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Microbial infections can be either caused by a single species or complex multi-species consortia. One of the most prominent opportunistic human pathogens leading to mono- or mixed-species infections is the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Understanding the molecular basis of its adaptation to infection-related stresses is an essential prerequisite for the prevention and treatment of P. aeruginosa infections. We therefore employed state-of-the-art proteomics approaches to elucidate the molecular adaptation mechanisms of P. aeruginosa to infection-related conditions. Moreover, structure, function and interaction of complex microbial consortia containing P. aeruginosa and causing catheter-associated urinary tract infections were investigated by metaproteomics analyses. Our investigations revealed that the adaptation of P. aeruginosa during infection is either based on gene expression changes caused by environmental signal integration or by gene mutations leading to a selective advantage in a particular host environment. In study I, investigating the proteome response of P. aeruginosa biofilms to the clinical relevant antibiotic ciprofloxacin, global changes in the protein profile were observed. Ciprofloxacin induced the expression of proteins involved in the Lex-induced SOS-response, drug efflux pumps and gene products of the ciprofloxacin-responsive prophage cluster and repressed the expression of porins and DNA-binding proteins. In study II the transcriptome and proteome of two clonal P. aeruginosa lineages during long-term colonization of cystic fibrosis (CF) patient’s lungs were analyzed. Point mutations in global regulator genes, i.e. retS, gacS, and gacA, were identified by genomic sequencing. Inactivation of RetS, found two years after the initial colonization, induced the expression of genes involved in chronic infections and coding for the type 6-secretion system (T6SS). Additional mutations in the GacS/GacA two-component regulatory system (TCS) were found to repress the expression of T6SS proteins and to induce the expression of proteins belonging to the type 3-secretion system (T3SS). In study III we elucidated the niche-specific adaptation of P. aeruginosa isolates from different infection sites by investigating their protein expression patterns and glucose metabolic fluxes. We could show that isolates from the urinary tract express a higher amount of proteins involved in the acquisition of micronutrients (i.e. iron) and carbohydrates compared to isolates from the CF lung. In study IV 16S rDNA sequencing and metaproteomics were employed to demonstrate that the investigated CAUTI-related biofilms consisted of two to five different species with one or two species dominating the mixed community. Following this line of research, we investigated in study V structure and function of a biofilm of a long-term catheterized patient, which was predominantly composed of P. aeruginosa and Morganella morganii, but also contained a minor proportion of the obligate anaerobe Bacteroides sp.. The comparison of in vivo and in vitro protein expression profiles of P. aeruginosa and M. morganii indicated that iron and carbohydrates are the major growth-limiting factors in the bladder. These results indicate different nutritional strategies of the two pathogens in the bladder environment. A comparison of urinary protein profiles of healthy persons and catheterized patients suggested that the human innate immune system is induced by CAUTIs. Moreover, numerous proteins involved in nutritional immunity, e.g. iron-, calcium- and magnesium-binding proteins, were found to be more abundant in the urine of catheterized patients. A follow-up (meta)proteomics study (study VI) aiming at the elucidation of interspecies interactions during multi-species infections indicated that the urease-positive uropathogen Proteus mirabilis induces the precipitation of metal ions by urine alkalization and thereby limits the availability of these important micronutrients for other co-infecting bacteria. This limitation seems to be sensed by the P. aeruginosa PhoP-PhoQ two-component system (TCS) leading to an increased resistance to antimicrobial peptides and biofilm-forming capacity of the pathogen. Also during co-cultivation of P. aeruginosa with Staphylococcus aureus a slight increase in the expression of the PhoP-PhoQ TCS and the alkaline protease could be observed (study VII). In study VIII a combined metagenomics and metaproteomics approach was employed to investigate structure and function of the lichen Lobaria pulmonaria, a complex consortium consisting of a fungus, an algal partner, cyanobacteria, and a highly diverse bacterial microbiome. The results presented in this work contribute to a better understanding of the manifold and complex bacterial adaptation mechanisms to infection-related and environmental stress and thereby foster the development of novel treatment and prevention strategies.
Swine are regarded as promising biomedical models, but the dynamics of theirgastrointestinal microbiome have been much less investigated than that of humans or mice. The aimof this study was to establish an integrated multi-omics protocol to investigate the fecal microbiomeof healthy swine. To this end, a preparation and analysis protocol including integrated samplepreparation for meta-omics analyses of deep-frozen feces was developed. Subsequent data integrationlinked microbiome composition with function, and metabolic activity with protein inventories, i.e.,16S rRNA data and expressed proteins, and identified proteins with corresponding metabolites.16S rRNA gene amplicon and metaproteomics analyses revealed a fecal microbiome dominated byPrevotellaceae,Lactobacillaceae,Lachnospiraceae,RuminococcaceaeandClostridiaceae.Similar microbiomecompositions in feces and colon, but not ileum samples, were observed, showing that feces can serveas minimal-invasive proxy for porcine colon microbiomes. Longitudinal dynamics in composition,e.g., temporal decreased abundance ofLactobacillaceaeandStreptococcaceaeduring the experiment,were not reflected in microbiome function. Instead, metaproteomics and metabolomics showed arather stable functional state, as evident from short-chain fatty acids (SCFA) profiles and associatedmetaproteome functions, pointing towards functional redundancy among microbiome constituents.In conclusion, our pipeline generates congruent data from different omics approaches on the taxonomyand functionality of the intestinal microbiome of swine.
