verschiedene pH-Profile zu simulieren. Eine weitere Neuheit des GastroDuo ist die Fähigkeit der kontinuierlichen Konzentrationsmessung direkt am Ausgang über ein UV- Lichtleitersystem. Das System eignet sich somit dazu, Druck, Bewegung, pH-Wert, Temperatur und Hydrodynamik in physiologisch relevanter Weise zu simulieren. Diese Parameter werden in sechs Testprogrammen, welche sowohl die mittleren Bedingungen im Magen simulieren als auch die physiologischen Extrema berücksichtigen, in unterschiedlicher Weise abgebildet.
In einer ersten Studie wurde das GastroDuo genutzt, um das Freisetzungsverhalten von vier schnell freisetzenden Arzneiformen genauer zu untersuchen. Weiterhin wurden vergleichende Freisetzungsdaten mittels kompendialer Methoden erhoben. In diesem Screening wurde der Zerfall und die Freisetzung von Koffein aus einer Hartgelatinekapsel, zwei verschiedenen HPMC-Kapseln sowie einer Filmtablette verglichen. Die Auswertung der Freisetzungsuntersuchungen zeigte, dass manche Formulierungen empfindlich gegenüber bestimmten Parametern waren, während eine andere Formulierung dies für diesen Parameter nicht war. Im erstellten Datensatz ergab sich so ein sehr heterogenes Bild der Freisetzungsdaten, das abhängig vom Testprogramm und der jeweiligen Formulierung war.
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die in vitro generierten Daten prädiktiv für das Verhalten der Arzneiformen im Menschen waren. Dafür wurden dieselben vier Formulierungen in einer „4-Wege cross-over“- Humanstudie, mit Hilfe der Salivary Tracer Technique, auf ihr In vivo-Verhalten untersucht. Es ließ sich feststellen, dass das GastroDuo in der Lage war zwischen den Arzneiformen zu unterscheiden, die auch in vivo Unterschiede aufweisen. Dies war mit kompendialen Methoden nicht immer möglich. Der signifikante Vorteil des GastroDuo gegenüber anderen Systemen ist die Möglichkeit, physiologische Extrema getrennt voneinander darzustellen und ihren Einfluss zu quantifizieren. Daher bietet das GastroDuo ein wertvolles Werkzeug, um den Zerfall und die Freisetzung von schnell freisetzenden Arzneiformen besser zu verstehen.
Abschließend lässt sich sagen, dass es uns in der vorliegenden Arbeit gelungen ist, wichtige Hilfsmittel für das Verständnis des Zerfalls- und Freisetzungsverhalten von schnell freisetzender Arzneiformen im nüchternen Magen weiterzuentwickeln. Es ist uns gelungen, bestehende In vitro-Modelle technisch zu verbessern, eine neue In vivo-Methode zu entwickeln und zu valideren, welche eine sinnvolle Ergänzung zu bereits bestehenden In vivo- Methoden darstellt.
Die Pflanze Pittosporum angustifolium („GymbiGymbi“) wird von der indigenen Bevölkerung Australiens für verschiedene medizinische Indikationen verwendet. Anwendungsbeobachtungen und erste zellbiologische Untersuchungen geben Hinweise auf den potentiellen Nutzen dieser Pflanze für die Therapie maligner Neoplasien. Ziele dieser Arbeit: Erkenntnisse zu den zellbiologischen Interaktionen zwischen Pittosporum angustifolium und der Tumorzelllinie (U-5637). Material: vier alkoholische, ein wässriger und ein mit Amylase behandelter Extrakt, außerdem sieben isolierte Reinsubstanzen. Methoden: Neutralrottest, Durchflusszytometrie. Wichtige Ergebnisse: Neutralrottest: IC50-Werte zwischen 10 µg/ml (Hydrolysat des Aq.EtOH-Extraktes ) und 66 µg/ml (Amylase-Extrakt). Substanz 4 mit IC50 : 4 µg/ml, Substanz 6 mit IC501 µg/ml. Durchflusszytometrie: Keine Zellphasenarretierung durch die Extrakte. Als Wirkmechanismus zeigten sich sowohl Apoptose- als auch Nekroseinduktion sowohl durch die Extrakte als auch durch Substanz 4 [12 µg/ml] und Substanz 6 [1 µg/ml].
Epigenetische Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Gleichgewichtes zwischen dem Vorliegen von Eu- und Heterochromatin. Neben Acetylierungsprozessen kommt dabei vor allem Methylierungen von Histonen eine entscheidende Bedeutung zu. Die im Fokus der vorliegenden Dissertation stehenden Demethylierungen können dabei zum einen durch sogenannte Lysin-spezifische und zum anderen durch JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen katalysiert werden. Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um Fe(II)- sowie 2-Oxoglutarat-abhängige Enzyme, welche unter anderem die Oxidoreduktase KDM4A umfassen. In gesundem Gewebe übernimmt diese wichtige Aufgaben im Rahmen der Regulierung des Zellzyklus und der -differenzierung, während daneben jedoch eine Überexpression in diversen Tumorzellarten, wie z. B. Prostata-, Brust- oder Lungenkrebs detektiert wurde.
Aus diesem Grund bestand das Ziel jener Arbeit in der Auffindung eines potentiellen KDM4A-Inhibitors in Anlehnung an literaturbekannte Hemmstoffe wie Daminozid oder N-Oxalylglycin, welcher im Folgenden als Leitstruktur für die Erstellung einer Substanzbibliothek dienen sollte. Diese Aufgabe konnte durch die Synthese von drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden erfüllt werden, welche zu einer Inhibition von KDM4A mit IC50-Werten im zweistelligen mikromolaren Bereich in der Lage waren. Die kürzeste dieser drei Verbindungen, 2-(1H-Tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid, wurde aufgrund des kleinsten IC50-Wertes als Leitstruktur für folgende Derivatisierungen ausgewählt. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass es sich bei dieser fragmentartigen Verbindung um einen kompetitiven Inhibitor handelt, welcher zudem eine gewisse Subtypselektivität für KDM4A aufweist. Durch die Synthese und Charakterisierung des am Tetrazolring methylierten Derivates sowie des korrespondierenden Esters wurde die Notwendigkeit des Vorhandenseins eines Komplexbildners in definiertem Abstand zu einer sauren Funktion für eine Hemmwirkung gegenüber KDM4A belegt.
Aufgrund der in der Literatur beschriebenen komplexbildenden Eigenschaften von Acylhydrazonen wurde ausgehend von den drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden durch Umsetzung mit verschiedenen Aldehyden und Ketonen eine Substanzbibliothek bestehend aus 46 Verbindungen synthetisiert. Neben der Hydrazonbildung konnte die Leitstruktur durch das Einfügen von α-C-C- und α-C-N-verknüpften Seitenketten derivatisiert werden. Dadurch wurden insgesamt 14 Endverbindungen synthetisiert, wobei die beiden potentesten Substanzen, bei denen es sich um amidhaltige Strukturen handelt, IC50-Werte im Bereich der Leitstruktur aufweisen. Des Weiteren war eine Abwandlung der Leitstruktur infolge des Ersatzes der Methylengruppe durch einen Benzenring möglich.
Die biologische Testung der Substanzen erfolgte mithilfe von zwei verschiedenen Assays: Zum einen dem enzymgekoppelten Formaldehyd-Dehydrogenase- und zum anderen dem Antikörper-basierten LANCE-Assay. Des Weiteren wurden im Helmholtz-Zentrum Berlin zehn ausgewählte Verbindungen zusammen mit der zu KDM4A weitestgehend homologen KDM4D kristallisiert und röntgenkristallographisch vermessen. Durch Aufklärung der Bindungsmodi konnte die Grundlage für ein rationales Ligandendesign hinsichtlich der gezielten Synthese weiterer potentieller KDM4x-Inhibitoren gelegt werden.
Eine Auswahl von 88 Substanzen der synthetisierten Verbindungen wurde in der Screening Unit des FMP (Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie) in Berlin, welches Teil des EU-Openscreen-Netzwerkes ist, eingelagert und steht damit für Testungen gegen weitere Targets zur Verfügung. Da die betreffenden Substanzen in Arzneistoffen unterrepräsentierte Strukturen, wie z. B. Hydrazide und aliphatisch gebundene Tetrazole beinhalten, könnten dadurch interessante neue Leitstrukturen für andere Forschungsprojekte identifiziert werden.
Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Dissertation wurde in zwei Publikationen veröffentlicht.
In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von atmosphärendruckplasmaaktivierten Natriumchloridlösungen (NaCl-Lösungen), unter Anwendung von nass-chemischen und mikrobiologischen Analysenverfahren, untersucht. Es zeigte sich, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen sowohl mit kurzzeitigen als auch mit langzeitigen antimikrobiellen Effekten generiert werden können. Diese Effekte korrelieren mit einer Änderung der chemischen Zusammensetzung der flüssigen Phase. Molekularbiologische Untersuchungen zeigten, dass die antimikrobiellen Effekte auf unterschiedlichen Wirkmechanismen, vor allem auf oxidativem und nitrosativem Stress, beruhen. Anwendungsorientierte Untersuchungen haben gezeigt, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen über ein enges Wirkspektrum (grampositive und gramnegative Erreger) verfügen, sich keine schnellen Resistenzen gegen den Testorganismus ausbilden und eine Kombination mit handelsüblichen Antibiotika ein vielversprechender Ansatz für eine Wirkungssteigerung der verwendeten Antibiotika ist.
