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Die Anwendung von Niedrigtemperatur-Atmosphärendruckplasmen im Bereich der
Wundversorgung gewinnt stetig an Bedeutung und so steigt das Interesse an den damit
ausgelösten biologischen Vorgängen im Organismus. Es bestehen zahlreiche Studien zum
Einfluss von Plasma auf verschiedene Zellen in Kultur. In der vorliegenden Arbeit wurde die
Wirkung von Plasma auf einen intakten Zellverband, der menschlichen Haut, umfangreich
molekularbiologisch untersucht.
Es wurde der Atmosphärendruck-Plasmajet kINPen® MED verwendet, um ex-vivo
Hautproben von insgesamt 9 Patienten zu behandeln. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden die Hautbiopsien hinsichtlich Differenzierung, Proliferation, Apoptose und DNA 24 Stunden nach Plasmaexposition beurteilt. Weiterhin wurde die Sekretion von Zytokinen mittels ELISA erforscht. Die Dauer der punktuellen Plasmabehandlungen betrug 1 Minute, 3 Minuten und 5 Minuten.
Die größten Limitationen im Studiendesign waren der geringe Probenumfang sowie die
Inhomogenität der Versuchsgruppen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen
behandelter und unbehandelter Hautprobe nachgewiesen werden. Trotz allem wurden
wichtige Tendenzen beobachtet. Die Anwendung des Plasmas scheint das grundsätzliche
Differenzierungsmuster der Epidermis kaum zu beeinflussen. Bei längerer Behandlung bis 5
Minuten stieg die Anzahl basaler apoptotischer Zellen, während es kaum Änderungen im
Auftreten von DNA Doppelstrangbrüchen sowie der Sekretion von IL6 oder IL8 gab. Die
Anzahl proliferativer basaler Zellen stieg bis zu einer Plasmaexposition von 3 Minuten.
Möglicherweise wirken kurzzeitige Plasmabehandlungen proliferationsfördernd auf
Keratinozyten. Dies könnte eine weitere Erklärung für den positiven Einfluss von Plasma auf
die Heilung von Wunden sein. Längere Behandlungen lösen womöglich Apoptosen aus,
jedoch ohne DNA Schäden herbeizuführen.
Um Nebenwirkungen zu minimieren, bedeutet dies für die klinische Praxis, möglichst kurze
Expositionszeiten einzuhalten. Um eine optimale therapeutische Anwendung
unterschiedlicher Plasmaquellen, die sich in Zusammensetzung und Intensität unterscheiden,
zu ermöglichen, sind weitere Studien bezüglich Behandlungszeit und entsprechender
biologischer Wirkung notwendig.
Wichtige Ergebnisse dieser Arbeit sind in die Publikation von Hasse et al. eingeflossen
(Hasse et al. 2016).
Beeinflussung der Wundheilung von respiratorischen Epithelzellen in vitro durch Roxithromycin
(2023)
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Makrolid-Antibiotikums Roxithromycin auf die frühe Phase der postoperativen Wundheilung am Zellkulturmodell untersucht werden. Gründe für den Einsatz des Medikamentes sind abseits der bekannten bakterios-tatischen Wirkung insbesondere die in der Langzeitanwendung beschriebenen immunmodulatorischen Effekte. Es sollte untersucht werden, ob diese bereits in der Akutsituation zu einem Benefit in der Wundheilung im HNO-Bereich führen, da Wundhei-lung hier sekundär verläuft und Wundheilungsstörungen durch Fibrosierungen und Re- Stenosen nicht selten zu einer operativen Korrektur zwingen.
Gewählt wurden S9-Zellen als Modell für respiratorisches Epithel, welche einer standardi-sierten Wundsetzung durch Stanzung unterzogen wurden. Mittels AlamarBlue-Assay wurden zytotoxische Medikamentenkonzentrationen herausgearbeitet und im Folgenden durch Konzentrationsfindungsversuche über 120 Stunden mit kombinierter Wundsetzung bestätigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe beschleunigt Roxithromycin in Konzentrationen von 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml eher die Wundheilung, während Konzentrationen von 80 µg/ml und 160 µg/ml zu einer signifikanten (p ≤ 0.01 bzw. p ≤ 0.05) Hemmung der Wundheilung führen. Die Effekte waren jeweils über die ganze Beobachtungsdauer und im Ausmaß zunehmend nachweisbar. Roxithromycin in einer Konzentration von 160 μg/ml konnte die Zellproliferation 96 und 120 h nach Wundsetzung so stark hemmen, dass die residuale Wundfläche sogar anstieg.
In einem Validierungsansatz konnte zudem herausgearbeitet werden, dass die Wundsetzung konsequenterweise von nur einer/m Experimentierenden erfolgen sollte, um ein re-produzierbares Ergebnis zu erhalten, während sich kein Unterschied in der Auswertung der Wundflächen durch verschiedene Personen zeigte.