A physiological proteomic approach to address infection-related issues of Gram-positive bacteria
(2012)
Trotz der vielen wissenschaftlichen Fortschritten sind Infektionskrankheiten auch heute noch die Haupttodesursache weltweit. Sie haben nicht nur heute, sondern werden auch in der Zukunft eine große epidemiologische Bedeutung haben. Die komplexe Infektionsthematik sollte unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: der Prävention und der Behandlung. Zur Prävention von Infektionen zählen neben der Dekontamination und Sterilisation auch die Impfungen sowie die Hygiene- und Gesundheitsaufklärung. Bei der Behandlung von Infektionen kann auf Antibiotika zurückgegriffen werden, wenn das humane Immunsystem die Infektionen nicht auf natürliche Weise bekämpfen kann. Zwischen 1969 und 2000 wurde kein neues Antibiotikum den bereits vorhandenen Antibiotikaklassen hinzugefügt. Parallel zu dieser schwindenden Antibiotikaforschung, verbreiten sich nosokomiale Infektionen und community-acquired (vor allem Methicillin-resistente) Infektionen rapide. Von besonderer Bedeutung ist die Grundlagenforschung an infektionsassoziierten Mikroorganismen, wie dem humanen Erreger Staphylococcus aureus. Im Zusammenhang mit Infektionen spielen Virulenzfaktoren eine entscheidende Rolle. Sie sind entweder an der Zelloberfläche platziert oder werden aktiv ins Medium sekretiert. Um das pathogene Potential von S. aureus besser zu verstehen und aufzuklären ist ein Verständnis über die Proteintransportwege essentiell. Momentan sind die Transportwege von Escherichia coli (Gram-negative) und Bacillus subtilis (Gram-positive) am besten charakterisiert. Viele Transportwegekomponenten wurden mittels Transkriptions und Proteomeanalysen auch in S. aureus konserviert gefunden und ermöglichten dadurch einen ersten Einblick in die Sekretionsmaschinerie. Das Verständnis, warum und wie Virulenzfaktoren Infektionen auslösen birgt ein großes Potential in der Suche nach verbesserter Infektionskontrolle und Behandlung. Kontaminierte medizinische Arbeitsmittel, wie zum Beispiel Katheter oder Endoskope können auch eine auslösende Quelle von Infektionen sein. Diese medizinischen Arbeitsmittel oder Geräte bestehen immer häufiger aus bio-kompatiblen Polymeren (z.B. Polyethylen (PE) oder Polyethylenterephthalat (PET). Diese thermosensitive Polymere können keinen hohen Temperaturen ausgesetzt werden, ohne dass sie beschädigt werden. Damit sind herkömmliche Sterilisationsverfahren (z.B. Autoklavieren) nicht anwendbar. Alternative chemische Verfahren (z.B. Ethylenoxid-Sterilisation) sind mit Nebenwirkungen und Risiken verbunden, die im medizinischen Bereich nicht akzeptabel sind. Alternative Dekontaminationsverfahren für diese thermosensitive Materialen sind also gefragt. Hierbei rückt das Niedertemperaturplasma (NTP) nicht nur bei den Physikern sondern auch bei den Biologen und Medizinern immer weiter in den Fokus der Forschung. NTP, welches unter atmosphärischen Druck erzeugt wird, ist aus einer Vielzahl von antimikrobiell aktiven Agentien und chemischen Produkten (z.B. atomarer Sauerstoff (O), Ozon (O3), Hydroxyl (OH), reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS)) zusammengesetzt und stellt damit ein wirksames Mittel für die mikrobielle Dekontamination dar. Seit einiger Zeit wird NTP auch erfolgreich bei der Wundbehandlung angewendet. Erste Studien zeigen ein großes Potential von NTP-Wundbehandlungen in Hinblick auf verbesserte Wundheilung. Die Anwendung von Plasma in der Medizin könnte ganz neue Perspektiven eröffnet- das ist zumindest die Vision. Auf der praktischen Seite gibt es allerdings noch eine Vielzahl von offenen Fragen: (i) welche Art von Plasma ist für welchen Zweck am besten geeignet; (ii) was sind die Vorteile von Plasma im Vergleich zu gängigen medizinischen Behandlungen; (iii) ist Plasma ein ökonomische Alternative im Vergleich zu gängigen Anwandelungen und Standards? Bevor Plasma sicher und routinemäßig in Krankenhäusern zu Einsatz kommen kann ist es zusätzlich von größter Wichtigkeit den Einfluss von Plasma auf Zellen zu klären. Erst wenn die Plasma-Zell-Interaktion (pro- und eukaryotische Zellen) grundsätzlich untersucht und verstanden ist kann eine sichere, erfolgreiche und vor allem akzeptierte Implementierung in den Krankenhausalltag stattfinden.
Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze
(2009)
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
The toluene-degrading and solvent-tolerant strain Pseudomonas putida DOT-T1E was investigated with respect to its suitability and economic efficiency as biocatalyst in aqueous-organic two-phase systems with aliphatic solvents as organic phase (Rojas et al. 2004, chapter 4 and 5) and to its adaptive responses to the solvent decanol. The adaptive changes on the level of cell morphology (chapter 2), membrane fatty acids and permeability (chapter 3), as well as energetics and surface properties (chapter 5) of P. putida DOT-T1E have been investigated in order to ascertain information about the strain's suitability for two-phase biotransformation systems (chapter 4). The morphological adaptation to the presence of solvents was observable in changes of the cell size of P. putida DOT-T1E. Those changes were dependent on the cellular activity and occurred only after addition of non-lethal solvent concentrations. The cells reacted to the presence of organic solvents by decreasing the ratio between surface and volume of the cells and therefore reducing their relative surfaces (chapter 2). The cell surface and especially the cytoplasmic membrane are the major targets for toxic effects of membrane-active compounds like solvents. The mechanism of the cis-trans isomerisation of unsaturated fatty acids counteracts the fluidizing effect of solvents by increase the ordering of the membrane and therefore its rigidity. By comparing the responses of the cells to a series of stress factors (like solvents), a direct correlation between the activation of this mechanism and the well investigated K+-uptake pumps was observed (chapter 3). Huertas et al. (1998) reported that this strain tolerated concentrations of heptane, propylbenzene, octanol, and toluene of at least 10 % (vol/vol). 1-decanol is, in comparison to toluene, less hazardous and volatile, and it possesses good extraction properties for the desired fine chemical products. In further investigations of possible biotechnological processes, it was discovered that decanol is also a more suitable solvent as organic phase (chapter 4). Although the cells of P. putida DOT-T1E needed additional energy for their adaptation to the presence of the solvent decanol, they were able to maintain or activate their electron transport phosphorylation allowing homeostasis of ATP level and energy charge in the presence of the solvent, at the price of a reduced growth yield. On the other hand, significantly enhanced cell hydrophobicities converging with more negative cell surface charges were observed in cells grown in the presence of 1-decanol (chapter 5). It is however important to note that all the cell’s properties observed are closely linked to each other since they are all part of the adaptive response of the cells. It can be concluded that the easy adaptability and good growth properties of Pseudomonas putida DOT-T1E in the presence of the organic solvent 1-decanol make this system an excellent candidate for two-phase fermentation processes. Moreover, the absence of differences in the energetics of the bacteria during exposure to 1-decanol as compared to bacteria that grew in the absence of 1-decanol, support that this organism can be used for the industrial production of fine chemicals in an economically sound manner.
Technological advances in light microscopy have always gone hand in hand with unprecedented biological insight. For microbiology, light microscopy even played a founding role in the conception of the entire discipline. The ability to observe pathogens that would otherwise evade human observation makes it a critical necessity and an indispensable tool to infectious disease research. Thus, the aim of this thesis was to optimize, extend, and functionally apply advanced light microscopy techniques to elucidate spatio-temporal and spatio-morphological components of bacterial and viral infection in vitro and in vivo.
Pathogens are in a constant arms race with the host’s immune system. By finding ways to circumvent host-mediated immune responses, they try to evade elimination and facilitate their own propagation. The first study (publication I) demonstrated that the obligate intracellular pathogen Coxiella burnetii is not just able to infect natural killer (NK) cells, but is actually capable of surviving the harsh degradative conditions in the cytotoxic lymphocyte’s granules. Using live-cell imaging of reporter-expressing Coxiella burnetii, the transient NK cell passage was closely monitored to provide detailed spatio-temporal information on this dynamic process in support of a range of static analyses. Bacterial release from NK cells was pinpointed to a time frame between 24 to 48 hours post-infection and the duration of release to about 15 minutes.
The second approach (publications II-V) aimed at shedding light on the greater spatio-morphological context of virus infection. Thus far, most studies investigating the distribution or tropism of viruses in vivo have used conventional immunohistochemistry in thin sections. Omitting the native spatial context of the infection site in vivo inherently bears the risk of incomplete description. While the microscopic tools and sample preparation protocols needed for volumetric 3D immunofluorescence imaging have recently been made available, they had not gained a foothold in virus research yet. An integral part of this thesis was concerned with the assessment and optimization of available tissue optical clearing protocols to develop an immunofluorescence-compatible 3D imaging pipeline for the investigation of virus infection inside its intact spatio-morphological environment (publication II). This formed the basis for all subsequent volumetric analyses of virus infection in vivo presented here. Consequently, this thesis provided a valuable proof of concept and blueprints for future virus research on the mesoscopic scale of host-pathogen interactions in vivo (publications II-V), using rabies virus (RABV; publications II-IV) and the newly-emerged severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2; publication V) as infection models for the nervous system and the respiratory tract, respectively.