Erkrankungen der Speiseröhre waren in der Vergangenheit ein wenig beachteter Themenkomplex in der Forschung und Entwicklung neuartiger Therapieoptionen. Die Behandlung von Erkrankungen wurde in der Regel systemisch oder chirurgisch durchgeführt. Trotz eines geringeren Risikos für unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Vergleich zur systemischen Therapie wurde der Ösophagus bisher kaum als Target zur Medikamentenapplikation in Betracht gezogen. Durch die besonders kurze Transitzeit stellt die Speiseröhre einen sehr anspruchsvollen Applikationsort für die Entwicklung lokal wirksamer Darreichungsformen dar. Zur effektiven Therapie von Tumorerkrankungen, Pilzinfektionen, Motilitätsstörungen oder durch Reflux verursachte Schädigungen im Bereich der Speiseröhre wäre beispielsweise eine lokale Arzneimitteltherapie mit niedrig dosierten Wirkstoffen in mukoadhäsiven Darreichungsformen wünschenswert.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges System zur gezielten lokalen und langanhaltenden Applikation von mukoadhäsiven Filmen in der Speiseröhre entwickelt und charakterisiert. Das dabei entstandene EsoCap-System besteht aus einem aufgerollten Film, der an einem Faden befestigt und in einer geschlitzten Kapsel positioniert ist. Bei der Einnahme der EsoCap mit einem eigens entwickelten Applikationssystem wird der Mechanismus zum Entrollen des Filmes ausgelöst. Durch den Schluckvorgang wird der Film in der Speiseröhre entrollt und haftet aufgrund der mukoadhäsiven Eigenschaften an der Mukosa des Patienten.
Die Funktionalität des Systems konnte in einer Studie mit zwölf gesunden Probanden gezeigt werden. Bei insgesamt 72 durchgeführten Applikationen konnte in 71 Fällen eine erfolgreiche Platzierung des mukoadhäsiven Filmes in der Speiseröhre nachgewiesen werden. Die korrekte Platzierung des Filmes wurde anhand eines neu entwickelten und kontrastierenden Filmes mittels MRT nachgewiesen. Zur standardisierten Evaluation der Akzeptanz wurde ein spezifisch auf die Eigenschaften und Besonderheiten des EsoCap-Systems angepasster Fragebogen entwickelt. Auch die prinzipielle Funktionalität des Systems konnten durch die Studie mit gesunden Probanden, nachgewiesen werden. Das modifizierte EsoCap-System, welches zusätzlich mit einem Sinker zur Erhöhung der Dichte versehen wurde, zeigte in der Befragung eine subjektiv bessere Schluckbarkeit. Zudem konnte ein bereits in der Literatur beschriebener Lern- und Trainingseffekt bei der Einnahme von oralen Darreichungsformen auch beim EsoCap-System beobachtet werden.
Neben der vorteilhaften Erhöhung der Dichte des Systems könnte die Verwendung kleinerer Kapseln (z. B. Größe 0) und die Verwendung eines schnell wasserlöslichen Retainers zum Auslösen des Systems mit einer Steigerung der Akzeptanz korreliert sein. Die Verwendung von kleineren Kapseln sollte durch die Verwendung von, im Vergleich zur MRT-Kontrastierung, dünneren, für die lokale Wirkstoffapplikation genügenden Filme möglich sein. Die Akzeptanz und die Überlegenheit des neuartigen Systems im Patienten sind in klinischen Studien zu beweisen. Zudem ist ein Verfahren zur automatisierten Herstellung des sehr komplexen und bisher vollständig manuell gefertigten Systems zu etablieren.
Neben der Filmdicke haben sowohl die verwendeten Polymere als auch die Wirkstoffbeladung einen Einfluss auf die Charakteristik der verwendeten Filme. Eine Möglichkeit die Funktionalität von Filmen In vivo besser vorherzusagen, besteht in der Verwendung biorelevanter In vitro-Testsysteme. Aus diesem Grunde wurde der EsoPeriDiss, ein neuartiges und biorelevantes In vitro-Testsystem zur Charakterisierung ösophageal applizierter Darreichungsformen entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass mittels des EsoPeriDiss erste Erkenntnisse hinsichtlich des Freisetzungsverhaltens und der Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre bei simulierter Speichelflussrate, simulierter Peristaltik sowie bei verschiedenen simulierten Ausrichtungen des Patienten gewonnen werden können.
Durch Variation der Pumpleistung war die Speichelflussrate flexibel steuerbar und ermöglichte, wie auch das modulare Walzensystem, die Simulation verschiedener Einnahmebedingungen. So können Konfigurationen mit niedriger Intensität zur Simulation der nächtlichen Einnahme, aber auch hochintensive Konfigurationen zur Simulation der Einnahme mit Nahrung am Tage zusammengestellt werden. Durch die Ergänzung einer Positionsanpassung war es möglich, sowohl eine waagerechte als auch senkrechte Speiseröhre zu simulieren. Die Simulation von ausgewählten physiologischen Parametern und die In vitro-Charakterisierung verschiedener Darreichungsformen ermöglichten ein besseres Verständnis über die Verhältnisse und Beschaffenheiten von esophageal applizierten Darreichungsformen. Die Zusammenstellung von physiologischen Konfigurationen oder die Übertragung von In vivo-Daten von Patienten auf das System, ergeben für die neuartige modulare Testplattform eine Vielzahl interessanter Möglichkeiten zur Charakterisierung von ösophageal applizierbaren Darreichungsformen. Somit konnte gezeigt werden, dass das modular aufgebaute neue System zahlreiche Möglichkeiten für biorelevante Freisetzungsuntersuchungen bietet.
Das EsoCap-System stellt eine neuartige, innovative und hochvariable Plattformtechnologie dar, die die Applikation von mukoadhäsiven Polymerfilmen in der Speiseröhre ermöglicht. Durch Anpassung der Plattform, beispielsweise durch Verwendung verschiedener wirkstoffbeladener Filme könnte das System neue Möglichkeiten in der Therapie von bisher nur unzureichend therapierbaren Krankheiten der Speiseröhre eröffnen. Die Erkenntnisse aus der In vivo-Studie und den In vitro-Untersuchungen geben Anlass zur Hoffnung hinsichtlich einer In vivo verlängerten lokalen Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre, die besondere Bedeutung für die Effektivität einer Therapie hat. Das EsoCap-System hat aus vielerlei Hinsicht das Potenzial eine Durchbruchsinnovation im Bereich der Therapie von Erkrankungen der Speiseröhre darzustellen. Durch diese innovative Applikationsmöglichkeit begünstigt, könnte insbesondere das Screening nach hochaktiven und spezifisch in der Speiseröhre wirkenden Wirkstoffen zusätzlich vorangetrieben werden.
Revaskularisierende Maßnahmen wie die perkutane transluminale Angioplastie sowie die Stentimplantation zählen heutzutage zu den Standardtherapieverfahren der koronaren Herzkrankheit. Insbesondere die Einführung der mit proliferationshemmenden Wirkstoffen wie Paclitaxel oder Sirolimus beschichteten drug-eluting stents (DES) konnte die Restenoserate der behandelten Gefäße auf unter 10 % senken. Der Erfolg der kardiovaskulären Intervention ist dabei insbesondere auch von der Freisetzungskinetik der Wirkstoffe aus der Polymerbeschichtung der Stents abhängig. Methoden zur Untersuchung des In vitro-Freisetzungsverhaltens sind jedoch weder im Europäischen noch im US-Amerikanischen Arzneibuch monographiert, meist werden aber offizinelle Methoden wie der Eintauchende Halter oder die Durchflusszelle sowie nicht offizinelle, einfache Shake-Flask-Methoden zur Bestimmung der In vitro-Freisetzung verwendet. Dabei bleiben allerdings Besonderheiten von DES wie die Einbettungsbedingungen in das Gewebe der Gefäßwand oder die Flussbedingungen unberücksichtigt. Mit der Einführung der Gefäßsimulierenden Durchflusszelle (vFTC) mit einem Gewebemodell in Form eines Hydrogels als zweitem Akzeptorkompartiment konnten dagegen Parameter wie der Blutfluss, die Verteilung des Wirkstoffes in die Gefäßwand sowie reine Diffusionsprozesse auf der abluminalen Seite der Stents in vitro simuliert werden. Durch Modifikation des Hydrogels mittels hydrophober Zusätze konnte auch bereits ein Einfluss auf die Freisetzung von Modellarzneistoffen aus schnellfreisetzenden Stents gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, auch für die tatsächlich in DES eingesetzten Arzneistoffe Sirolimus und Paclitaxel Gewebemodelle auf Basis von Hydrogelen zu entwickeln und den Einfluss dieser Gewebemodelle auf die In vitro-Wirkstofffreisetzung in der vFTC zu untersuchen.
Dazu wurden zunächst analytische Methoden zur Quantifizierung der beiden Wirkstoffe entwickelt und validiert. Zur Identifizierung eines geeigneten Freisetzungsmediums wurde anschließend die Stabilität der Wirkstoffe in verschiedenen pufferbasierten und ungepufferten Medien sowie unter Zusatz von stabilisierenden Additiva untersucht. Eine mit Butylhydroxytoluol und Brij® L23 stabilisierte 0,9 %-ige Kochsalzlösung wurde dabei als geeignet identifiziert, die Stabilität der beiden Wirkstoffe über einen Freisetzungszeitraum von fünf Tagen zu gewährleisten.
Auf Basis vorhergehender Arbeiten wurde für die Entwicklung der Gewebemodelle auf ein 2 %-iges Agarosegel als Grundlage zurückgegriffen. Um die Verteilung der Wirkstoffe in das Gewebemodell zu erhöhen, wurden verschiedene Zusätze wie Lecithin, LiChroprep® RP-18, Lipofundin® MCT/LCT 20 %, mittelkettige Triglyceride und Cholesterol zur Hydrophobisierung beigemischt. Außerdem wurden Elastin und bovines Serumalbumin als Zusätze gewählt, um spezifische Bindungen der Wirkstoffe im Gewebe zu simulieren. Zur Untersuchung der Eignung der entwickelten Hydrogele als Gewebemodell wurde der Verteilungskoeffizient zwischen Hydrogel und Wirkstofflösung ermittelt und mit ex vivo ermittelten Literaturwerten zwischen humanem Aortengewebe und einer Wirkstofflösung verglichen. Zusätze von 10 % Lipofundin®, 0,1 % LiChroprep® + 0,02 % Lecithin sowie 0,1 % Lecithin wurden als geeignet befunden, um die Verteilung von Sirolimus in das Gewebe humaner Aorta mit unterschiedlichem Status zu simulieren und wiesen zudem eine ausreichende Stabilität für Freisetzungsuntersuchungen in der vFTC über einen Zeitraum von fünf Tagen auf.