Zum Verständnis der molekularbiologischen Effekte des Medikamentes auf Epithelzellen wurden unter Berücksichtigung der in der Literatur beschriebenen maximalen Serumkonzentration bei systemischer Anwendung von Roxithromycin (7,28 ± 1,85 mg/l), fehlenden Hinweisen auf einen zytotoxischen Effekt sowie tendenziell beschleunigter Wundheilung nachfolgend 2D–DIGE-Experimente gekoppelt mit massenspektrometrischen Proteinidentifikationen für die Roxithromycinkonzentration von 10 µg/ml durchgeführt. Es ergaben sich Hinweise auf eine Förderung des Zellwachstums durch Beeinflussung des Polyaminmetabolismus über Induktion der Spermidinsynthase und darüber hinaus Spermidin-abhängige Modifikation des Translationsfaktors EIF5A. Des Weiteren wurde eine Nrf2-assoziierte Antwort auf oxidativen Streß bereits bei niedriger Roxithromycin- Konzentration von 10 µg/ml als protektiver Faktor ermittelt. Durch quantitative LC-MS/MS-Analysen wurde dieser Effekt ebenso für Konzentrationen von 20 und 40 µg/ml Roxithromycin bestätigt. Der weitläufig dokumentierte konzentrationsabhängige zytotoxische Effekt des Medikamentes bei höheren Konzentrationen konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Während apoptoseauslösende Proteine in der Konzentration von 10 µg/ml nicht nachgewiesen werden konnten, gelang in höheren Roxithromycin-Konzentrationen eine Darstellung von regulierten Proteinen des intrinsischen und extrinsischen Apoptoseweges, bis hin zur bereits mikroskopisch erfassbaren Zelldepletion bei Konzentrationen von 80 und 160 µg/ml. Insbesondere bei der Konzentration von 20 µg/ml fanden sich Hinweie, dass eine Regulation über den ERK1/2-Pathway stattfindet, welcher umfangreiche Funktionen wie Zytokinfreisetzung, Zellmigration, Zellproliferation und auch Zelltod moderiert.
Die Behandlung mit Roxithromycin führt in niedriger Konzentration (10 µg/ml) tendenziell zu einer beschleunigten Wundheilung ohne Auftreten zytotoxischer Effekte. Grundlage könnte die Aktivierung von Translationsfaktoren (EIF5A) und Protektion vor den Schäden durch oxidativen Streß sein. Damit stellt diese Therapie eine Option in der frühen postoperativen Situation im HNO-Bereich dar, welche allerdings weiterer Untersuchung z. B. durch Testung an Fibroblasten bedarf. Attraktiver erscheint das Outcome bei einer Medikamentenkonzentration von 20 µg/ml, da die epitheliale Wundheilung signifikant schneller abläuft und somit zu einem schnelleren Wundverschluß führt. Die molekularbiologischen Hinweise auf Induktion der Apoptose werden bei dieser Konzentration offenbar noch durch protektive Mechanismen über Beeinflussung der Zellmigration, Neutralisierung von Schäden durch oxidativen Streß und Eingriff in den ERK-Pathway aufgefangen, was bei höheren Roxithromycinkonzentrationen nicht mehr gelingt und in einer Zelldepletion mündet. Daher bietet sich für die Konzentration von 20 µg/ml insbesondere die topische Applikation als Salbenstrang oder Nasenspray an, um die positiven Effekte zu nutzen und die Limitation durch vorheriges Erreichen der maximalen Serumkonzentration zu umgehen. Empfehlenswert ist die Untersuchung des Medikamentes in weiteren Zell-reihen und in vivo da Wundheilung ein multimodaler Prozeß ist. Eine topische Applikation von ggf. höheren lokalen Konzentrationen scheint hier keinen zusätzlichen Nutzen darzustellen.
Die therapeutische Anwendung kalter Atmosphärendruckplasmen (CAP) ist der zentrale Schwerpunkt des in einer hoch interdisziplinären Schnittstelle zwischen Natur- und Lebenswissenschaften angesiedelten Forschungsgebiets der Plasmamedizin. Trotz eines auf Basis grundlagentechnologischer und anwendungsorientierter Forschung zunehmenden Erkenntnisgewinns, wirft die Plasmamedizin sowohl bezüglich spezifischer Wirkeffekte als auch Risikopotentiale nach wie vor verschiedene Fragestellungen auf und zeigt, vor dem Hintergrund einer nicht ausschließlich auf Grundlage von in vitro Daten zu prognostizierenden unbedenklichen in vivo Anwendbarkeit, vor allem ein Defizit an klinischen Daten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte erstmals eine systematische Langzeituntersuchung eines unter standardisierten Bedingungen mittels kaltem atmosphärischen Plasma behandelten Probandenkollektivs. Die 5 Probanden waren 5 Jahre zuvor Teil einer Untersuchung zum CAP-Einfluss auf die Wundheilung CO2-Laser-induzierter Hautläsionen, im Zuge derer jeweils 3 der 4 Läsionen mit unterschiedlichen Applikationsschemata (1 x 10 s; 1 x 30 s; 3 x 10 s) mittels des kINPen® MED behandelt wurden.
Neben einer klinischen Evaluation wurde die Nachuntersuchung durch aufwendige, bildgebende Diagnostika wie Dermatoskopie, konfokale Laserscanmikroskopie (KLSM) und Hyperspectral Imaging (HSI) assistiert sowie fragebogengestützt hinsichtlich plasmavermittelter Hautveränderungen (POSAS) und einer möglichen therapieassoziierten Beeinträchtigung der Lebensqualität (DLQI) ergänzt.