Applying and further improving this volumetric 3D imaging workflow enabled unprecedented insights into the comprehensive in vivo cell tropism of RABV in the central (CNS) (publication III) and peripheral nervous system (PNS) (publication IV). Accordingly, differential infection of CNS-resident astrocytes by pathogenic and lab-attenuated RABV was demonstrated (publication III). While either virus variant showed equal capacity to infect neurons, as demonstrated by quantitative image analysis, only pathogenic field RABVs were able to establish non-abortive infection of astrocytes via the natural intramuscular inoculation route. A combined 3D LSFM-CLSM workflow further identified peripheral Schwann cells as a relevant target cell population of pathogenic RABV in the PNS (publication IV). This suggested that non-abortive infection of central and peripheral neuroglia by pathogenic RABV impairs their immunomodulatory function and thus represents a key step in RABV pathogenesis, which may contribute significantly to the establishment of lethal rabies disease.
Finally, utilizing the full volumetric acquisition power of LSFM, a further refined version of the established 3D imaging pipeline facilitated a detailed mesoscopic investigation of the distribution of SARS-CoV-2 in the respiratory tract of the ferret animal model (publication V). Particularly for this newly-emerged pathogen of global concern, in-depth knowledge of host-pathogen interactions is critical. By preserving the complete spatio-morphological context of virus infection in the ferret respiratory tract, this thesis provided the first specific 3D reconstruction of SARS-CoV-2 infection and the first report of 3D visualization of respiratory virus infection in nasal turbinates altogether. 3D object segmentation of SARS-CoV-2 infection in large tissue volumes identified and emphasized a distinct oligofocal infection pattern in the upper respiratory tract (URT) of ferrets. Furthermore, it corroborated a preferential replication of SARS-CoV-2 in the ferret URT, as only debris-associated virus antigen was detected in the lower respiratory tract of ferrets, thus providing crucial information on the spatial distribution of SARS-CoV-2.
African swine fever virus (ASFV) is one of the most threatening animal viruses which has dramatically expanded its distribution range within the last years. ASFV was first described and is endemic in sub-Saharan Africa where it is transmitted in a sylvatic cycle between indigenous suids and Ornithodoros soft ticks. Therefore, ASFV is the only known DNA-arbovirus and, in addition to that, the only member of the genus Asfivirus within the family Asfarviridae. Being highly infectious to domestic pigs and wild boar, the virus was introduced into Georgia in 2007 and has subsequently spread throughout eastern Europe reaching the European Union in 2014. Despite almost 100 years of intensive research and the occurrence of African swine fever (ASF) on four continents including Europe, many aspects of its epidemiology, vector dynamics and virus evolution are unknown. In our study, first evidence is presented on endogenous ASFV-like (EASFL)- elements which are integrated into the genome of ASFV natural vectors, O. moubata soft ticks. Through a series of experiments including next-generation sequencing, infection experiments, phylogenetic and BEAST analyses as well as PCR-screening, evidence is provided that these elements belong to an ancestral ASFV strain that might have existed 50,000 to 30,000 years BCE. Further results suggest that the EASFL-elements are involved in protecting ticks against ASFV infection and might belong to a generalised tick defence mechanism. In order to evaluate factors influencing ASFV epidemiology in eastern Europe, experiments were conducted on possible indigenous vector species and circulating virus isolates. In the absence of the natural tick vector, blow fly larvae were considered as possible mechanical vectors involved in ASFV transmission and persistence. Results are presented that even after feeding on highly infectious wild boar tissue, fly larvae and pupae showed no contamination with infectious virus. On the contrary, the maggots appeared to have inactivated the virus in the organ tissue through their salivary secretions. Further experiments conducted on an ASFV-strain isolated from northeastern Estonia resulted in the first report of an ASFV-strain with attenuated phenotype isolated in Eastern Europe. Results from NGS-analyses provided evidence for a major genome reorganisation in that strain that included a large deletion and a duplication of multiple ASFV genes.
Taken together, this study provides novel insights into the epidemiology of ASF and evolution of ASFV one of the major threats to animal health worldwide and therefore does not only contribute significantly to basic research but possibly also to specific knowledge necessary for future disease management.
An Innovative Protocol for Metaproteomic Analyses of Microbial Pathogens in Cystic Fibrosis Sputum
(2021)
Hallmarks of cystic fibrosis (CF) are increased viscosity of mucus and impaired mucociliary clearance within the airways due to mutations of the cystic fibrosis conductance regulator gene. This facilitates the colonization of the lung by microbial pathogens and the concomitant establishment of chronic infections leading to tissue damage, reduced lung function, and decreased life expectancy. Although the interplay between key CF pathogens plays a major role during disease progression, the pathophysiology of the microbial community in CF lungs remains poorly understood. Particular challenges in the analysis of the microbial population present in CF sputum is (I) the inhomogeneous, viscous, and slimy consistence of CF sputum, and (II) the high number of human proteins masking comparably low abundant microbial proteins. To address these challenges, we used 21 CF sputum samples to develop a reliable, reproducible and widely applicable protocol for sputum processing, microbial enrichment, cell disruption, protein extraction and subsequent metaproteomic analyses. As a proof of concept, we selected three sputum samples for detailed metaproteome analyses and complemented and validated metaproteome data by 16S sequencing, metabolomic as well as microscopic analyses. Applying our protocol, the number of bacterial proteins/protein groups increased from 199-425 to 392-868 in enriched samples compared to nonenriched controls. These early microbial metaproteome data suggest that the arginine deiminase pathway and multiple proteases and peptidases identified from various bacterial genera could so far be underappreciated in their contribution to the CF pathophysiology. By providing a standardized and effective protocol for sputum processing and microbial enrichment, our study represents an important basis for future studies investigating the physiology of microbial pathogens in CF in vivo – an important prerequisite for the development of novel antimicrobial therapies to combat chronic recurrent airway infection in CF.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
Zur Aufklärung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgeführt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum größten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexität des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinitätsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren ließ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennschärfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinitäten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezüglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulären mRNA führt, als überraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulären-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukleäres Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stärker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgeführt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Veränderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorgängen sein dürften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verändert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfälligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexität. Ein Vergleich zur Affinitätsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Großteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Spleißfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Veränderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaßen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusätzlich eine Größenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestütztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.
Während des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzuklären und funktionelle Domänen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgeführte Analysen konnten zeigen, dass die Transmembrandomäne des pUL34, die für die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion während des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen Aminosäuren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler Aminosäuren zum Funktionsverlust des Proteins führt. Zur Identifikation möglicher funktioneller Domänen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen Aminosäuren schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale Aminosäuren keine Beeinträchtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 Aminosäuren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die Aminosäuren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz für den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen Hälfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgeführte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 und damit für die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-Interaktionsdomäne auf den Bereich von Aminosäure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger Aminosäuren oder Motive innerhalb der Interaktionsdomäne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte Aminosäuren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion während einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die für die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer Glutaminsäure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell für die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. Für ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G für die Funktion des NEC wichtig sind. Zusätzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht für die Bildung des NEC benötigt wird, aber für die Funktion während des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins bestätigt werden. Außerdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran während des Kernaustritts spielt. Hierfür wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern möglicherweise auch für eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-Molekülen wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen für die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend führten die hier durchgeführten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle Domänen zu identifizieren. Die Aufklärung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgeführten Mutagenesestudien das Verständnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.