Die Untersuchung des Einflusses dieser drei Gewebemodelle als Hydrogelkompartiment auf die Wirkstofffreisetzung aus DES in der vFTC wurde mit Sirolimus-beschichteten Stents mit Poly-L-Milchsäure als Beschichtungspolymer über 120 h durchgeführt. Zum Vergleich wurde zusätzlich die Wirkstofffreisetzung in einer einfachen Shake-Flask-Methode sowie in der Durchflusszelle ohne Hydrogelkompartiment beziehungsweise mit einem Agarosegel ohne Zusätze bestimmt. Es konnte ein triphasisches Freisetzungsverhalten mit biphasischem, jeweils nach einer Kinetik 1. Ordnung ablaufenden burst release von 30 - 40 % des Wirkstoffes innerhalb der ersten 12 h sowie nachfolgender langsamer Diffusionsphase beobachtet werden. Ein Vergleich der unterschiedlichen Freisetzungs-methoden zeigte eine langsamere Freisetzung unter Verwendung der Durchflusszelle sowie eine weitere Verringerung des in das Medium freigesetzten Wirkstoffanteils durch die Einführung eines zweiten Akzeptorkompartiments in der vFTC. Statistisch signifikante Unterschiede wurden aber vorrangig in der Verteilung des Wirkstoffes zwischen den Kompartimenten gesehen. So führte die Verwendung von 10 % Lipofundin als Zusatz zu einer Erhöhung des Anteils an Sirolimus im Gewebemodell von etwa 1 % auf fast 14 % der Gesamtfreisetzung nach fünf Tagen (p < 0,05). Im Gegensatz zu vorherigen Untersuchungen mit Modellarzneistoffen ist es für den tatsächlich in DES eingesetzten Wirkstoff Sirolimus also gelungen, ein Gewebemodell mit ausreichend hohem Verteilungskoeffizienten zu entwickeln, mit dem signifikante Unterschiede in der Verteilung zwischen den verschiedenen Kompartimenten der vFTC ermittelt werden konnten. In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus DES mittels der vFTC können somit durch die Verwendung von Gewebemodellen mit einem den In vivo-Bedingungen angepassten Verteilungskoeffizienten für die betreffenden Wirkstoffe eine noch bessere Abschätzung der In vivo-Verteilung eines aus DES freigesetzten Wirkstoffes in die Arterienwand leisten. Auch für biorelevante In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus anderen Implantaten können die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle möglicherweise einen wertvollen Beitrag leisten.
In der Arzneimitteltherapie nehmen parenteral zu applizierende Arzneimittel einen immer größer werdenden Stellenwert ein. Diese Entwicklung beruht vor allem auf der steigenden Anzahl von Peptiden und Proteinen als Wirkstoffe, deren perorale Applikation aufgrund unzureichender Resorptionsraten aus dem Gastrointestinaltrakt unmöglich ist, aber auch auf der Möglichkeit Depotformulierungen anzuwenden, die Wirkstoffe nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion über einen langen Zeitraum freisetzen können. Dennoch sind Arzneimitteltransportwege nach subkutaner oder intramuskulärer Applikation im Detail weitestgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die intramuskuläre Applikation gelegt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine tierexperimentelle Studie an Ratten durchgeführt, die es zum Ziel hatte, ausgewählte physiologische Einflussparameter auf die Wirkstoffresorption nach intramuskulärer Injektion zu untersuchen. Die Tiere erhielten sowohl wässrige Lösungen als auch ölige Suspensionen von Paracetamol, Prednisolon und Diclofenac-Natrium in die rechte Oberschenkelmuskulatur und das jeweilige Placebo in den Muskel des linken Oberschenkels. Anschließend wurde das intramuskuläre Arzneistoffdepot erstmals mittels Magnetresonanztomographie (MRT) als bildgebendes Verfahren zeitabhängig untersucht und parallel die Anflutungskinetik der Wirkstoffe ins Blut bestimmt. Die Volumina und Oberflächen der Depots sowie die Zeit bis zu deren Abtransport aus dem Muskelgewebe wurden mit den Blutspiegelkurven verglichen. Allen Formulierungen war gemein, dass der Wirkstoff deutlich schneller resorbiert wurde als das Depot. Daraus lässt sich schließen, dass die Wirkstoffaufnahme nicht über die Resorption des Depots erfolgte. Ein schnelleres Verschwinden der Depots führte nicht zu höheren Blutspiegelmaxima oder zu einer beschleunigten systemischen Wirkstoffresorption. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Volumen und der Oberfläche der Depots und den Blutspiegelkurven gefunden. Ein weiterer Aspekt, der während der durchgeführten Studie näher untersucht wurde, ist die Möglichkeit, mit Hilfe der MRT lokale Reaktionen in Folge der Injektion zu detektieren. Bei Diclofenac-Natrium wurde in allen Fällen eine Ansammlung interstitieller Flüssigkeit am Ort der Injektion beobachtet. Histopathologische Untersuchungen des Muskelgewebes konnten einen Zusammenhang zwischen der Größe des visualisierten Ödems und dem Ausmaß der Entzündung belegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit galt es, mit den gewonnenen In vivo-Daten möglichst biorelevante Methoden für Freisetzungstests intramuskulärer Arzneiformen zu entwickeln. Dabei sollte sowohl die Simulation der Durchblutung des Muskelgewebes Berücksichtigung finden als auch die Simulation des Muskelgewebes oder der Depots im Muskelgewebe. Es wurden verschiedene Versuchsaufbauten entwickelt, adaptiert und modifiziert. Darunter zählen Gel-Schaum-Blöcke in der Durchflusszelle, die Keramikmembran und der Membranadapter in der Durchflusszelle. Während die Simulation der Durchblutung und der injizierten Depots in allen Testmethoden möglich war, konnte das Muskelgewebe nicht befriedigend nachgebildet werden. Die Anwendung verschiedener Freisetzungstest-Methoden hatte auf die Verteilung der Wirkstoffe aus den wässrigen Lösungen keinen nennenswerten Einfluss. Der größte Einfluss auf die Verteilungsgeschwindigkeit wurde bei der öligen Suspension von Prednisolon beobachtet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nicht abschließend geklärt werden, welche Parameter der Situation in vivo entscheidend für das Anflutungsverhalten der Wirkstoffe nach intramuskulärer Injektion sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Kombination aus pharmakokinetischen Untersuchungen mit MRT-Bildgebung eine vielversprechende Möglichkeit darstellt, Einblicke in die Biopharmazie intramuskulärer Depots zu erhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der MRT zur Feststellung der lokalen Verträglichkeit, vor allem neu entwickelter Arzneiformen, eine sehr gut geeignete nicht-invasive Methode darstellt. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen verdeutlichen, dass die Freisetzungstestmethode vor allem bei langsam freisetzenden Arzneiformen einen erheblichen Einfluss ausüben kann. Eine universelle Testmethode, mit der zuverlässig das In vivo-Freisetzungsverhalten nach intramuskulärer Injektion vorhergesagt werden kann, ist derzeit nicht verfügbar. Die entwickelten Modelle stellen einen ersten Schritt zur Entwicklung biorelevanter Freisetzungstestmethoden für intramuskulär applizierte Darreichungsformen dar. Zur Verbesserung dieser Modelle sind ein umfassenderes Verständnis der Arzneimittelverteilungs- und -Transportmechanismen notwendig und weitere Studien, die bildgebende Verfahren mit der pharmakokinetischen Analyse kombinieren, wünschenswert.
Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle an strukturell diversen und biologisch hochaktiven Naturstoffen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Bislang konnte die Strukturklasse der [7.7]Paracyclophane nur in fädigen Cyanobakterien der Gattungen Nostoc und Cylindrospermum nachgewiesen werden. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass gerade die Carbamidocyclophane chemisch und biologisch interessante Verbindungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vor allem die Carbamidocyclophane produzierenden Cyanobakterien Nostoc sp. CAVN2 und Nostoc sp. CAVN10 unter besonderer Berücksichtigung der strukturellen Vielfalt an biosynthetisierten Metaboliten sowie deren antimikrobieller Aktivität umfassend charakterisiert. Um das biosynthetische Potenzial auf der metabolischen Ebene zu untersuchen, wurde im Vorfeld eine spezifische [7.7]Paracyclophan-Analytik etabliert, die skalierbare Methoden für alle Aufarbeitungsschritte beinhaltet. Die Optimierung endete in einem validierten sowie arbeits- und zeitsparenden einstufigen Extraktions- und Aufreinigungsverfahren mittels eines Zweiphasensystems und anschließender LC-UV-Analyse, um biologische Proben reproduzierbar zu analysieren und enthaltene Carbamidocyclophane zu quantifizieren. Kultivierungsstudien zum Einfluss der Temperatur an metabolisch aktiven und defizienten Nostoc-sp.-CAVN10-Kulturen ergaben einen direkten Zusammenhang zwischen der Biomassezunahme und der Temperaturerhöhung. Im Gegensatz dazu zeigten die einzelnen Carbamidocyclophan-Gehalte ein eher differenzierteres Bild über die verschiedenen Wachstumsphasen und Temperaturen hinweg. Da nur eine geringe Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Carbamidocyclophan-Produktionsrate ermittelt werden konnte, ist eine Relevanz dieser Verbindungen für den primären Zellstoffwechsel nicht ersichtlich. Bei Kultivierungsexperimenten an Nostoc sp. CAVN2 hatte der Zusatz von Chlorid- oder Bromid-Ionen eine drastische Erhöhung der Basalrate und Strukturdiversität der [7.7]Paracyclophane zur Folge. Das gleichzeitige Vorhandensein beider Halogenide im Medium zeigte kompetitive Effekte, wobei Chlorid als Substrat für den Halogenierungsprozess favorisiert wurde. Mit Hilfe eigens entwickelter Kultivierungsprozedere und Separierungsstrategien konnten insgesamt 25 Verbindungen aus Stamm CAVN2 isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei bilden die Carbamidocyclophane H–U neue chlorierte, bromierte und nicht halogenierte Naturstoffe. Zusätzlich konnten aus Stamm Cylindrospermum stagnale PCC 7417 neben den bekannten Cylindrocyclophanen A, B und D die drei neuen Cylindrofridine A–C erhalten werden. Diese stellen den Cylindrocyclophanen strukturell eng verwandte lineare Mono- und Dialkylresorcinole dar. Die vergleichende Evaluierung der Bioaktivität von 30 Reinsubstanzen ergab, dass viele Verbindungen sehr starke antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen – besonders gegen Antibiotika-resistente Kokken mit minimalen Hemmkonzentrationen von oftmals deutlich unter 1 µM. Dabei bedingten die verschiedenen Substituenten (Carbamoyl- und Acetoxy-Reste sowie Hydroxygruppen oder Halogene) z.T. signifikante Aktivitätsunterschiede. Die Zytotoxizität der [7.7]Paracyclophane ist vor allem an das Vorhandensein des Makrozyklus gebunden, da lineare Derivate (Cylindrofridine B/C) kaum biologisch aktiv waren. Eine Ausnahme stellt dabei das nicht zytotoxische, aber antimikrobiell aktive Cylindrocyclophan-D-Monomer Cylindrofridin A dar. Die phylogenetische Analyse der 16S-rDNA-Daten bestätigte die morphologisch-taxonomische Identifizierung der Stämme CAVN2 und CAVN10 als Cyanobakterien der Gattung Nostoc und ergab weiterhin, dass alle Carbamido- und Cylindrocyclophane produzierenden Nostoc-Stämme Bestandteil einer monophyletischen Gruppe sind, die phylogenetisch distinkt zu anderen [7.7]Paracyclophan-Produzenten ist. Des Weiteren konnten keine Nukleotidunterschiede zwischen Stamm CAVN2 und CAVN10 auf den untersuchten Markergen-Sequenzen festgestellt werden, was beide auf der phylogenetischen Ebene als identisch erscheinen lässt und sie somit nur metabolisch aufgrund der strukturellen Diversität und Quantität an [7.7]Paracyclophanen differenzierbar sind. Mit Hilfe von molekulargenetischen Analyseverfahren und bioinformatorischer Auswertung konnte in Stamm CAVN2 das Carbamidocyclophan-Biosynthesegencluster mit einer Gesamtgröße von ca. 26,9 kbp identifiziert werden. Dieses beinhaltet 13 offene Leserahmen (cabA-cabM), wobei das Gen cabL für eine putative Carbamoyltransferase codiert. Ein neuer Halogenase-Typ in Verbindung mit einer Tandem-ACP-Domänen-Struktur in der Typ I Polyketidsynthase CabD könnte für die Ausbildung halogenierter Derivate verantwortlich sein. Der Nachweis eines codierenden Bereichs mit Rieske-Domäne (cabM) lässt eine direkte oxidative intermolekulare Makrozyklisierung bei der Assemblierung vermuten.
Um zukünftige Untersuchungen des im bekannten chemical space unterrepräsentierten Strukturmotivs 3,4-disubstituierter bzw. 3,4-verbrückter 1H-Indol-Derivate zu ermöglichen sollte im Zuge der praktischen Arbeiten, welche dieser Dissertation zugrunde liegen, eine Reihe bisher nicht literaturbekannter Verbindungen dieser Substanzklasse, auch unter Verwendung von Multikomponentenreaktionen, dargestellt und charakterisiert werden. Weitere Untersuchungen zur Derivatisierung und Modifikation des Strukturmotivs sollten durchgeführt werden und im Idealfall zu einem weiteren Ringschluss an den tricyclischen Substraten führen. Relevante Verbindungen sollten anschließend in einer Reihe von (internationalen) Screening-Kampagnen und bei Kooperationspartnern hinterlegt werden, um langfristig eine nähere Charakterisierung ihrer physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften zu erreichen, welche gegebenenfalls zur weiteren Optimierung des Strukturmotivs für spezifischere Anwendungen führen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen drei Substanzbibliotheken verschiedener Grundkörper darzustellen und zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um 13 Derivate der cyclischen Bisamide vom 5-Oxo-1,3,4,5-tetrahydropyrrolo[4,3,2-gh]isochinolin-3-carboxamid-Typ, welche sich durch Ugi-MCR aus einem geeigneten bifunktionellen Reagenz, sowie verschiedenen primären Aminen und Isocyaniden in Anlehnung an die Arbeiten von Mironov et al. synthetisieren ließen. Weiterhin konnten, ausgehend von den tricyclischen Verbindungen vom 2-Methyl-5-oxo-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure- und 2-Methyl-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure-Typ, welche nach einer modifizierten Vorschrift nach Böshagen et al. erhalten werden konnten, zwei weitere Substanzbibliotheken mit 33 bzw. 24 individuellen Amid-Derivaten hergestellt werden. Dabei konnte durch Verwendung geeigneter Substrate nach der Amidkupplung die Freilegung eine basischen funktionellen Gruppe in einigen Verbindungen erreicht werden, welche die Bildung eines Hydrochlorid-Salzes ermöglichte und dadurch die Wasserlöslichkeit der neuen Verbindungen deutlich zu erhöhen vermag.
Auch gelang durch Einsatz des ökologisch äußerst vorteilhaften Lösungsmittels Dihydrolevoglucosenon die Entwicklung einer „grüneren“ Vorschrift zur Synthese dieser Substanzen, welche auf den Einsatz des, aus ökologischen und gesundheitlichen Gründen kritisch zu hinterfragenden, Lösungsmittels N,N-Dimethylformamid verzichtet.
Die Untersuchungen zur weiteren strukturellen Modifikation der erhaltenen 3,4-verbrückten 1HIndol- Derivate verlief nicht mit dem erhofften Erfolg, da viele Untersuchungen zu dieser Thematik unter anderem mittels Diels-Alder-Reaktion und Olefin-Metathese nicht zu isolierbaren Produkten führten. Allerdings konnte durch Diamin-vermittelte Ringschlussreaktion von 3-Formyl-1H-indol- 4-carbonsäuremethylester letztlich eine Synthesevorschrift zur Darstellung tetracyclischer Derivate erhalten werden. Die aus diesen Versuchen hervorgegangene Verbindung konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zur Kristallisation gebracht und am Institut für Biochemie der Universität Greifswald im Arbeitskreis für Synthetische und Strukturelle Biochemie röntgendiffraktometrisch untersucht werden, was zur Bestätigung der angenommenen Konstitution führte.