Im Ergebnis konnten weder klinisch-makroskopisch, dermatoskopisch, noch mittels KLSM oder HSI malignitätssuspekte Veränderungen, Anzeichen chronischer Entzündungsreaktionen, pathologische Modifikationen der Zellarchitektur und Zellmorphologie oder mikrozirkulatorische Pathologien in den plasmabehandelten Arealen, gegenüber dem umliegenden, nicht mittels Kaltplasma therapierten Gewebe, belegt werden.
Die in dieser Komplexität im Rahmen einer Langzeituntersuchung am Menschen bisher einzigarten Daten tragen, insbesondere auf dem hochaktuellen Diskussionsfeld plasmaassoziierter Risikopotentiale, zu einem weiteren Erkenntnisgewinn bei. Zur Sicherung indikationsspezifischer Dosisempfehlungen und Behandlungsfenster bedarf es, aufgrund verschiedener allgemeiner und spezieller Limitationen, jedoch weiterer klinischer Studien.
Es wird allgemein angenommen, dass nicht nur das Vorhandensein des Diabetes mellitus, sondern auch die Qualität der Therapie zur Optimierung der diabetischen Stoffwechsellage einen Einfluss auf Wundheilungsprozesse hat.
An 40 spontan-diabetischen B(io)B(reeding)/O(ttawa)K(arlsburg) sowie 20 nicht-diabetischen BB/OK Ratten wurden systematische Trommelfellperforationen vorgenommen. Der Verlauf der Trommelfellwundheilung wurde zu definierten Zeitpunkten fotodokumentiert und histologische Untersuchungen der Wundheilungsprozesse erfolgten zum Versuchsende.
In der Gruppe der normoglykämischen Versuchstiere konnte eine mittlere Dauer bis zum Verschluss der Perforation von 9,8 Tagen festgestellt werden. Für die hinsichtlich des Diabetesstoffwechsels gut kompensierten Ratten zeigte sich eine mittlere Dauer bis zum Verschluss der Trommelfellperforationen von 11,1 Tagen (p = 0,03). Bei den Tieren mit schlecht kompensierter Stoffwechselsituation war eine mittlere Dauer von 11,2 Tagen bis zum vollständigen Verschluss der Trommelfellperforationen zu verzeichnen (p = 0,04). Die Wundheilung am Trommelfell diabetischer Ratten ist im Vergleich zu stoffwechselgesunden Ratten statistisch signifikant verzögert. Es konnten hingegen keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Vergleich des Verschlusses der Trommelfellperforationen zwischen den gut und schlecht kompensierten Diabetes-Ratten nachgewiesen werden (p = 0,77). Die Qualität der Stoffwechselkontrolle hat somit keinen spezifischen Einfluss auf die Wundheilung, sondern alleinig das Vorliegen des Diabetes mellitus verzögert diese.
Für Menschen mit Diabetes mellitus und gleichzeitigen Trommelfellperforationen lassen diese Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass unabhängig von der Blutzuckerkontrolle eine verzögerte Wundheilung, z. B. nach einer Tympanoplastik, resultieren kann.
Mit dieser experimentellen, intraindividuellen, prospektiven, kontrollierten, randomisierten, verblindet evaluierten Studie wurde gemäß dem zugrundeliegenden Prüfplan der Universität Greifswald die Wundheilung unter ästhetischen Gesichtspunkten bei der Nachbehandlung mit der Betulin-Emulsion Imlan® Creme Pur untersucht im Vergleich mit einer Standardtherapie, der Behandlung mit dem Hydrokolloidverband Comfeel® Plus und einer unbehandelten Kontrolle. Bei dieser Studie wurden 50 volljährigen, gesunden Probanden unterschiedlichen Alters, Geschlechts und Hauttyps mit einem CO2-Laser je drei Hautläsionen auf der Innenseite eines Unterarms zugefügt. Dabei entsprach die Einstellung des Lasers den bei ästhetischen Eingriffen im Gesicht verwendeten Einstellungen. Anschließend wurde jeweils eine Laserabrasion mit dem Prüfprodukt Imlan® Creme Pur und jeweils eine mit Comfeel® Plus behandelt. Die dritte blieb als Kontrolle unbehandelt. Die Abheilung wurde über vier Wochen in der Reepithelialisierung beobachtet und dokumentiert. Die Bewertung der Wundheilung unter ästhetischen Gesichtspunkten wurde anhand von Fotografien in einem Box-Test durch sechs neutrale Betrachter vorgenommen. Als Maßstab für die Bewertung der Ästhetik dienten die Textur und die Farbe der unbeschadeten Haut. Die Auswertung zeigt, dass Imlan® Creme Pur im Vergleich mit dem Hydrokolloidverband und der unbehandelten Kontrolle die besten ästhetischen Ergebnisse erzielte: Bei dem Kriterium "Farbe" erhielten die mit Imlan® Creme Pur behandelten Hautabtragungen mit 57% die Mehrheit der Zustimmungen. Bei dem Kriterium "Textur" bekam die mit Imlan® Creme Pur behandelten Hautabtragungen erneut mit 58,47% die meisten positiven Beurteilungen. Die Anwendung von Imlan® Creme Pur kann nach dieser Studie in der Nachbehandlung eines ästhetischen Lasereingriffs empfohlen werden.