Summary
The susceptibility of Candida albicans biofilms to a non‐thermal plasma treatment has been investigated in terms of growth, survival and cell viability by a series of in vitro experiments. For different time periods, the C. albicans strain SC5314 was treated with a microwave‐induced plasma torch (MiniMIP). The MiniMIP treatment had a strong effect (reduction factor (RF) = 2.97 after 50 s treatment) at a distance of 3 cm between the nozzle and the superior regions of the biofilms. In addition, a viability reduction of 77% after a 20 s plasma treatment and a metabolism reduction of 90% after a 40 s plasma treatment time were observed for C. albicans. After such a treatment, the biofilms revealed an altered morphology of their cells by atomic force microscopy (AFM). Additionally, fluorescence microscopy and confocal laser scanning microscopy (CLSM) analyses of plasma‐treated biofilms showed that an inactivation of cells mainly appeared on the bottom side of the biofilms. Thus, the plasma inactivation of the overgrown surface reveals a new possibility to combat biofilms.
Mit der Entwicklung von sanften Ionisierungsverfahren wie der MALDI ist es seit Ende der 1980er Jahre möglich, Proteine und Peptide effizient in die Gasphase zu überführen, zu ionisieren und einer massenspektrometrischen Untersuchung zuzuführen. Dennoch bleibt die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund seiner hohen Komplexität und hohen Konzentrationsunterschiede von bis zu 10 Zehnerpotenzen eine Herausforderung. Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit werden Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum in der Medizin routinemäßig für diagnostische Zwecke eingesetzt. Die Entwicklung von Biomarkern aus Plasma und Serum wird allerdings durch die extrem unterschiedlichen physiologischen Konzentrationen verschiedener Plasmaproteine sehr erschwert. Die Zusammensetzung des menschlichen Plasmas ist in zahlreichen Studien intensiv analysiert worden, wohingegen für das Rind bis auf einige 2D-elektrophoretische Kartierungen nur wenige Studien vorliegen. Das im Vergleich zu Humanproben geringere Interesse an Proben z.B. bovinen Ursprungs zeigt sich auch am Mangel spezifischer Reagenzien zu deren Analyse und führt zu einer vergleichsweise schlechten Dokumentation der Zusammensetzung boviner Plasmen. Für eine detaillierte Analyse des bovinen Plasmaproteoms wurde daher ein dreistufiger Arbeitsablauf entwickelt. In einem ersten Schritt sollte die Proteinkonzentration im Ausgangsmaterial angeglichen werden. Dazu wurden zwei Methoden miteinander verglichen. Die bei humanen Proben angewandte Standardmethode der Extraktion von Albumin mit CB-modifizierten Matrizen ergab keine zufriedenstellende Bindungsspezifizität für BSA und ist daher für das Rind und andere getestete Nutztiere nicht anwendbar. Im Gegensatz dazu führte die Egalisierung mittels CPLL zu der gewünschten Angleichung der Proteinkonzentration und zu einer deutlichen Erhöhung der Ausbeuten an identifizierten Proteinen in der MS-Analyse. Der zweite Schritt des Arbeitsablaufes dient der Reduktion der Probenkomplexität durch Fraktionierung der Proben mit den folgenden drei Verfahren: (i) die SDS-PAGE mit anschließendem In-Gel-Verdau („geLC-MS“), (ii) die gelfreie präparative isoelektrische Fokussierung („offgeLC-MS“) der Plasmaproteine oder (iii) die Fraktionierung der proteolytischen Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung. Die dabei erhaltenen Fraktionen wurden im dritten Schritt durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS analysiert. Alle drei Fraktionierungsstrategien führten nochmals zu einer verbesserten Ausbeute an Proteinidentifizierungen, wobei sich die gelfreie Peptidfokussierung als leistungsfähigstes Verfahren erwies. Die drei Fraktionierungsmethoden sind teilweise komplementär, da von den insgesamt 296 identifizierten Proteinen lediglich 96 in allen drei Ansätzen mittels MS nachweisbar waren. Nach einer weiteren Shotgun-Analyse mit einer anderen Protease wurde aus allen verfügbaren Daten schließlich ein Gesamtkatalog von 480 bovinen Plasmaproteinen erstellt. Während der Plasmaproteomstudie wurde auf Basis einer Zufallsbeobachtung eine alternative Methode zur Abreicherung von abundanten Serumproteinen entwickelt. Die Verdünnung oder Dialyse von Serumproben führte bei leicht sauren pH-Werten reproduzierbar zur Bildung eines Niederschlags, in dem die Konzentrationen der einzelnen Proteine ähnlich ausgeglichen schienen wie nach einer Extraktion mit CPLL. Das Präzipitat wurde mittels qualitativer und quantitativer MS näher charakterisiert. Im Vergleich mit einem parallel analysierten CPLL-behandeltem Serum wurde eine ähnlich effiziente Entfernung von BSA aufgezeigt. Die Proteinzusammensetzung beider Präparate erwies sich jedoch nach Analyse mittels 1D und 2D Gelelektrophorese und nLC-MALDI-TOF/TOF MS als signifikant unterschiedlich. Bezüglich der Abreicherung von abundanten und der Anreicherung von weniger abundanten Proteinen wiesen beide Verfahren unterschiedliche Profile auf, die nach Einführung einer Isotopenmarkierung mittels quantitativer MS charakterisiert wurden. Beide Verfahren waren exzellent reproduzierbar. Für eine eingehende Analyse des Präzipitats wurden nach erfolgtem tryptischen Verdau die Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung fraktioniert und die Fraktionen sowohl durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS als auch mit einem Orbitrap Massenspektrometer analysiert. Auf diese Weise konnten im Präzipitat insgesamt 306 Proteine identifiziert werden. Die GO-Analyse zeigte, dass darin typische Plasmaproteine angereichert sind. Die Methode eignet sich damit hervorragend als Ergänzung zum CPLL-Verfahren. Virusbedingte Erkrankungen von Wildtieren und Nutztieren werden zunehmend auch unter dem Aspekt der Übertragbarkeit auf den Menschen betrachtet. Zu solchen Erregern mit zoonotischem Potential gehören auch die zur Gattung Henipavirus zählenden Arten Hendravirus (HeV) und Nipahvirus (NiV). Das Matrixprotein dieser Viren ist für den vollständigen Zusammenbau des Viruspartikels und den Budding-Prozess bei der Virusfreisetzung verantwortlich und unterliegt einer nukleo-zytoplasmatische Passage. Welche Interaktionen zwischen Virus und Wirt während dieses Prozesses genau ablaufen und welche zellulären Faktoren dabei eine Rolle spielen, ist bisher nicht bekannt. Um solche Faktoren zu identifizieren wurden daher Proteinkomplexe charakterisiert, die durch Affinitätsreinigung mit Strep-markiertem HeV M isoliert wurden. Dabei wurde die Interaktion von ANP32B mit HeV M mit Hilfe der MALDI-TOF/TOF MS nachgewiesen und durch weitere Analysen bestätigt. So gelang in reziproken Co-Immunpräzipitationen die Fällung des jeweils anderen Bindungspartners und in fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wurde gezeigt, dass M nur bei Anwesenheit des ANP32B im Zellkern akkumuliert. Dies wurde für HeV M und NiV M sowohl in transfizierten als auch in virusinfizierten Zellen nachgewiesen. Die Unterdrückung der ANP32B Expression in infizierten Zellen hatte keinen Einfluss auf den Budding-Prozess, so dass die Hypothese, die nukleo-zytoplasmatische Passage des M-Proteins sei essentiell für die Virusfreisetzung, nicht bestätigt werden konnte.
Background: Methanogenic archaea represent a less investigated and likely underestimated part of the intestinal tract microbiome in swine.