Erste Evaluationen der biologischen Aktivität der dargestellten Verbindungen konnten bereits im Arbeitskreis Pharmazeutische Bioanalytik der Universität Greifswald vorgenommen werden: Dabei wurden die relevanten Verbindungen mittels MTT-Assay auf eventuelle Zytotoxizität hin untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass von den meisten untersuchten Verbindungen keine Zytotoxizität ausgeht, wobei dies allerdings, aufgrund der Limitationen des MTT-Assay im Bezug auf diese Aussage, in weiteren Untersuchungen abschließend geklärt werden sollte. Weiterhin konnte für einige der synthetisierten Verbindungen eine Inhibition der Arachidonat-5-Lipoxygenase (5-LOX) mit IC50-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich in vitro nachgewiesen werden. Der genaue Mechanismus der Inhibition, ebenso wie eine eventuell vorhandene Selektivität gegenüber anderen Arachidonat-Lipoxygenasen soll Gegenstand zukünftiger Untersuchungen, unter anderem am isolierten Enzym 5-LOX und in Homogenaten, sein. Darüber hinaus konnte ein großer Teil der synthetisierten Verbindungen im Molekülarchiv „Compound Platform“ (ComPlat) des Karlsruhe Institut für Technologie (KIT) hinterlegt werden, wo sie einer Vielzahl von potentiellen Kooperationspartnern zur Verfügung stehen. Erste Ergebnisse einer solchen Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Fahrer der Technischen Universität Kaiserslautern sollen zeitnah in einer gemeinsamen Publikation veröffentlicht werden. DesWeiteren konnten 40 Verbindungen in der „Testing4Ag“-Kampagne des Unternehmens Bayer Crop Science untergebracht werden, wo ihre Wirkung auf ein breites Spektrum von Schädlingen, Pilzen und Unkräutern evaluiert werden soll. Die Ergebnisse dieser Testungen stehen zum Zeitpunkt der Niederschrift dieser Arbeit noch aus. Eine Hinterlegung von 40 Substanzen in der EU-OPENSCREEN-Plattform, einer non-profit-Abteilung des European Research Infrastructure Consortium (ERIC) wird vorbereitet.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
Trotz aller Erfolge in der Chemotherapie mit platinhaltigen Antitumormitteln bestehen dennoch viele Nachteile. Ein Fortschritt brachte die Entwicklung von lichtempfindlichen Pt(IV)-Verbindungen, die sich selektiv in Tumorzellen aktivieren lassen. Durch die geringe Eindringtiefe von kurzwelligem Licht wäre das Anwendungsgebiet auf oberflächige Tumore limitiert. Durch die Kopplung von Pt(IV)-Prodrugs mit upconversion-lumineszierende Nanopartikel (UCNPs) könnte die aktivierte Pt(II)-Spezies durch Bestrahlung mit NIR-Licht, welches durch UCNPs aufwärtskonvertiert wird, freigesetzt werden. Daher wurden sechs Bistetrazolatoplatin(II)-Komplexverbindungen sowie zwölf Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe synthetisiert und charakterisiert. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe stellen die ersten Beispiele für mononukleare Diamminbistetrazolato-Pt(II) Komplexe dar. Untersuchungen der Synthese ließen vermuten, dass es während der Synthese zur cis/trans-Isomerie kommt. Durch die Röntgenkristallstruktur konnte eine N2-Koordination des Tetrazolatliganden nachgewiesen werden. Entgegen der Erwartung, konnte keine eine lichtinduzierte Aktivierung der hergestellten Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe nachgewiesen werden. Trotzdem wurden die Eigenschaften der synthetisierten Verbindungen im Hinblick auf eine potenzielle Anwendung als Pt-basierte Zytostatika weiter untersucht wurde. Es zeigte sich, dass cis/trans-[Pt(OH)2(5-phenyltetrazolato)2(NH3)2] durch Ascorbinsäure in eine Spezies, die irreversibel an DNA bindet, umgewandelt werden kann. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe waren gegen adhärente Zelllinien nicht sonderlich aktiv, wohingegen nahezu alle der getesteten Bistetrazolato-Pt(IV) diammine antiproliferierende Aktivität gegen humane adhärente Krebszelllinien zeigten und dabei (IC50-Werte < 20 µM) gefunden wurden. Auch wenn einige der vorgestellten Syntheserouten eine Optimierung bedürfen und die gefundene Zytotoxizität durch die Einführung anderer Tetrazolderivate in Pt(II)-Komplexverbindung sicherlich weiter gesteigert werden kann, konnten die Befunde einen relevanten Beitrag zum Verständnis der Komplexierung von Tetrazolatanionen an ein Pt-Zentrum leisten. Aufgrund dessen, dass die Lichtempfindlichkeit von Diiodido-Pt(IV) Komplexen bekannt war, wurden fünf neuartige Diiodido-Pt(IV) diamine (25, 26, 27, 28 und 29) synthetisiert. Daraufhin wurde sich mit der Herstellung von seltenerd-dotierten NaYF4/NaGdF4-UCNPs sowie mit der Kopplung dieser mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen beschäftigt. Zunächst wurde überprüft, ob die Bestrahlung mit einem NIR-Laser (λ = 980 nm) in Gegenwart von UCNPs tatsächlich zu einem Abbau der Diiodido-Pt(IV) Komplexe sowie zu einer erhöhten DNA-Platinierung führt. Nachdem dies bestätigt war, wurden drei verschiedene Kopplungsmethoden angewandt. Für die kovalente Kopplung (Konjugatherstellung) wurden Diiodido-Pt(IV) Komplexe mit freier Carboxygruppe über eine Amidbindung mit amino-modifizierten NaGdF4:Yb,Er/Tm-UCNPs verknüpft. Der zweite Kopplungsansatz beinhaltet den Austausch der an der Nanopartikeloberfläche koordinierten Oleatliganden mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen (Herstellung von Konstrukten). Durch die XPS-Analyse der Kopplungsprodukte kann gefolgert werden, dass beide Strategien eine Kopplung zwischen Pt Komplex und UCNPs ermöglichen, da Platin auf der Nanopartikeloberfläche nachgewiesen werden konnte. Allerdings liegt, unabhängig von der angewandten Kopplungsmethode, Pt zu 70–80 % im Oxidationszustand II vor. Die Verbindungen wiesen ohnehin eine gewisse Instabilität in Lösung auf. Die dritte Methode umfasst den Einschub des hydrophoben Pt(IV) Komplexes 29 in die Oleathülle. Der Nachweis von Pt auf diesem Konstrukt ist noch nicht gelungen, in vitro-Testungen ließen jedoch das Vorhandensein einer aktiven Pt-Spezies auf der Oberfläche vermuten. Für die Evaluierung der Zytotoxizität der NIR-Licht-vermittelten Antitumor-Aktivierungssysteme (Konjugate/Konstrukte) wurden diverse Methoden mit Variation im Bestrahlungsablauf vorgestellt. Hierbei stellte sich heraus, dass die Viabilität bei Bestrahlung der Konjugate/Konstrukte in Anwesenheit von Zellen im Vergleich zu Dunkelkontrollen signifikant herabgesenkt werden konnte. Allerdings besaß der NIR-Laser selbst einen toxischen Effekt gegenüber HL-60-Zellen. Die zunehmende Pt-Freisetzung der Konjugate mit der Bestrahlungsdauer und die geringe Pt-Freisetzung von Konstrukten, macht die Konjugate, insbesondere NaGdF4:Yb,Er-OA-SiO2-NH-28, zu besseren Kandidaten für die PACT. Dies wird bekräftigt durch die leicht höhere gefundene Toxizität der Konjugate im Vergleich zu den entsprechenden Konstrukten. Die dargestellten Konjugate/Konstrukte sind die ersten Beispiele für eine Kopplung von Diiodido-Pt(IV) Komplexen mit NaGdF4-UCNPs. Damit sich allerdings das vorgestellte Konzept der NIR-Aktivierung von lichtempfindlichen Diiodido-Pt(IV) Komplexen durchzusetzen kann, bedarf es noch Optimierungen hinsichtlich der Kopplungsstrategien.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.
Die Verlängerung des Aufenthalts einer Arzneiform im Magen kann enorme Vorteile insbesondere für Arzneistoffe mit einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm oder schlechter Bioverfügbarkeit bieten. Bei gleichzeitig kontrollierter Freisetzung eines enthaltenen Wirkstoffs können Plasmaspitzen und Fluktuationen im Blutplasma vermieden werden. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung solcher potentiell gastroretentiver Darreichungsformen in vitro und in vivo. Der Hauptteil der Arbeit umfasste die Entwicklung einer neuartigen Arzneiform, die bei nüchterner und postprandialer Gabe eine zuverlässige Gastroretention über mehrere Stunden zeigen und den Wirkstoff kontrolliert im Magen freigeben sollte. Das System bestand aus einer wirkstoffhaltigen Kerntablette und einem den Kern umgebenden, quellenden Mantel, welcher durch Expansion die angestrebte Gastroretention ermöglichen sollte. Im Rahmen der Formulierungsentwicklung erwies sich die Mischung aus einem hoch- und niedrigmolekularen Polyethylenoxid als geeignet für die Kontrolle der Wirkstofffreisetzung aus dem Kern. Die Ergänzung wasserlöslicher, osmotischer Hilfsstoffe ermöglichte eine weitgehend pH-unabhängige und vollständige Wirkstofffreigabe. In vitro-Quellungsstudien mit den entwickelten Manteltabletten ergaben eine schnelle und ausgeprägte Größenzunahme bei Testung in einfachen Freisetzungsmedien. Zur Prüfung des tatsächlichen gastroretentiven Potentials der entwickelten Manteltabletten mit dem Diuretikum Furosemid wurde eine Magnetic Marker Monitoring (MMM)-Studie durchgeführt. Das MMM basiert auf der magnetischen Markierung einer Arzneiform und der Bestimmung ihrer Lokalisation im Gastrointestinaltrakt mittels empfindlicher Sensoren. Nach Nüchterneinnahme wurden die Manteltabletten innerhalb von 38 ± 12 min aus dem Magen der Probanden entleert. Bei Applikation der Manteltabletten nach Einnahme einer hochkalorischen, standardisierten Mahlzeit konnte eine durchschnittliche Gastroretentionszeit von 8 ± 3 h erzielt werden. Die AUC(0-24 h) konnte im Studienarm mit Nahrung im Vergleich zur Nüchterneinnahme von 89 ± 56 ng·h/mL auf 708 ± 304 ng·h/mL gesteigert werden. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuartiges mechanisches Antrummodell entwickelt, mit dem der Einfluss antraler Kontraktionswellen auf die Tendenz zur Entleerung von Objekten untersucht wurde. Große, starre Objekte wie eine Glaskugel wurden aufgrund ihrer geringen Reibung vor der Welle hergeschoben und aus dem Modell entleert. Auch die reibungsverminderte Oberfläche eines Cryogel-Schaums erhöhte die Tendenz zur Entleerung aus dem Modell. Vielversprechend war dagegen die unter allen variablen Testbedingungen beobachtete Gastroretention eines Trichobezoars. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass weiterhin eine große Herausforderung in der Entwicklung von Arzneiformen besteht, die eine nachweisliche Gastroretention beim Menschen in Abwesenheit von Nahrung zeigen.