Einleitung
Die Heilung einer Wunde unterscheidet sich in der Narbenbildung, dem Einfluss von Risikofaktoren, dem funktionellen und ästhetischen Ergebnis und in der Wundheilungsdauer. Eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien beschäftigt sich mit Möglichkeiten, die Dauer der Wundheilung zu verkürzen. Dabei fällt auf, dass bisher keine klinischen Daten zur Wundheilungsdauer existieren, insbesondere keine, die die Dauer der Re-Epithelialisierung ohne spezifische Wundbehandlung wiedergeben. Ziel dieser Studie ist daher die Ermittlung der Re-Epithelialisierungszeit einer klinischen Wunde in Tagen und wie diese durch individuelle Faktoren beeinflusst wird. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse einer klinischen Studie von Spalthautentnahmestellen hinsichtlich der durchschnittlichen Dauer des epithelialen Wundverschlusses in Abhängigkeit verschiedener individueller Einflussfaktoren.
Material und Methoden
Die verwendeten Daten entstammen zweier multizentrischer Phase-III-Studien zur Untersuchung der klinischen Wirksamkeit und Sicherheit eines topischen BetulinGels bezüglich der Heilung von Spalthautentnahmestellen (EudraCT no. 2012-003390-26, EudraCT no. 2012-000777-23). Die Spalthautentnahmestellen wurden halbiert und nach Randomisierung eine Hälfte mit Betulin Gel behandelt und die andere Hälfte als Kontrollseite mit einem Standardwundverband verschlossen. Gegenstand dieser Studie waren ausschließlich die Kontrollseiten. Die Beurteilung der Wundheilung erfolgte mittels Auswertung von Fotos durch drei unabhängige und verblindete Wundexperten via eines Online-Tools. Das Studienprotokoll schloss 198 Patienten ein. Die Beobachtung endete nach Erreichen einer Re-Epithelialisierung von über 95% der Wundfläche oder spätestens 28 Tagen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kaplan-Meier-Überlebenszeitanalysen mit einem Konfidenzintervall von 95%. Dabei wurde die kumulative Ereignisrate für verschiedene Einflussfaktoren aufgetragen und mittels Logrank Test statistisch analysiert.
Ergebnisse
Die Re-Epithelialisierung der Wunden dauerte mindestens sieben Tage. Die schnellsten 25% der Patienten („fast healers“) zeigten einen epithelialen Wundverschluss innerhalb von elf Tagen, während die Re-Epithelialisierung im Median 14 Tage andauerte und die langsamsten 25% („slow healers“) der Studienpopulation 18 Tage benötigten. Patienten unter 40 Jahren zeigten einen signifikant schnelleren epithelialen Wundverschluss von zwölf Tagen während die Re-Epithelialisierung bei Patienten über 60 Jahren 18 Tage dauerte (p=0). Gebärfähigkeit reduziert die Dauer signifikant um vier Tage (p=0,002), während Krebserkrankungen und begleitende Glucocorticoid-Therapien die oberflächliche Wundheilungsdauer um zwölf beziehungsweise zehn Tage verlängern (p=0).
Zusammenfassung
Eine oberflächliche, artifiziell durch eine Spalthautentnahme entstandene Wunde zeigt ohne gezielte Wundbehandlung einen Schluss der Epitheldecke nach frühestens sieben Tagen, in der Gruppe der „fast healers“ nach elf Tagen, im Median nach 14 Tagen und benötigt 18 Tage in der Gruppe der „slow healers“. Die Wundheilung wird um vier bis zwölf Tage verlängert durch ein Patientenalter über 60 Jahren, eine maligne Grunderkrankung und eine Begleitmedikation mit Glucocorticoiden. Die Wundheilung wird durch ein Patientenalter unter 40 Jahren und die Gebärfähigkeit von Frauen um zwei bis vier Tage beschleunigt. Diese ergab die Analyse von 198 Patientendaten aus 32 europäischen Krankenhäusern basierend auf einer verblindeten Beurteilung standardisierter fotografischer Wunddokumentation.