Aims/Methods: This study aims to elucidate the archaeome structure and function in the porcine intestinal tract of healthy and H1N1 infected swine. We performed multi-omics analysis consisting of 16S rRNA gene profiling, metatranscriptomics and metaproteomics.
Results and discussion: We observed a significant increase from 0.48 to 4.50% of archaea in the intestinal tract microbiome along the ileum and colon, dominated by genera Methanobrevibacter and Methanosphaera. Furthermore, in feces of naïve and H1N1 infected swine, we observed significant but minor differences in the occurrence of archaeal phylotypes over the course of an infection experiment. Metatranscriptomic analysis of archaeal mRNAs revealed the major methanogenesis pathways of Methanobrevibacter and Methanosphaera to be hydrogenotrophic and methyl-reducing, respectively. Metaproteomics of archaeal peptides indicated some effects of the H1N1 infection on central metabolism of the gut archaea.
Conclusions/Take home message: Finally, this study provides the first multi-omics analysis and high-resolution insights into the structure and function of the porcine intestinal tract archaeome during a non-lethal Influenza A virus infection of the respiratory tract, demonstrating significant alterations in archaeal community composition and central metabolic functions.
Das 3084 Aminosäuren umfassende innere Tegumentprotein pUL36 des zu den Herpesviren zählenden Pseudorabies Virus (PrV) stellt ein multifunktionelles Protein dar, das für die sekundäre Umhüllung der Nukleokapside im Zytoplasma essentiell ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der frühen Phase der Replikation, d.h. dem Transport der Nukleokapside zum Zellkern und der Andockung an die Kernpore als Voraussetzung für die Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Um die Rolle von PrV pUL36 während des viralen Replikationszyklus weiter aufzuklären, wurden funktionelle Regionen identifiziert und bekannte Motive und Regionen mittels gezielter Deletion bzw. Mutagenese untersucht. Zunächst wurden eine konservierte Deubiquitinylierungs (DUB)-Domäne und potentielle Leucin-Zipper-Motive im N-Terminus des Proteins, sowie eine Alanin- und Prolin-reiche Region im C-Terminus mittels gezielter Deletionen untersucht. Zusätzlich wurden durch ungerichtete Transposon-vermittelte Mutagenese Insertionsmutanten hergestellt. Die Funktionalität dieser Mutanten wurde durch Komplementierung einer UL36-negativen PrV Mutante untersucht. Mutierte Proteine, in denen essentielle Regionen betroffen waren, konnten den Replikationsdefekt der Virusmutante nicht kompensieren, während für Mutanten, die den Defekt komplementieren konnten, stabile Virusrekombinanten isoliert wurden. Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten erfolgte mittels Plaquegrößenvergleich, Ein-Schritt-Wachstumskinetik und Ultrastrukturanalyse. Zusätzlich wurden einige Mutanten hinsichtlich des Replikationsverhaltens in vivo in einem Mausmodell untersucht. Um die Funktion von PrV pUL36 aufzuklären, ist es notwendig die intrazelluläre Lokalisierung von pUL36 zu kennen. Dazu wurden Immunfluoreszenz- und Ultrastrukturanalysen mit vier gegen unterschiedliche Bereiche des pUL36 gerichteten Antiseren durchgeführt. Auch die potentiellen Kernlokalisierungssignale (NLS) wurden hinsichtlich ihrer Funktion untersucht und die N-terminalen NLS-Motive 1/2 deletiert. Trotz der Funktionalität der essentiellen N-terminalen NLS-Motive 1/2 (Abb. 11) wurde pUL36 während der Virusreplikation niemals im Zellkern nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Tegumentierung ausschließlich im Zytoplasma abläuft. Die NLS vermitteln also bei der Infektion keinen Kerntransport des pUL36. Die Bedeutung der NLS könnte aber mit dem Transport der Kapside entlang der Mikrotubuli zum Zellkern und dem Andocken an die Kernporen zusammenhängen. Im Gegensatz dazu spielen die Leucin-Zipper (Abb. 11) offenbar bei der sekundären Umhüllung eine Rolle. Sie sind möglicherweise an der Verbindung des inneren und äußeren Teguments beteiligt. Im N-Terminus von pUL36 konnte zwischen der Interaktionsdomäne mit dem Komplexpartner pUL37 und den Leucin-Zippern eine weitere wichtige Region (Abb. 11) identifiziert werden. Diese Region ist auch in die sekundäre Umhüllung im Zytoplasma involviert und könnte für den Transport der teilweise tegumentierten Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein, wobei pUL36, nicht aber die pUL36-pUL37-Interaktion hierbei eine Rolle spielt. Die gleichzeitige Deletion der DUB-Domäne und der Alanin- und Prolin-reichen Region (Abb. 11) führte zu einem Defekt bei der sekundären Umhüllung, wohingegen die Alanin- und Prolin-reiche Region allein für die Replikation von PrV kaum eine Rolle spielt. Allerdings konnte die Deletion nicht ohne Funktionsverlust weiter vergrößert werden, so dass die angrenzenden Bereiche für die Funktion von pUL36 essentiell sein könnten. Die zentrale Region von Aminosäure 1540 bis 1987 (Abb. 11) grenzt an diese Alanin- und Prolin-reiche Region an und ist für die Funktion von pUL36 essentiell, was durch den Funktionsverlust nach Insertionsmutagenese (mit einer Ausnahme) in diesem Bereich demonstriert wurde. Demnach könnte diese Region eine Rolle während der frühen Phase der Infektion, wie z.B. beim Transport der Kapside zum Zellkern und/oder beim Andocken der Kapside an die Kernpore und der Freilassung der DNA in den Zellkern spielen. Der essentielle C-Terminus von pUL36 (Abb. 11) kann wahrscheinlich auf die Aminosäuren 3022 bis 3066 eingegrenzt werden, so dass nicht nur die letzten 6, sondern womöglich die endständigen 18 Aminosäuren für die Funktion von pUL36 nicht gebraucht werden.
In food chain, Pseudomonas spp. cause spoilage by reducing shelf life of fresh products, especially during cold storage, with a high economic burden for industries. However, recent studies have shed new light on health risks occurring when they colonize immunocompromised patient tissues. Likewise to P. aeruginosa, they exhibit antibiotic resistance and biofilm formation, responsible for their spread and persistence in the environment. Biofilm formation might be induced by environmental stresses, such as temperature fluctuations causing physiological and metabolic changes exacerbating food spoilage (by protease and pigment synthesis), and the production of adhesion molecules, chemotactic or underestimated virulence factors. In order to provide a new insight into phenotypic biodiversity of Pseudomonas spoilers isolated from cold stored cheese, in this work 19 Pseudomonas spp. were investigated for biofilm, pigments, exopolysaccharide production and motility at low temperature. Only nine strains showed these phenotypic traits and the blue pigmenting cheese strain P. fluorescens ITEM 17298 was the most distinctive. In addition, this strain decreased the survival probability of infected Galleria mellonella larvae, showing, for the first time, a pathogenic potential. Genomic and proteomic analyses performed on the ITEM 17298 planktonic cells treated or not with lactoferrin derived antibiofilm peptides allowed to reveal specific biofilm related-pathways as well as proteins involved in pathogenesis. Indeed, several genes were found related to signaling system by cGMP-dependent protein kinases, cellulose, rhamnolipid and alginate synthesis, antibiotic resistance, adhesion and virulence factors. The proteome of the untreated ITEM 17298, growing at low temperature, showed that most of the proteins associated with biofilm regulation, pigmentation motility, antibiotic resistance and pathogenecity were repressed, or decreased their levels in comparison to that of the untreated cultures. Thus, the results of this work shed light on the complex pathways network allowing psychrotrophic pseudomonads to adapt themselves to food-refrigerated conditions and enhance their spoilage. In addition, the discovery of virulence factors and antibiotic resistance determinants raises some questions about the need to deeper investigate these underestimated bacteria in order to increase awareness and provide input to update legislation on their detection limits in foods.