Die Implantation von Arzneistoff-freisetzenden (drug-eluting) Stents in durch Ballonangioplastie revaskularisierte Koronararterien stellt heutzutage eine der wichtigsten Methoden zur Prävention von Restenosen der betroffenen Gefäßabschnitte dar. Die Erzielung wirksamer Konzentrationen der hochpotenten Wirkstoffe in der Gefäßwand unter Vermeidung von unerwünschten systemischen Arzneimittelwirkungen soll durch die kontrollierte Arzneistofffreisetzung im stenosierten Gefäßabschnitt gewährleistet werden. Aufgrund der Unzugänglichkeit des Wirkortes für direkte Konzentrationsbestimmungen liegen bis dato jedoch nur wenige Daten bezüglich der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Humanstudien vor. Da die zur Verfügung stehenden offizinellen und nicht offizinellen Methoden zur Untersuchung des In vitro-Verhaltens von Arzneiformen lediglich ein Akzeptorkompartiment aufweisen, sind sie ebenfalls nur bedingt zur Vorhersage der Freisetzung aus einem Stent am Implantationsort geeignet. Verteilungprozesse können mit diesen Methoden nicht beschrieben werden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen an die In vivo-Bedingungen am Implantationsort adaptierten In vitro-Freisetzungstest für Arzneistoff-freisetzende Stents basierend auf den Methoden des Europäischen oder US-Amerikanischen Arzneibuchs zu entwickeln. Der Freisetzungstest sollte dazu geeignet sein, sowohl die Wirkstofffreisetzung und -verteilung zwischen verschiedenen Kompartimenten als auch räumliche Verteilungsmuster innerhalb eines Gefäßwand-simulierenden Kompartiments zu untersuchen. Als Basis für die Modellentwicklung wurde aufgrund der am Implantationsort in vivo vorliegenden Bedingungen die Durchflusszellen-Apparatur ausgewählt, die die einzige offizinelle Methode darstellt, bei der ein gerichteter Fluss erzeugt wird. Zur Simulation der Gefäßwand sollte ein zusätzliches Akzeptorkompartiment in die Durchflusszelle eingebracht werden. Da das Kompartiment einerseits formstabil sein sollte und andererseits die Aufnahme und den Transport des Arzneistoffs durch Diffusion ermöglichen sollte, wurden verschiedene Hydrogele hinsichtlich ihrer Eignung zur Integration in die Durchflusszelle untersucht. Calciumalginat wurde als geeignetes Hydrogel für das zusätzliche Akzeptorkompartiment identifiziert und durch Veränderungen an der Durchflusszellen-Apparatur erfolgreich in den Freisetzungstest integriert. Es wurde eine zentrale Aussparung im Hydrogel geschaffen, die im Modell das Gefäßlumen simuliert und in die ein Stent mittels Ballonkatheter implantiert werden kann. Nach der Implantation des Stents kann die Öffnung im Hydrogel mit dem Freisetzungsmedium mit einer Flussrate von 35 ml/min, die dem Blutfluss in Koronarien entspricht, perfundiert werden. Durch Einsatz geeigneter Medienvolumina kann die Einhaltung von Sinkbedingungen, die als das größte Problem der häufig eingesetzten nicht offizinellen Testsysteme gilt, sichergestellt werden. Nach erfolgter Entwicklung wurde die Eignung des Modells durch die Testung verschiedener Stentmodelle geprüft werden. Neben der Bestimmung der Freisetzung der Modellsubstanzen ins Durchflussmedium während der Perfusion und der am Versuchsendpunkt in der Stentbeschichtung verbliebenen Modellsubstanz-Anteile wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Hydrogels nach Beendigung der Perfusion entwickelt. Zur direkten Quantifizierung der ins Hydrogel diffundierten Modellsubstanz wurde eine geeignete Methode zur Verflüssigung des Gels identifiziert. Zur Untersuchung der räumlichen Verteilung innerhalb des Hydrogels wurden zwei Methoden zur Präparation des Hydrogels entwickelt, die die Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop ermöglichten. Einerseits wurde anhand von Mikrotomschnitten die Diffusionstiefe im Querschnitt untersucht. Unter Verwendung von Alginatfilmen war andererseits die Untersuchung der Innenseite des simulierten Gefäßlumens parallel zur Flussrichtung möglich. Unter Verwendung einer Finite-Elemente-Methode konnten zudem ausgewählte Freisetzungsversuche mathematisch modelliert werden. Für die Berechnungen wurden im Rahmen dieser Arbeit experimentell bestimmte Diffusionskoeffizienten zu Grunde gelegt. Die Ergebnisse der Freisetzung mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Testsystem wiesen im Vergleich zur Testung mit offizinellen Methoden eine Verlangsamung der Entleerung der Stentbeschichtung bei allen Modellsubstanzen durch die an die In vivo-Situation adaptierten Einbettungs- und Flussbedingungen auf. Diese Beeinflussung der Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Freisetzungsbedingungen unterstreicht die Notwendigkeit, für die In vitro-Evaluation von Arzneistoff-freisetzenden Stents spezialisierte, an die In vivo-Bedingungen adaptierte Testsysteme einzusetzen. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Freisetzungsmodell steht erstmals ein solches Testsystem zur Verfügung.
Pentathiepine sind siebengliedrige, heterocyclische Polysulfane. Sie gehören damit zur Gruppe organischer Polysulfide und somit zu einer Stoffklasse, die in den letzten Jahren wachsendes Interesse hinsichtlich pharmazeutisch/medizinisch nutzbarer Eigenschaften geweckt hat. Sie besitzen unterschiedliche biologische Wirkungen, die möglicherweise auf die Aktivierung durch Thiole, wie zum Beispiel Glutathion (GSH), zurückzuführen sind. Dazu gehören die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies und die oxidative Fragmentierung von DNA.
Pentathiepine zeigen sich als gelbe, schwer lösliche Feststoffe und sind in sauren Lösungen sehr stabil. In Lösungen, die Basen oder Nukleophile enthielten, nahm der Gehalt an Pentathiepinen jedoch sehr schnell ab. In dieser Arbeit sollte hauptsächlich untersucht werden, inwieweit sich die Stabilität der Pentathiepine auf die biologischen Eigenschaften auswirkt. Neben der Ermittlung der Verteilungskoeffizienten 23 verschiedener Pentathiepine, wurden auch enzymbasierte Assays durchgeführt.
Dazu gehörte die Bestimmung der Reversibilität der Hemmung an boviner Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) sowie der Einfluss unterschiedlicher Inkubationsbedingungen auf die inhibitorische Wirkung. Dabei wurde für das untersuchte Pentathiepin mittels jump dilution keine irreversible Hemmung an boviner GPx-1 gefunden. Eine irreversible Inhibierung konnte jedoch für Mercaptobernsteinsäure gezeigt werden. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Inkubationsbedingungen erlauben die Schlussfolgerung, dass der intakte Pentathiepinring wahrscheinlich nicht an der Hemmung der GPx-1 beteiligt ist, sondern die aus der Reaktion mit GSH gebildeten Abbauprodukte. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass der Pentathiepinring mindestens als „Schwefeltransporter“ benötigt wird. Ein Übertrag des GPx-Assays auf die HPLC konnte als prinzipiell möglich, für die Pentathiepine jedoch als nicht geeignet gezeigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden sechs Pentathiepine mit vier unterschiedlichen Grundgerüsten hinsichtlich ihrer Stabilität in Gegenwart von GSH untersucht. Dabei gab es hinsichtlich der Reaktivität der Pentathiepine sehr starke Unterschiede. Trotz dieser großen Unterschiede konnten keine Unterschiede hinsichtlich der GPx-Hemmung und der antiproliferativen Eigenschaften beobachtet werden. Auch eine Absenkung der intrazellulären GSH-Konzentration durch Inkubation mit DL-Buthioninsulfoximin in drei humanen Krebszelllinien mit unterschiedlichem Glutathiongehalt ergab keine Unterschiede zwischen den getesteten Substanzen. Sie waren nach Vorinkubation der Zellen durchgehend aktiver.
Aufgrund der vergleichsweise hohen Reaktivität in Gegenwart von GSH sollte ein Pentathiepin in einem proof of concept in Liposomen formuliert werden. Diese Formulierung sollte einerseits das Pentathiepin vor Reaktionen mit Thiolen wie GSH schützen, andererseits die Wasserlöslichkeit erhöhen. Dabei ergab sich, dass die Wasserlöslichkeit der Pentathiepine durch Formulierung in DOPC-Liposomen von unter 3 μM auf über 400 μM erhöht werden konnte. In Hinsicht auf die Stabilität ergab sich eine erhöhte Stabilität des untersuchten Pentathiepins in Anwesenheit von 10 mM GSH um den Faktor 4 in der Zeit bis zum vollständigen Abbau. Hinsichtlich der antiproliferativen Eigenschaften ergab sich keine Abnahme der Wirkung des Pentathiepins durch Formulierung in Liposomen.
Innovative Wirkstoffe stellen die Entwickler und Entwicklerinnen von pharmazeutischen Darreichungsformen vor große Herausforderungen. Viele neue Arzneistoffe weisen eine unzureichende orale Bioverfügbarkeit auf. Die Gründe hierfür sind vielfältig und liegen unter anderem in der ortsabhängigen Löslichkeit und Permeabilität der betreffenden Substanzen. Dieser Problematik kann auf chemischer und technologischer Ebene begegnet werden. Auf der Seite der pharmazeutischen Technologie besteht beispielsweise die Möglichkeit, mukoadhäsive Darreichungsformen zu entwickeln. Darunter versteht man Systeme, die an der Schleimhaut haften und dadurch eine Retention des Arzneistoffes an der entsprechenden Stelle bewirken. Einerseits führt dies zu einer lokalen Erhöhung der Wirkstoffkonzentration, andererseits wird durch die Adhäsion die potenzielle Resorptionszeit verlängert. Beide Faktoren können sich positiv auf die Bioverfügbarkeit auswirken.
Zur Charakterisierung mukoadhäsiver Arzneiformen sind verschiedene Methoden beschrieben worden, von denen jedoch keine standardisiert ist. Mögliche Einflussfaktoren auf die Messung wurden in der Vergangenheit teilweise nicht ausreichend evaluiert, was die Konzeption einer geeigneten Messmethode erschwert. In der vorliegenden Arbeit wurde systematisch eine Methode zur Messung der Adhäsivität von Polyvinylalkohol-Filmen auf Basis der Messung der maximalen Haftkraft erarbeitet. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit ein in vitro-Test durchgeführt, der zur Aufklärung gerätespezifischer Einflussfaktoren diente. Es zeigte sich, dass die Adhäsion von PVA-Filmen an biomimetischen Agar/Muzin-Gelen in erster Linie zeitabhängig ist. Das Maximum der Adhäsion konnte nach 3 min beobachtet werden. In dieser Zeit kommt es zu einer Quellung des zuvor festen Films, wodurch die Beweglichkeit der Polymerketten zunimmt. Dies kann die Vernetzung von Polymer und Muzin begünstigen, wodurch die Adhäsion zunimmt. Nach Überschreiten eines Maximums kommt es zu einer Überhydratisierung des Systems und zu einer Abnahme der Kohäsion, so dass der Gelfilm beim Entfernen der Messsonde in sich reißt.
Die Geschwindigkeit, mit der die Sonde entfernt wurde, beeinflusste ebenfalls die Ergebnisse der Untersuchungen. Höhere Geschwindigkeiten führten zu höheren berechneten Adhäsionsarbeiten Wad, während die maximale Abrisskraft Fmax ein Plateau erreichte. Dieses Verhalten könnte durch die viskoelastischen Eigenschaften der beteiligten Bindungspartner beeinflusst werden.
Bezüglich der gerätespezifischen Parameter schien die Anpresskraft des Mukoadhäsivs an das biomimetische Gel den geringsten Effekt auszuüben. Unter Berücksichtigung der verwendeten Kraftmesszelle und der Integrität des Gels sollten höhere Anpresskräfte verwendet werden. Je nach Applikationsort sind physiologische Drücke zu berücksichtigen.