In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal in der aktuellen Literatur das Proteom von einer humanen und einer bakteriellen Zellreihe nach Behandlung mit sogenanntem tissue-tolerable Plasma hypothesenfrei analysiert. Mit diesem neuartigen Ansatz konnten die vorliegenden aktuellen Literaturdaten größtenteils bestätigt und erheblich erweitert werden. So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit TTP dosisabhängig zu einer signifikant vermehrten Proliferation der humanen respiratorischen S9-Zellen führt. Als therapeutisch vielversprechendste Dosis wurde dabei, wie auch schon in der Literatur vermutet, die 120s-Behandlung identifiziert, wobei auch kleinere Dosen eine vorteilhafte Tendenz aufzeigten. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien dringend erforderlich, um insbesondere die Langzeit- und Nebenwirkungen von TTP aufzuzeigen. Dass die Behandlung auch Risiken bergen könnte, zeigen die auf Proteinebene erhaltenen Ergebnisse, wo mit steigenden TTP-Dosen auch die Veränderungen der Expression von Proteinen der Funktionskomplexe DNA-Schäden und Apoptosefaktoren zunehmen. Unklar ist bislang, wie sich der Verlauf über den 120h-Zeitraum hinaus darstellt und mit welcher Häufig- und Regelmäßigkeit die Behandlung in der Klinik erfolgen müsste, um einen nachhaltigen, therapeutisch relevanten Effekt zu erzielen. Zum Nachweis der Praxistauglichkeit der Plasmatherapie sind weitere Studien erforderlich, um eben diese Fragen zu beantworten und auszuschließen, dass die negativen Auswirkungen bedingt bspw. durch verstärkte Apoptoseinduktion eventuell zu einem späteren Zeitpunkt die positiven Effekte der TTP-Behandlung überlagern oder antagonisieren. Notwendig sind auch klinische Studien in der Hals-Nasen-Ohrenkunde, die das Wachstumsverhalten der Zellen im Allgemeinen, aber auch im Speziellen der respiratorischen Zellen in vivo zeigen. Die in vitro gefundenen Resultate geben maximal einen kleinen Fingerzeig auf das, was in einem komplexen, wechselwirkenden Organismus zu erwarten ist. Bislang sind in diesem Bereich noch keine größeren Studien erfolgt.
Gezeigt werden konnte in der Arbeit auch, dass die Staphylokokken deutlich anfälliger für TTP sind als die humanen Zellen. Hier konnte das in vitro Wachstum eingeschränkt werden, was den Ergebnissen der aktuellen Literatur entspricht. Allerdings gilt hier ebenfalls, das in vitro erzielte Ergebnisse nicht ohne Weiteres auf die Klinik übertragen werden können. Auch wenn es bereits einige klinische Studien zur antimikrobiellen Wirkung von Plasma gibt, steht die Forschung noch am An-fang. Gezeigt werden muss im Verlauf noch, dass TTP auch im Biosystem Mensch die in-vitro gezeigten Effekte auslöst. Bekannt ist außerdem wie oben beschrieben, dass Staphylokokkus aureus ohnehin zu den sensibleren Keimen gehört. Eine Analyse des Verhaltens von möglicherweise resistenteren Bakterien ist nötig. Auch zu klären bleibt, wie sich Pilze unter der Behandlung verhalten und ob nicht nach Ausschalten der bakteriellen Flora möglicherweise ein Selektionsvorteil entsteht, der zu vermehrten Pilzwundinfektionen führt.
Die Ergebnisse der Arbeit konnten die Entstehung von oxidativen Stress als wichtigsten Mediator der TTP-Wirkung aufzeigen. Diese Erkenntnis deckt sich mit der aktuellen Studienlage und konnte aufgrund der umfassenden Proteomanalyse beider Zellreihen gewonnen werden. Nichtsdestotrotz müssen weitere genaue Auswertungen erfolgen. Aufgrund der sehr großen Datenmenge erfolgte im Verlauf der Analyse eine ausgiebige Ordnungs- und Filterarbeit. Trotz großer Sorgfalt ist es kaum möglich gewesen, alle Informationen zu berücksichtigen und in einer übersichtlichen Form zu erhalten. Daher sind die in der Arbeit dargestellten Ergebnissen lediglich ein kleiner Ausschnitt der offensichtlichsten Erkenntnisse. Es ist außerdem zu bedenken, dass aufgrund der technischen Limitation lediglich 1220 Proteine identifiziert werden konnten, bei aktuell 30.057 bekannten menschli-chen Proteinen [99]. Betrachtet wurden letztlich also lediglich 4% des Proteoms. Weitere globale Analysen sind im Verlauf sinnvoll und nötig, um die gewonnenen Resultate zu stärken oder zu hinterfragen .
Insgesamt präsentiert sich TTP als ambitionierte Therapiealternative, die große Möglichkeiten in der Medizin der Zukunft verspricht. Insbesondere in der HNO birgt es vielversprechende Möglichkeiten bei bislang problematischen Erkrankungen. Die Forschung ist allerdings gefordert, weitere umfassende Studien durchzuführen um die Sicherheit und Praktikabilität zu gewährleisten.