Ebolaviruses are dependent on host cell proteins for almost all steps in their viral life cycle. While some cellular factors with crucial roles in the ebolavirus life cycle have been identified, many of them remain to be identified or fully characterised. This thesis focuses on the characterisation and identification of host cell interactions of the highly pathogenic Ebola virus (EBOV), probing host-virus interaction at various stages of the viral life cycle. Beginning with viral budding, the function of a recently proposed late domain motif within the EBOV matrix protein VP40 was examined using an EBOV transcription and replication-competent virus-like particle (trVLP) system. Although this motif has been suggested to interact with the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), we could show that this late domain motif does not contribute to EBOV budding.
While many host cell proteins have been identified so far that are important for viral budding, only a few proteins are known that are necessary for EBOV RNA synthesis. Thus, to identify host proteins that are involved in viral replication and transcription, we performed a genome-wide siRNA screen in the context of an EBOV minigenome assay. Using this approach, we identified several proteins that appear to be important for viral RNA synthesis or protein expression. Two of the most prominent hits in our screen were CAD (Carbamoyl-phosphate synthetase 2, aspartate transcarbamylase and dihydroorotase) and NXF1 (nuclear RNA export factor 1). CAD catalyses the first three steps in the de novo pyrimidine biosynthesis, while NXF1 is the main nuclear export protein for cellular mRNAs. In subsequent characterisation studies, using a range of life cycle modelling systems as well as molecular analyses, we could demonstrate that the canonical function of CAD during the pyrimidine biosynthesis is necessary for EBOV replication and transcription. In contrast to this, for NXF1 we discovered a so-far unknown function: Again, by applying different life cycle modelling alongside with molecular assays, we provided evidence that the EBOV nucleoprotein recruits NXF1 into inclusion bodies, the site of EBOV RNA synthesis, where it binds viral mRNAs to export them from these structures. Importantly, for both CAD and NXF1 we were able to recapitulate key data in the context of live EBOV infection, confirming their roles in the viral life cycle.
Both of these identified host factors are promising targets for antiviral therapies and indeed de novo pyrimidine synthesis is emerging as a possible antiviral target for a number of viruses. Similarly, as we could show NXF1 to be important in the life cycle of the highly pathogenic Junín virus, this raises the possibility that disruption of this interaction may result in broad-spectrum antiviral activity. Moreover, for an increasing number of negative-sense RNA viruses inclusion bodies as site of viral RNA synthesis are described to have a liquid organelle character. Therefore, our findings on NXF1 also provide an intriguing model to explain how negative-sense RNA viruses in general overcome this obstacle and export viral mRNAs from inclusion bodies.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
The here presented dissertation investigated the molecular mechanisms, by which the food industry model bacteria Pseudomonas fluorescens and Listeria monocytogenes, grown either as planktonic cultures, were inhibited by plasma treated water (PTW) produced by a microwave-induced plasma source (MidiPLexc). As a starting point, optimal operating parameters were determined with 5 standard liters per minutes(slm)compressed air during the treatment of 10 ml deionized water within a treatment time of up to 15 min (pre-treatment time). Treatment times of 1, 3 and 5 min were selected (post-treatment time). In addition to physical parameters, i.e. temperature measurements at different spots at the plasma source during the production of the PTW, the chemical composition of PTW was determined by pH measurements, chronoamperometry (determination of the H2O2 concentration), ion chromatography (determination of the NO2-, NO3- and ONOO- concentrations) and mass spectrometry (qualitative determination of the molecules). In addition, concentration changes of reactive species over a period of 3 h indicated a decrease of the NO2- concentration as well as an increase of the NO3- and ONOO- concentration in the PTW. Microbiological assays, i.e. quantification of colony-forming units (CFU), fluorescence and XTT assays, revealed a significant reduction of the proliferation ability of the cells, membrane damages and metabolic activity have been demonstrated for planktonic cultures as well as mono- and multispecies biofilms. PTW effects on biofilm structures were investigated using microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy (CLSM), atomic force microscopy (AFM), and scanning electron microscopy (SEM), as well as physical methods such as contact angle measurements. Significant changes in the biofilm structure have been shown, which indicate an ablation of the biofilm mass from top to bottom by approximately 2/3 of the biofilm mass and a destruction of the extracellular matrix (ECM) by the reactive species within the PTW. Subsequently, fresh-cut lettuce has been treated with PTW produced by up-scaled plasma sources. Apart from qualitative parameters of the lettuce after PTW treatment such as texture and color, the concentration of PTW reactive species have been determined. These experiments showed that the composition of the reactive species were slightly different from that of the laboratory-scaled plasma source MidiPLexc. Notably, the PTW treatment did not cause significant changes in texture and color of the fresh-cut lettuce. Finally, a synergistic effect of PTW treatment followed by plasma-processed air (PPA) drying was demonstrated application-specific.
The respiratory epithelium acts as both, a barrier of the respiratory tract to Nipah virus (NiV) entry and at the same time as a significant determinant of virus shedding. Both, for humans and pigs, replication in the respiratory tract epithelia is considered a major factor in transmission to other hosts. To understand why the virus constitutes a high-risk pathogen for livestock and humans, knowledge about
viral replication and host responses in relevant cells and tissues is crucial. Most in vitro studies, however, have been performed in conventional cell lines or non-differentiated lung cells. Only a few examples exist where Henipavirus infections have been investigated in fully-differentiated lung
epithelial cell models.
Thus, one aim of this thesis was to investigate infection, replication, spread and host protein dynamics of NiV in primary bronchial epithelial cells (BEC) cultivated at the air-liquid-interphase (ALI). By
immunofluorescence imaging, the NiV infection dynamics in BEC-ALI cultures were monitored over a 12 day time course, in order to provide detailed information about the infection process in the
respiratory epithelium of pigs and ferrets. Compared to undifferentiated primary BEC, the specific infectivity of NiV in BEC-ALI cultures was low. Infections remained focal and complete infection of the
cultures was not observed, even at 12 dpi. Analysis of viral titers and viral mRNA indicated a limited
virion release from the infected ALI-cultures while most of the newly synthesized NiV-RNA remained
cell associated. Immunofluorescence analysis of cross sections from infected ALI-cultures revealed
large infected areas that exhibited a strong cytopathic effect (CPE). Disruption of the epithelium
resulted in apical release of virus antigen-positive cell detritus while ciliated areas and basal cells were
less affected. From these data it was concluded, that NiV transmission could be supported by
exhalation of cell debris associated NiV and thus may contribute to rapid spread of infection in swine
populations.
A second aim was to explore the dynamics of host responses to NiV infection in differentiated BEC-ALI
culture and to assess whether this differs to conventional cell line data available from literature. Even
though strong CPE appeared in later phases of NiV infection, at least the porcine PBEC-ALI cultures
remained robust enough to allow protein sampling over 12 days infection course. Subsequent MS-based proteomics enabled unprecedent insight in complex cell culture response upon NiV infection.