Ausgehend von den in vitro gewonnenen Erkenntnissen wurden anschließend zwei ex vivo Versuche durchgeführt. Diese Versuche konzentrierten sich auf die Eigenschaften der Substrate selbst, auf denen die PVA-Filme haften sollten. Der Einfluss der Präparation der verwendeten Gewebe auf die Adhäsion wurde sowohl an Dünndarmpräparaten vom Schwein als auch am Menschen untersucht. Die Gewebe wurden zum einen im frischen Zustand unmittelbar nach der Entnahme für die Mukoadhäsionsmessungen verwendet, im zweiten Versuchsabschnitt wurden sie für eine Woche im Gefrierschrank gelagert und für die Experimente aufgetaut. Bei den Schweinedärmen stellte sich die Frage, ob die Reinigung der frischen Därme einen zusätzlichen Effekt haben könnte. Aufgrund der geringen Probenzahl konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Bei zwei von drei Versuchstieren erhöhte sich die errechnete Arbeit (Wad) durch die vorsichtige Reinigung. Beim Auftauen der gereinigten Gewebe konnte bei allen Versuchstieren ein Anstieg der Wad sowie der maximalen Abrisskraft beobachtet werden. Diese Daten wurden statistisch mit den Ergebnissen der ex vivo-Humanstudie verglichen. Das Probandenkollektiv, dessen Daten in die Untersuchungen einflossen, umfasste insgesamt 12 Teilnehmer, die sich aufgrund verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen einer geplanten Operation unterziehen mussten. Gesundes Dünndarmgewebe, das aus operationstechnischen Gründen zusätzlich zum erkrankten Gewebe entfernt werden musste, wurde im Rahmen der Studie verwendet. Der statistische Vergleich der Gewebe unterschiedlicher Herkunft zeigte sowohl im frischen als auch im aufgetauten Zustand keine signifikanten Unterschiede. Bei Betrachtung der einzelnen Messwerte konnte jedoch festgestellt werden, dass die berechneten Wad bei menschlichem Gewebe etwas höher lagen als bei Schweinepräparaten. Eine größere Probenzahl könnte einen möglichen statistisch signifikanten Unterschied aufzeigen. Bei menschlichem Gewebe konnte außerdem festgestellt werden, dass die Verwendung einer Messeinstellung mit höherer Anpresskraft, längerer Kontaktzeit und schnellerem Entfernen der Messsonde zu signifikant höheren Wad führte (Einstellung A vs. Einstellung B). Bei allen Messungen wurde deutlich, dass die Adhäsionsarbeit empfindlicher auf Änderungen der Messparameter reagiert und daher möglicherweise der geeignetere Surrogatparameter für die Quantifizierung der Mukoadhäsion ist. Insgesamt zeigte sich bei den biologischen Präparaten eine deutlich größere Variabilität der Messwerte als bei den in vitro-Versuchen. Bei dem humanen Gewebe der ex vivo-Studie handelte es sich um Gewebe, welches von der für den Eingriff ursächlichen Erkrankung nicht betroffen war. In diesem Zusammenhang ist die große interindividuelle Variabilität der Messwerte auf der gesunden Schleimhaut hervorzuheben. Bei der Anwendung mukoadhäsiver Filme auf histologisch veränderter, pathogener Schleimhaut könnte die Mukoadhäsion möglichweise sogar weitaus variabler sein, da in diesem Fall neben der histologischen Veränderung auch eine mögliche Begleitmedikation eine Rolle spielen könnte. Diese Aspekte sollten bei dem Design einer Darreichungsform, aber auch eines geeigneten Testsystems zukünftig berücksichtigt werden.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können zur weiteren Optimierung und Validierung einer Messmethode für die Mukoadhäsion beitragen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Um die biologische Relevanz dieser in vitro-Experimente zu verbessern, können physiologische Daten aus telemetrischen Systemen genutzt und in den experimentellen Aufbau implementiert werden.
Das kolorektale Karzinom stellt mit ca. 63.000 Neuerkrankungen pro Jahr die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland dar.1 Weltweit wird bis 2030 mit einem Anstieg der Inzidenz und Mortalität um 60 % gerechnet..264 Dabei steigt die Zahl der Kolonkarzinome in Schwellenländern bereits deutlich an und betrifft immer jüngere Menschen.2 Aufgrund dieser gesundheitlichen Herausforderungen ist die Entwicklung neuer Therapieverfahren von besonderem Interesse. Mit der Entdeckung einer möglichen Beteiligung von Gerinnungsproteasen an der Progression verschiedener Karzinome, darunter auch kolorektaler Erkrankungen, wurde ein neuer therapeutischer Angriffspunkt geschaffen, der im Rahmen der vorliegenden Dissertation untersucht werden sollte. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Wirkung des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa und der PAR2-Aktivierung auf das Kolonkarzinom in vitro und in vivo.
In vitro wurden drei verschiedene Kolonkarzinomzelllinien (murine MC38 Zellen, humane HCT116 Zellen und humane CaCo2 Zellen) vergleichend auf den Einfluss von FXa untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass die Proliferation und Migration von MC38 Zellen durch FXa, nicht aber durch Thrombin signifikant erhöht wird. Der gleiche Effekt wird im Wound Scratch Assay nach selektiver PAR2-Aktivierung (Protease Activated Receptor 2) beobachtet, was auf einen PAR2-gesteuerten Migrationseffekt in MC38 Zellen hindeutet, da FXa seine zellulären Effekte über PAR2 vermitteln kann. Darüber hinaus kann eine Beteiligung des EGFR an dieser FXa-induzierten Migration bestätigt werden. Im Western Blot zeigt sich eine verstärkte Aktivierung der Signalmoleküle p38 MAPK, p44/42 MAPK und AKT nach FXa-Stimulation als mögliche Ursache der migratorischen und proliferativen Effekte des Gerinnungsfaktors. Der Einsatz des EGFR-Inhibitors Erlotinib zeigte eine Beteiligung des EGFR an der Aktivierung von p38 MAPK und AKT in MC38 Zellen. Die Stimulation von Kolonkarzinomzellen der Maus mit FXa führt zudem zu einer signifikant erhöhten Expression von PAR2.
Die aktivierten Gerinnungsfaktoren FXa und Thrombin haben dagegen keinen Einfluss auf die Proliferationsrate von humanen HCT116 und CaCo2 Zellen in vitro. Während die Motilität von CaCo2-Zellen durch FXa und Thrombin reduziert wird, erhöhen diese die Migrationsfähigkeit von HCT116-Zellen signifikant. Die selektive PAR2-Aktivierung führt ebenso wie FXa zu einer reduzierten Motilität der CaCo2-Zellen. Dies deutet auf einen PAR2-vermittelten Effekt hin. In HCT116 Zellen löst sowohl eine PAR1- als auch eine PAR2-Aktivierung eine signifikant erhöhte Zellmigration aus. Das zugrundeliegende promigratorische Signal nach FXa-Stimulation konnte mittels Western Blot in der gesteigerten Phosphorylierung von p38 MAPK und p44/42 MAPK in CaCo2 Zellen gefunden werden. In HCT116 Zellen hatte FXa keinen Einfluss auf die Aktivierung dieser Signalmoleküle.
In vivo wurde erfolgreich ein Tiermodell für die subkutane Injektion von murinen Kolonkarzinomzellen etabliert. Dabei werden eine Million MC38 Zellen in die Flanke von C57Bl/6J Wildtyp und PAR2-KO Mäusen mit C57Bl/6J Hintergrund injiziert und das Tumorwachstum über 21 Tage beobachtet. Die Ergebnisse zeigen einen entscheidenden Einfluss von PAR2 auf die Tumorentstehung. PAR2-KO Mäuse weisen nach 21 Tagen signifikant kleinere Tumore auf als ihre Wildtyp Artgenossen. PAR2-KO Tiere müssen zudem seltener aufgrund ihres Gesundheitszustandes vorzeitig aus dem Versuch genommen werden. Auffällig ist auch das größere Milzgewicht im Verhältnis zum Körpergewicht bei PAR2-KO Tieren, was auf gesteigerte Inflammationsreaktionen hindeuten könnte. Der Einsatz eines direkten FXa-Hemmers (Apixaban) in klinisch relevanten Dosierungen hat in vivo keinen signifikanten Einfluss auf die Progression des Kolonkarzinoms.
Die in dieser Arbeit generierten Daten belegen vor allem die Bedeutung von PAR2 für die Progression des Kolonkarzinoms: In vitro können zum Teil starke, aber sehr unterschiedliche Effekte des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa bzw. des aktivierten PAR2 auf kolorektale Karzinomzellen beobachtet werden. In vivo hingegen zeigt sich, dass weniger FXa als vielmehr die Aktivierung von PAR2 direkt an der Progression des kolorektalen Karzinoms beteiligt ist. Durch molekularbiologische Untersuchungen mittels PCR konnte zudem eine Beteiligung des S1P-Signalweges nachgewiesen werden.
Bereits seit dem Ende des 20. Jahrhunderts ist bekannt, dass PAR1 in verschiedenen Krebsarten überexprimiert wird und direkt mit der Malignität von Tumorerkrankungen assoziiert werden kann. Auch eine steigende PAR2-Expression kann mit einem schlechteren Outcome bei Patienten mit Magen- oder Prostatakrebs in Verbindung gebracht werden.186 In der vorliegenden Arbeit konnte der Zusammenhang zwischen PAR2-Signaling und einer schlechteren Prognose im Darmkrebs-Tiermodell bestätigt werden. Die Expression des Rezeptors im Endothel oder im Gastrointestinaltrakt, in direkter Umgebung des Tumors, kann einen starken Einfluss auf das Tumorgeschehen ausüben. Die Inhibition von PAR2 oder des nachgeschalteten PAR2-Signalings könnte daher einen vielversprechenden neuen Therapieansatz beim kolorektalen Karzinom darstellen.
Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
Im Rahmen des Verbund-Forschungsprojektes KOKON wurde nach systematischer Literaturrecherche eine Datenbank entwickelt; in der KOKONbase sind sowohl die Interaktionsprofile als auch die Interaktionsmatrix die wesentlichen Elemente der Vorhaltung von primärem und bewertetem Wissen. In der Interaktionsmatrix wird mit Hilfe eines Ampelschemas die Möglichkeit der Beeinflussung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen durch ausgewählte Drogen dargestellt. Die Droge und die Arzneistoffe werden paarweise abgebildet. Die Interaktionsmatrix wird durch praktisch tätige Onkologen als sehr wertvolles Instrument in der onkologischen Beratungspraxis angesehen, um schnell einen Überblick über das von einer Droge ausgehende Gefahrenpotential bzgl. der Beeinflussung der Wirksamkeit eines in der Onkologie genutzten Arzneistoffs zu bekommen.
Ein neuer vielversprechender Ansatz, die Resistenz von Tumorzellen gegen Zytostatika zu umgehen, stellte die Hemmung von selenhaltigen Redoxenzymen, Glutathionperoxidase (GPx) und Thioredoxinreduktase (TrxR), dar. Das Ziel dieser Arbeit war, neuartige GPx-Inhibitoren zu entdecken und zu entwickeln. Der erste Ansatz war die Synthese und biologische Testung einer Zuckeracetal-Struktur, die als GPx-1-Inhibitor postuliert wurde. Synthetische Abwandlungen ergaben vier Acetale aus Glucosederivaten und Benzaldehyden. Jedoch zeigten diese ersten hergestellten Verbindungen keinerlei Hemmwirkung auf die bovine GPx-1. Der zweite Ansatz war, bereits bekannte, schwach aktive Leitstrukturen durch Koordinierung von Pt(II) an den Heterozyklus (2-Methylimidazol, Imidazol oder Pyrazol) zu stärkeren Hemmstoffen der GPx abzuwandeln, wobei das Platin(II)-atom an das Selen des Enzyms koordiniert und dies irreversibel hemmt. Es wurde eine Substanzbibliothek aus 15 heterozyklischen Liganden synthetisiert, welche anschließend mit Cis- oder Transplatin zu den cis- bzw. trans-Monochlorido-Platin(II)-Komplexen umgesetzt wurden. So wurden 28 Platinverbindungen in guter Reinheit erhalten und verschiedenen biologischen Testungen unterzogen. Diese Testungen umfassten Versuche zur Hemmung der bovinen GPx-1, wobei jedoch festgestellt wurde, dass dieses Enzym nicht gehemmt wurde. Weiterhin wurde untersucht, ob die TrxR, ein weiteres Selen-abhängiges Redoxenzym, durch diese Verbindungen inhibiert wird, was teilweise der Fall war, auch wenn keine eindeutigen Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt werden konnten. Die Pt(II) enthaltenden Substanzen wurden auch auf ihre Fähigkeit, die Proliferation von humanen Krebszelllinien zu hemmen, getestet. Es wurde festgestellt, dass einige der Verbindungen in der Lage sind, die Zellteilung mit IC50-Werten unterhalb 1 µM zu unterbinden. Dabei handelte es sich meist um cis-konfigurierte Platin(II)-Verbindungen, aber auch manche trans-Pt-Komplexe waren aktiv. Auch konnte gezeigt werden, dass der Zelluntergang durch Apoptose herbeigeführt wird Diese ermutigenden Ergebnisse belegen, dass ein Platinkomplex nicht zwangsläufig bifunktionell sein muss, um das Zellwachstum effektiv zu hemmen. Weiterhin wurde eine starke Kreuzresistenz zu Cisplatin nur bei ein paar Substanzen beobachtet, manche Verbindungen konnten die Kreuzresistenz sogar vollständig umgehen. Ein paar Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnten beschrieben werden. Zwei cis-trans-Paare der Platin(II)-Komplexe wurden dann für weitergehende Bindungsstudien an DNA ausgewählt. Hierzu wurde die Bindung an Kalbsthymus-DNA untersucht, ebenso wie die Bindung an zelluläre DNA, das Aufwinden von supercoiled DNA, die Veränderung des DNA-Schmelzverhaltens und des Circulardichroismus (CD) von DNA durch Bindung der Platinkomplexe, sowie die Veränderung der Ethidiumbromid-Fluoreszenz durch Hinzugabe der Verbindungen. Es stellte sich heraus, dass die strukturell ähnlichen Verbindungen sehr unterschiedliche Einflüsse auf die DNA haben, was auch in Zusammenhang mit ihrem hydrolytischen Zerfall während der Assays stehen könnte. Da Stabilitätsprobleme bemerkt wurden, wurden die hergestellten Verbindungen mittels HPLC und UV/Vis-Spektroskopie genauer untersucht um ihre Stabilität in wässrigen Medien beurteilen zu können. Es wurde festgestellt, dass die verwendeten Hydrazone in wässrigen Medien zu Benzaldehyden bzw. Acetophenonen und wahrscheinlich zu den korrespondierenden Hydraziden zerfallen. Die Stabilität der Verbindungen könnte starke Einflüsse auf die Ergebnisse der biologischen Testungen haben, sodass dies immer mit berücksichtigt werden sollte, wenn die Ergebnisse interpretiert werden. Es kann nicht aus-geschlossen werden, dass (i) die dargestellten Ergebnisse in Wirklichkeit die Ergebnisse der Zerfallsprodukte sind, und dass (ii) es einen gemeinsamen Grund für den Zerfall und die Auswirkungen im DNA- und Zellmodell gibt. Trotzdem oder auch deswegen handelt es sich um eine vielversprechende Substanzklasse, bei der sich eine nähere Untersuchung hinsichtlich Aufnahme in die Zelle, DNA-Bindung und -Reparatur lohnt, um zu ergründen, ob Resistenzen umgangen werden können. Auch die Zerfallsprodukte sollten hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität untersucht werden. Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, waren N-heterozyklische Carben (NHC)-Au(I)-Komplexe. Sie basierten hauptsächlich ebenfalls wie die Platinverbindungen auf Hydrazonen, auch hier sollte durch die Koordinierung des Metallatoms an den Heterozyklus Imidazol eine Wirkungssteigerung erreicht werden. Die untersuchten Verbindungen zeigten eine starke Inhibition der GPx, der Glutathionreduktase (GR) sowie der TrxR. Eine Selektivität für ein bestimmtes Redoxenzym ist somit mit diesen Verbindungen nicht gegeben, weshalb sie keine guten Kandidaten für weitere Wirkstoffentwicklungen darstellen.
Einleitung: Ausgangspunkt dieser Dissertation war das hepatotoxische Analgetikum Flupirtin, dessen Wirkung auf einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit neuronaler KV7-Kaliumkanäle beruht. Ein Vergleich mit dem ebenfalls hepatotoxischen Arzneistoff Paracetamol warf die Frage auf, ob sich dessen Toxizitäts-Mechanismus, der auf der Bildung des aktiven Metaboliten NAPQI, welcher durch oxidativen Metabolismus entsteht, auf Flupirtin übertragen lässt. Durch Synthese von Flupirtin-Analoga mit veränderten oxidativen Eigenschaften sollten neue Erkenntnisse bezüglich der Oxidierbarkeit, Wirksamkeit und Toxizität des Arzneistoffs erhalten werden. Als zusätzliche Leitstruktur wurde die mit Flupirtin verwandte, wirksame Verbindung ICA-027243 verwendet. Synthesen: Im Fokus der Derivatisierungen standen die N-Atome von Flupirtin, da diese bei der Oxidation eine entscheidende Rolle spielen. So gelang es vor allem durch gezielte Neusynthese, alle drei N-Atome um den Pyridin-Ring unabhängig voneinander einzeln oder in Kombination zu alkylieren. Ausgangspunkt des hierfür benötigten Fluorbenzylamin-Bausteins war der entsprechende Benzaldehyd, welcher durch reduktive Aminierung umgesetzt wurde. Als Pyridin-Baustein wurde 2,6-Dichlorpyridin verwendet, an welchem nach der Nitrierung ein Chloratom durch Ammoniak oder Dimethylamin substituiert werden konnte. Nach der Kondensation beider Bausteine erfolgte die Reduktion der Nitrogruppe mit anschließender Acylierung zum entsprechenden Flupirtin-Derivat. Die Alkylierung des Carbamat-NH folgte gegebenenfalls als letzter Reaktionsschritt. Weitere Verbindungen wurden auf mehr oder weniger abgewandelten Syntheserouten hergestellt. Dabei wurde Flupirtin teilweise in Richtung ICA-027243 abgewandelt und Desamino-Flupirtin-Derivate hergestellt. Variiert wurde unter anderem die Position des Pyridin-N-Atoms und die Methylenamino-Brücke zwischen den aromatischen Ringen wurde teilweise durch eine Amid-Brücke ersetzt. Neben weiteren Derivaten wurden auch bizyklische Flupirtin-Derivate durch Pyrolyse von Flupirtin und Retigabin synthetisiert. Testungen: Getestet wurden die synthetisierten Verbindungen auf ihre Oxidierbarkeit mit Cyclovoltammetrie und einer Peroxidase, auf ihre Wirksamkeit mit einem kommerziellen Thallium-Flux-Assay (durchgeführt von der Firma ChanTest, USA) und auf ihre Toxizität mit einer Mäuseleber-Zelllinie (TAMH) in einem MTT-Assay. Im Rahmen einer Masterarbeit in Kooperation mit der Firma Hoffmann-La Roche in Basel sind einige Derivate weitergehend in vitro auf ihre Toxizität untersucht worden. Das zentrale Ergebnis der Testungen war, dass es eine Korrelation zwischen der Oxidierbarkeit der Verbindungen und ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kaliumkanäle zu erhöhen (Thallium-Flux-Assay), zu geben schien. Hingegen konnte kein entsprechender Zusammenhang zwischen Wirksamkeit der getesteten Verbindungen und ihrer Toxizität im MTT-Assay festgestellt werden.