In dieser Arbeit gilt es die „Beeinflussung der Trommelfellwundheilung der Ratte durch Blockade des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors“ (nach akuter traumatischer Trommelfellperforation) genauer zu betrachten. Die Arbeitshypothese dieser Ausarbeitung lautet, ob Erlotinib (ein kleinmolekularer Tyrosinkinase-Inhibitor), systemisch in unterschiedlich hohen Dosierungen appliziert, in der Lage ist, eine chronische Trommelfellperforation zu generieren. Erlotinib ist ein sehr potenter und spezifischer Inhibitor des EGFR, wobei langfristiges oder repetitives Einwirken jedoch eine Grundvoraussetzung für die Wirkungsentfaltung ist. Eine chronische Trommelfellperforation ließ sich in dieser Versuchsreihe nicht erwirken. Es kam zu einer Verzögerung des Wundheilungsprozesses bei Verabreichung von Erlotinib, ohne dass der Wundheilungsprozess jedoch vollständig gestoppt werden konnte. Die hervorgerufene Verzögerung ist jedoch mit hohen Nebenwirkungen behaftet (Diarrhoe, Gewichtsverlust sowie vorzeitiger Exitus). Die Arbeitshypothese ist damit als nicht erfüllt anzusehen. Im Rahmen dieser Versuchsreihe wurde hingegen erneut die Tatsache bestätigt, dass der Tyrosinkinase-Inhibitor an sich keine histologischen Veränderungen an EGF-haltigen Geweben bewirkt. Veränderungen histologischer Art fanden erst während des Wundheilungsprozesses nach akuter traumatischer Trommelfellperforation statt. Die Studie wirft neue Fragen bezüglich der Verträglichkeit von Erlotinib im Rahmen systemischer Applikation auf. In früheren Studien bestand an der guten Verträglichkeit dieses Medikamentes nahezu kein Zweifel. Eine nähere Erforschung diesbezüglich und eventuell die Entwicklung geeigneter Freisetzungssysteme, durch welche eine lokale Therapieform ermöglicht würde, gelten daher als entscheidende, noch zu lösende Problemstellung bei der Anwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren.
Die EPOS-Leitlinien empfehlen bei chronischer Sinusitis mit poyposis nasi die präoperative Gabe von Doxycyclin. Ein einheitlicher Standard für die postoperative Therapie fehlt. Es wurde daher der Frage nachgegangen, wie Doxycyclin und Kamillosan sich in einem in-vitro Wundmodell auf die Wundheilung auswirken. Drei Wundmodelle wurden verglichen und anschließend eine in-vitro Medikamententestung durchgeführt. Es handelt sich hierbei um die erste in-vitro Studie zur Wundheilung unter Einfluss von Doxycyclin und Kamillosan bei Epithelzellen und Fibroblasten. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige wachstumshemmende Wirkung auf Epithelzellen und Fibroblasten durch Kamillosan und ein wachstumsfördernder Trend auf Fibroblasten durch Doxycyclin. Das Wachstum von Epithelzellen blieb unter Einfluss von Dxycyclin unbeeinflusst.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has drawn more and more attention to the field of wound healing research during the last two decades. It is characterized by a unique composition, which includes amongst others free radicals, ions and electrons. Furthermore, non-thermal plasma exhibits temperatures that are below those inducing thermal cell damage. Next to its well-established anti-bacterial properties, plasma can have lethal as well as stimulating effects on mammalian cells. Therefore, the medical application of non-thermal plasma on chronic wounds seems to be a promising tool to enable healing processes. However, less is known about the plasma-mediated induction of intracellular signaling pathways in human immune cells, which play a leading part in the process of wound recovery and removal of pathogens. Therefore, this thesis examined the cellular effects of a non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on human immune cells using the argon plasma jet kinpen 09. Here, the CD4+ T helper cell line Jurkat, the monocyte cell line THP-1 as well as the corresponding primary cells were investigated. First, cell survival and apoptosis induction was assessed in response to non-thermal plasma treatment by growth curves and flow cytometric assays. On the one hand it could be shown that primary cells are more susceptible to plasma treatment than the respective cell lines. On the other hand, monocytes responded less sensitive to plasma exposure than lymphocytes. Furthermore, this thesis outlined the impact of non-thermal plasma treatment on the gene expression level of immune cells. Therefore, DNA microarray analysis was performed with the cell lines Jurkat and THP-1. It became obvious that plasma exposure modulated the expression of several genes in both cell types. Differential expression of distinct target genes was further validated by quantitative PCR in the immune cell lines. Here, elevated gene expression levels of JUN and FOS in Jurkat cells and increased transcription of JUND in THP-1 cells in response to plasma treatment were made visible. JUN, FOS and JUND are components of the transcription factor AP-1, which is involved amongst others in gene expression of IL-8 and HMOX-1. Consequently, transcriptional induction of the inflammatory cytokine IL-8 as well as the enzymes HMOX-1 and GSR was detected in plasma-treated THP-1 cells. In addition, alterations in the protein activation levels were analyzed in plasma-treated Jurkat, THP-1 cells and primary monocytes. Since some of the identified target genes are known to be associated with the MAPK pathways, the regulation of these cascades was further investigated by western blot analysis. In all investigated cell types the pro-proliferative signaling molecules ERK 1/2 and MEK 1/2 as well as the pro-apoptotic signaling proteins p38 MAPK and JNK 1/2 were activated in a plasma treatment time dependent manner. In contrast to Jurkat and primary monocytes, the anti-apoptotic HSP27 was only induced in THP-1 cells in response to plasma exposure. Moreover, modulation of cytokine production and secretion was examined in the different immune cell types and co-cultured THP-1 and HaCaT keratinocytes by ELISA or flow cytometry. While Jurkat cells showed no plasma-mediated regulation of cytokine expression, THP-1 cells revealed an increased IL-8 secretion after long plasma time duration (360 s). Additionally, the intracellular expression levels of IL-6 and IL-8 were modulated in primary monocytes by plasma exposure. While short plasma treatment caused no alteration of the number of cells expressing IL-8 an up-regulation of the intracellular IL-6 level occurred after 30 s of plasma treatment. Long plasma treatment times resulted in a significant decrease of the intracellular IL-8 and IL-6 production levels. Furthermore, co-cultured THP-1 and HaCaT cells as well as mono-cultured THP-1 and HaCaT cells were examined regarding their cytokine secretion profile. Here, cells treated with plasma (180 s) as well as LPS and plasma (180 s and LPS) were compared with untreated cells. IL-6, IL-8 and GM-CSF secretion was induced by both plasma and plasma combined with LPS treatment in mono-cultivated HaCaT cells and co-cultured cells. Though, the highest cytokine secretion levels were reached in the plasma and LPS exposed co-culture. In contrast, mono-cultivated THP-1 cells only showed an increased secretion of IL-6, IL-8 and TNFa after incubation with plasma together with LPS exposed medium. In conclusion, this study revealed for the first time the non-thermal plasma-modulated expression of numerous genes and cytokines and the activation state of various signaling cascades in human immune cells. Thus, it contributes to gain a better understanding of the immune-modulatory impacts of plasma that might promote the wound healing process.