Previous reports indicated a lack of efficient interferon type I induction in non-differentiated pig or
human BEC which were considered a prerequisite for efficient replication in the respiratory epithelium
and virusspread. In contrast to non-differentiated pig BEC (PBEC), in PBEC-ALI cultures multiple factors
involved in interferon responses were upregulated upon NiV infection. Thereby it was demonstrated
that NiV infection induced a robust innate immune response upon infection with elevated components of antigen processing and presentation resulting in the conversion from the constitutive proteasome to the immunoproteasome. In contrast to previous reports about NiV-infected non-differentiated
PBEC or endothelial cells, incomplete immunoproteasome formation and limitations in interferon
response could be excluded. Thus, a model is proposed in which NiV infection and spread in differentiated PBECs is slowed by potent innate immune responses to the virus infection. Overall, the
findings highlight the important role of the respiratory epithelium not only as a physical barrier to virus
infections but also indicate itsrole as a primary site of adaptive immune induction through NiV induced
antigen processing and MHC I presentation.
Finally, to allow functional studies of Henipaviruses at the BSL-2 biosafety level a recombinant CedPV
was generated and rescued. An imaging based screening and quantitative analysis pipeline was established to investigate the role of cellular factors and to screen for potential virus and host gene
directed inhibitory factors. Accordingly, different host and viral genes were targeted with a siRNA-pool
either targeting virus or selected cellular mRNAs followed by the infection with the CedPV and the
quantification of infected cells. With proof of concept of the siRNA screening pipeline, the recombinant
CedPV clone was used as a backbone to insert variousfluorescence reporter genesin order to optimize
the analysis workflow by allowing direct virus quantification in live, unstained samples. Consequently,
this thesis provides a valuable proof for future approaches related to the function of virus proteins,
influence of host-factors and virusreplication and Henipavirus-inhibitorscreens at low biosafety levels.
Orthohantaviruses are rodent-borne pathogens distributed all over the world, which do not cause visible disease in their reservoir host. Puumala orthohantavirus (PUUV) causes most human hantavirus disease cases in Europe and is transmitted by the bank vole (Clethrionomys glareolus). Hantaviruses have a tri-segmented genome consisting of the large (L) segment, coding for the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), the medium (M) segment, encoding the glycoproteins, and the small (S) segment. The S-segment contains two major overlapping open reading frames (ORF) coding for the nucleocapsid (N) protein and a non-structural (NSs) protein, a putative type I interferon (IFN-I) antagonist. To date, pathogenesis and reservoir host adaptation of hantaviruses are poorly understood due to missing adequate cell culture and animal models.
In contrast to previous studies, in this work, data from spring and summer 2019 indicated a high vole abundance, a high PUUV prevalence in voles and high human incidence for some endemic regions in Germany, but elsewhere values were low to moderate. Regional and local human health institutions need to be aware about the heterogeneous distribution of human PUUV infection risk.
For a better understanding of virus-host associations, two novel cell lines from bank voles and common voles each were generated and their susceptibility and replication capacities for a variety of zoonotic and non-zoonotic viruses were analyzed. The PUUV strain Vranica/Hällnäs showed efficient replication in a new bank vole kidney cell line, but not in four other cell lines of bank and common voles. Vice versa, Tula orthohantavirus (TULV) replicated in the kidney cell line of common voles, but was hampered in its replication in other cell lines. Several viruses, such as Cowpox virus, Vaccinia virus, Rift Valley fever virus, and Encephalomyocarditis virus 1 replicated in all four cell lines. West Nile virus, Usutu virus, Sindbis virus and Tick-borne encephalitis virus replicated only in a part of the cell lines. These results indicate a tissue or species specific tropism for many of the tested viruses and the potential value of vole cell lines to address such questions in detail.
Using one of these new cell lines, the first German PUUV strains were isolated from bank voles caught in the highly endemic region around Osnabrück. Complete genomes were determined by target-enrichment-mediated high-throughput sequencing from original lung tissue, after isolation and after additional passaging in VeroE6 cells and a bank vole-derived kidney cell line. Different single amino acid substitutions were observed in the RdRP of the two stable PUUV isolates. The PUUV strain isolated on VeroE6 cells showed a lower titer when propagated on bank vole cells compared to VeroE6 cells. Additionally, glycoprotein precursor (GPC)-derived virus-like particles of a German PUUV strain from the same region allowed the generation of monoclonal antibodies that reacted with the isolated PUUV strains.
To investigate the role of PUUV and other vole-borne hantavirus NSs proteins, the evolution of the NSs and N encoding sequences was investigated by a field study in bank voles and the NSs sequences were characterized in vitro for their inhibitory effect on the human interferon-β promoter. Analysis of blood and lung samples of 851 bank voles trapped during 2010-2014 in Baden-Wuerttemberg and North Rhine-Westphalia resulted in detection of 27.8% PUUV-specific antibody positive bank voles, whereas in 22.3% PUUV-specific RNA was detected. In the hantavirus outbreak years 2010 and 2012 PUUV prevalence in bank voles was higher compared to 2011, 2013 and 2014. Sequences of the S segment of all positive bank voles showed amino acid and nucleotide sequence types of the NSs-ORF with temporal and/or local variation, whereas the N-ORF was highly conserved. One sequence type persisted over the whole observation period in both regions. The NSs coding sequence was highly divergent among regional bank vole populations in the outbreak year 2012.
Transfection experiments resulted in the detection of different products of the NSs-ORF of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses, due to translation initiation at different methionine codons along the coding sequence. Using luciferase reporter assays, the NSs proteins of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses showed inhibition of IFN-I induction of up to 70%, whereas Sin Nombre and Andes orthohantavirus NSs proteins showed a reduced effect compared to the other NSs proteins. The first 20 amino acids of the N-terminal region of PUUV NSs were found to be crucial for IFN-I promoter inhibition.
In conclusion, the newly established cell lines, antibodies, reporter assays and PUUV isolates are highly valuable tools for future hantavirus research. The activity of PUUV NSs protein in human cells contributes to our understanding of virus-host interactions and highlights the importance of corresponding future reservoir host studies. Hantavirus surveillance studies showed the necessity for timely information of the potential human PUUV infection risk to public health institutions in endemic areas to initiate appropriate actions.
In recent years, negative impact of pharmaceutical products on natural environment became an issue of high public interest. Pharmaceutical residues are detected in various ecosystems worldwide. Due to increasing production and consumption of medicines this problem is intensified. Therefore, an efficient way to restrain release into the world’s water system is required.
This work presents an enzymatic approach for the degradation of pharmaceuticals in wastewater treatment plants, using laccase and cytochrome P450 — two enzymes of high biotechnological and industrial potential. Laccase genes from fungi Trametes versicolor and Pycnoporus cinnabarinus were isolated and overexpressed in the non-conventional yeast Arxula adeninivorans. This organism served also as cytochrome P450 gene donor.
Recombinant laccase Tvlcc5 was purified by immobilized-metal ion affinity chromatography and biochemically characterized using 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as substrate for enzyme activity assays. The optimal temperature and pH were found to be 50 °C and 4.5–5.5, respectively. The half-life of Tvlcc5 at 60 °C was around 20 min. It was demonstrated that the presence of copper ions is essential for the synthesis of active protein. Moreover, negative impact of chloride anions on laccase activity was shown.
Cultivation conditions for the Tvlcc5 producing strain A. adeninivorans G1212/YRC102-TEF1-TVLCC5-6H were optimized. It was found that maintaining the pH at a constant level between pH 6.0 and 7.0 is essential for the production of active enzyme. Optimal cell growth and laccase accumulation were reached at 20 °C and in medium supplemented with 0.5 mM CuSO4. Performed fed-batch cultivation resulted in a laccase activity of 4986.3 U L-1.