Der Einsatz von atmosphärischem Niedertemperaturplasma zur Behandlung chronischer Wunden stellt eine erfolgversprechende, in Entwicklung befindliche Therapieoption dar. Dabei wird von der Hypothese ausgegangen, dass chronische Wunden durch die Stimulation mittels Plasma aktiviert werden können, wodurch die über die Stufe der resorptiven Inflammation die physiologische Heilung wieder in Gang gesetzt werden kann. Daher wurde zur Identifizierung des Reiz- und Inflammationspotential des Plasmas und zur Ableitung geeigneter Behandlungsparameter Plasma im HET-CAM geprüft. Zunächst wurden mit einem Atmosphärendruck Plasma-Jet unter Verwendung von Argongas und einer Dielectric-Barrier Discharge (DBD)-Plasmaquelle die Reizwirkungen an der CAM durch mäanderförmige Plasmabehandlung und punktuelle Anwendung getestet. Dabei wurden neben mäanderförmigen und punktuellen Applikationsmustern unterschiedliche Anwendungsfrequenzen und damit unterschiedliche Plasmadosen untersucht. Die Temperatur des Plasmas nahm v. a. bei längeren Behandlungszeiten Einfluss und führte zu einer Wirkungsverstärkung bis hin zu thermischen Schädigungen. Der Gasfluss erwies sich als limitierend für das geprüfte Modell. Der gepulste Modus war bei mäanderförmiger Anwendung am verträglichsten. Die Überprüfung auf Reversibilität der Effekte ergab, dass geringe Reizungen vollständig reversibel waren, währen schwere Reizungen zu nicht reversiblen Koagulationen führten. Aufgrund der unbefriedigenden Ergebnisse mit sehr schneller Bildung von Thrombosen, geringem Arbeitsabstand und fehlender Potentialfreiheit wurde die DBD-Elektrode von der weiteren Untersuchung ausgenommen und der kINPen09 als Weiterentwicklung des Plasma-Jets mit geringerer Plasmatemperatur auf inflammatorische Wirkung bei punktueller Anwendung mit verschiedenen Expositionszeiten im kontinuierlichen Modus und im gepulsten Modus mit Argon als Trägergas, sowie im kontinuierlichen Modus unter Zusatz von 0,1 % Sauerstoff, getestet. In dieser Testreihe war ebenfalls das gepulste Plasma am verträglichsten, das mit Sauerstoff angereicherte Plasma führte zu den schwersten Inflammationen. Alle Reaktionen wurden durch die kombinierte Anwendung mit Hydrocortison deutlich abgeschwächt. Mit der Inflammationsinduktion konnten Gewebeprozesse in Form von Kontraktion, Koagulation und inflammationsassoziierter Angiogenese auf der CAM erzeugt werden, die für Aktivierung der sekundären Wundheilung relevant sein dürften. Ableitend aus den Untersuchungen kann für die Anwendung an chronischen Wunden eine Behandlungszeit von maximal 5 s pro qcm Wundfläche für den kontinuierlichen Modus empfohlen werden. Dabei sollte wegen der besseren Verträglichkeit der mäanderförmigen Behandlung gegenüber der punktuellen Anwendung der Vorzug gegeben werden. Unter Berücksichtigung der vorliegenden Untersuchung zur Reiz- und Inflammationswirkung von Plasma im HET-CAM und weiteren Prüfungen zur Wirksamkeit und Verträglichkeit in vivo und in vitro erweist sich die Plasmaapplikation mit dem kINPen09 als vielversprechende Option zur Behandlung chronischer Wunden.
Non-healing wounds pose a major burden to patients and health care systems alike. These wounds are chronically stuck in the inflammatory phase of the healing process without transitioning to the proliferative phase. They are also characterized by the excessive presence of leukocytes which are assumed to provoke the persistent inflammation observed in pathological wound healing. Recent studies suggested a beneficial role of cold physical plasma in the treatment of chronic wounds. Hence, it was the central question, whether exposure to cold physical plasma would affect the viability and/or function of human leukocytes. Cold plasma displays various properties of which the generation of reactive molecules, such as reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS), where found to be central in mediating redox changes in leukocytes. Oxidative stress was present especially in lymphocytes that readily underwent apoptosis after exposure to plasma. This was largely a direct consequence of plasma-generated hydrogen peroxide but not superoxide or RNS. Amount of apoptosis was comparable among several lymphocyte subpopulations, with the wound healing-relevant γδ T cells being least affected. Lymphocyte apoptosis was accompanied by mitochondrial membrane depolarization, caspase 3 activation, DNA fragmentation, and phosphatidylserine exposure. These results are in line with previous characterizations of the intrinsic apoptotic pathway in redox biology, and suggest that plasma-induced apoptosis was not mediated by alternative molecular mechanisms. An important immune response mechanism, the proliferation of lymphocytes, was not interrupted in plasma-treated but non-apoptotic cells. In wounds, a central role of leukocytes is to orchestrate the healing response via the release of small communication molecules called cytokines. Non-healing wounds are associated with elevated amounts of pro-inflammatory IL-1β, IL-6, and TNFα, and plasma-treatment of leukocytes strongly decreased their concentrations. At the same time, the expression of anti inflammatory cytokines (IL-10, TGFβ) was markedly increased. The pro inflammatory chemokine IL-8 was the only molecule to be significantly increased in supernatants of plasma-treated cells. IL-8 is the major chemo-attractant for neutrophil granulocytes. Neutrophils are frequently associated with non-healing wounds. These professional phagocytes are the first to migrate to the site of injury where they inactivate invading pathogens by various mechanisms. Importantly, highly relevant effector functions remained mostly unaffected by plasma treatment: the phagocytosis of bacteria, the oxidative burst, and the intracellular killing of microbes. Of note, plasma induced a strong induction of neutrophil extracellular traps (NETs). Decorated with antimicrobial proteins, NETs are web-like chromatin extrusions that entrap pathogens. These results have several implications for wound healing. Plasma-treated neutrophils were still capable of eradicating bacteria, which are frequently associated with non-healing wounds. In addition, plasma-induced NETs could aid in wound healing by providing an antibacterial scaffold to safeguard against further dissemination of microorganisms. Chronic wounds display a state of sustained inflammation and plasma induced apoptosis but not necrosis in lymphocytes. This was an important finding as necrosis, the involuntary cell death, is associated with the release of intracellular content, enhancing inflammation. By contrast, apoptosis dampens it as dead cells are cleared by macrophages inducing anti inflammatory responses. Further, the cytokine signature of plasma-treated leukocytes was largely non inflammatory, which could further decrease inflammation in wounds. Altogether, this work provided first insight with regard to effects and mechanisms of cold physical plasma treatment of wound-relevant leukocytes. Generally, these cells were affected by a plasma mediated modulation of their redox state. Future studies should include the possibility of redox modulation into their experimental approach to further elucidate the role of ROS/RNS in inflammation and possibly to improve existing wound healing therapies.
There is a growing interest in the application of non-thermal atmospheric pressure plasma for the treatment of wounds. Due to the generation of various ROS and RNS, UV radiation and electric fields plasma is a very promising tool which can stimulate skin and immune cells. However, not much is known about the mammalian cell responses after plasma treatments on a molecular level. The present work focusses on the impact of plasma on cell signaling in the human keratinocyte cell line HaCaT by using the methods DNA microarray, qPCR, ELISA and flow cytometry. Here, cell signaling mediators such as cytokines and growth factors which could promote wound healing by enhancing angiogenesis, reepithelization, migration and proliferation were of major interest. Additionally, the crosstalk between keratinocytes and monocytes was studied using a co-culture. For the first time extensive investigations on the impact of plasma on cell signaling in human keratinocytes were conducted. The most prominent cytokines and growth factors which were regulated by plasma at gene and protein level were VEGF-A, GM-CSF, HB-EGF, IL-8, and IL-6. The latter was not activated due to the JAK/STAT-pathway but probably by a combined activation of MAPK- and PI3K/Akt-pathways. By the use of conditioned medium it was found out that ROS and RNS generated directly after plasma treatment induced larger effects on cell signaling in keratinocytes than the subsequently secreted growth factors and cytokines. Furthermore, monocytes and keratinocytes hardly altered their secretion profiles in co-culture. From these results it is deduced that the plasma generated reactive species are the main actors during cell signaling. In order to differentiate the impact of ROS and RNS on the cellular response the ambience of the plasma effluent was controlled, varying the ambient gas composition from pure nitrogen to pure oxygen. Thereby a first step towards the attribution of the cellular response to specific plasma generated reactive species was achieved. While IL-6 expression correlated with ROS generated by the plasma source, the cell signaling mediators VEGF-A, GM-CSF and HB-EGF were significantly changed by RONS. Above all hydrogen peroxide was found to play a dominant role for observed cell responses. In summary, plasma activates wound healing related cell signaling mediators as cytokines and growth factors in keratinocytes. It was also shown that the generated reactive species mainly induced cell signaling. For the first time cell responses can be correlated to ROS and RONS in plasma treated cells. These results underline the potential of non-thermal atmospheric pressure plasma sources for their applications in wound treatment.