Factors influencing the synthesis of Tvlcc5 leading to increased production of this protein were investigated. It was found that using three non-native signal peptides (cutinase 2 from A. adeninivorans (ACut2), α-mating factor from S. cerevisiae (MFα), and acid phosphatase from P. pastoris (PHO1) signal peptides) enhances the secretion of active enzyme by 20–80%. Besides that, additional overexpression of copper transporters positively affects laccase production.
Finally, it was proven that recombinant Tvlcc5 is a promising agent for the degradation of certain pharmaceuticals. After 24 h of incubation, the concentration of diclofenac and sulfamethoxazole decreased to 46.8% and 51.1%, respectively. Furthermore, it was shown that the addition of the redox mediator ABTS significantly shortens the degradation time of these substances.
Das Nipahvirus (NiV) ist ein Paramyxovirus, welches im Menschen eine tödliche Enzephalitis mit einer hohen Letalität von bis zu 100% und im Schwein vorwiegend eine schwerwiegende Atemwegserkrankung mit hoher Morbidität hervorruft. Es gibt bis heute keine zugelassene antivirale Therapie oder Vakzine. Da neben den neutralisierenden Antikörpern zunehmend auch die Bedeutung einer zellulären Immunabwehr gegenüber einer Henipavirus Infektion diskutiert wird, rücken vor allem Vakzinen in den Fokus, die in der Lage sind, beides zu induzieren. Virus-ähnliche Partikel (VLPs) stellen als nicht-replizierende Systeme eine sehr sichere Vakzine und durch ihren Virion-ähnlichen Aufbau mit repetitiven Strukturen sehr potente Immunogene dar.
In dieser Arbeit wurde die Immunogenität von Henipa VLPs (bestehend aus NiV G, NiV F und Hendravirus (HeV) M) bezüglich der Aktivierung des adaptiven Immunsystems zunächst im Kleintiermodell Maus und anschließend in einer Großtierstudie im natürlichen Wirt Schwein untersucht, um Rückschlüsse auf das Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine ziehen zu können.
Durch die Immunisierung mit Henipa VLPs wurde sowohl in C57BL/6 als auch in BALB/c Mäusen eine humorale Immunantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern als auch mit NiV neutralisierenden Antikörpern induziert. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Henipa VLPs in einem Mausstamm mit einer genetisch bedingten verstärkten Ausprägung einer Th1 Immunantwort (C57BL/6 Mäusen) in der Lage waren, eine zelluläre adaptive Immunantwort zu stimulieren. So konnte eine direkte Antigen-spezifische Proliferation und IFN-γ Expression in den CD8+ T-Zellen sowie die Th1 Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-2 in den Milzzellüberständen Henipa VLP-immunisierter C57BL/6 Mäuse nach homologer Restimulation nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass alle drei inkorporierten Proteine CD8+ T-Zell Epitope aufweisen. Die Kombination der drei Proteine in den Henipa VLPs führte zu einer stärkeren Reaktivierung der CD8+ T-Zellen. Im Rahmen der Immunisierung mit Henipa VLPs bildeten sich Gedächtnis CD8+ T-Zellen aus, die auch bei dreimaliger Applikation des Antigens und einer zusätzlichen Restimulation nicht in den funktionseingeschränkten Zustand der Erschöpfung oder Seneszenz übergingen.
Aufgrund der vielseitigen Immunogenität der Henipa VLPs im Mausmodell, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur Induktion des adaptiven Immunsystems im natürlichen Wirt Schwein untersucht. Auch in Schweinen induzierten die Henipa VLPs eine Gedächtnis B-Zellantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern und NiV neutralisierenden Antikörpern. Hinzu kam die Stimulation einer MHC-abhängigen als auch der schnelleren, MHC-unabhängigen zellulären Immunantwort. Hierbei waren es vor allem die MHC-unabhängigen γδT-Zellen, die auf eine Henipa VLP Restimulation hin proliferierten und antivirale Zytokine wie IFN γ und TNF α exprimierten. Von den MHC-abhängigen T-Zellen waren es die CD4+ T-Zellen, die die eben genannten löslichen Mediatoren exprimierten. Die CD8α+CD8β+ T-Zellen (klassische CTL) blieben hingegen nahezu unbeeinflusst. Die sowohl in CD8α+ γδT-Zellen als auch in CD8α+CD4+ T-Zellen nachgewiesene Multifunktionalität in Form einer IFN-γ und TNF-α Koexpression deutet auf die Generierung einer zellulären Gedächtnis T-Zellantwort in Schweinen durch die Mehrfachimmunisierung mit Henipa VLPs hin.
In dieser Arbeit konnte das vielversprechende Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine durch die Induktion sowohl einer humoralen als auch einer zellulären Immunantwort in Mäusen und zum ersten Mal auch in Schweinen herausgestellt werden. In zukünftigen Infektionsversuchen unter BSL-4 Bedingungen muss geklärt werden, inwieweit diese Henipa VLPs in der Lage sind, einen Schutz und eine sterile Immunität gegenüber einer Henipavirus Infektion zu vermitteln.
Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt die Nutzung globaler Transkriptom- und Proteomanalysen zur Untersuchung der Anpassung des Bodenbakteriums Bacillus subtilis an einige in seinem natürlichen Habitat vorherrschende Bedingungen. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass mit Hilfe globaler Transkriptom- und Proteomanalysen auch für bereits intensiv untersuchte Fragestellungen neue und zum Teil unerwartete Aspekte zu entdecken sind. Im Falle der seit ca. 30 Jahren untersuchten Sporulation in B. subtilis konnte eine Reihe von neuen differenziell exprimierten Genen identifiziert werden. Ferner wurden diese Gene den vier an der Sporulation beteiligten Sigmafaktoren zugeordnet. Einige der besonders interessanten Gene wurden einer Detailanalyse unterzogen. Die Analyse der seit Anfang der 90er Jahre auf molekularer Ebene intensiv untersuchten Anpassung von B. subtilis an hohe Osmolaritat führte zur Ausweitung bereits erhaltener Befunde und zur Entdeckung neuer Facetten dieser Adaptationsstrategie. Vergleichbares gilt für die Untersuchung der Anpassung von B. subtilis an schwankende Temperaturen. Die Verwendung globaler Analysen zur Untersuchung der Kälteschockantwort und der Adaptation wachsender Zellen an Kälte und Hitze haben auch hier neue interessante Befunde geliefert. Anhand der hier vorgestellten Ergebnisse wird das Potential globaler Analysen verdeutlicht. Sie ermöglichen Einblicke in das Zusammenspiel der einzelnen Anpassungsmechanismen und liefern entscheidende Hinweise zur Entschlüsselung zellularer Regulationsnetzwerke.
Kunststoffe durchdringen nahezu jeden Bereich unseres alltäglichen Lebens. Zur Herstellung bestimmter Plastikmaterialien (Epoxidharze und Polycarbonate) werden Bisphenole als Grundbaustein benötigt, deren Grundstruktur sich aus zwei Phenolringen zusammensetzt, die über eine substituierte Kohlstoffbrücke miteinander verbunden sind. Die einzelnen Bisphenole unterscheiden sich jeweils durch verschiedene Substituenten an der Kohlenstoffbrücke oder an den aromatischen Ringsystemen. Dabei gehen die großmaßstäbliche Produktion der Bisphenole sowie unser permanenter Kontakt mit bisphenolhaltigen Materialien mit einer verstärkten Nachweisbarkeit dieser Chemikalien in Umweltproben bzw. in menschlichen Geweben und Körperflüssigkeiten einher. Gleichzeitig stehen Bisphenole im Verdacht, aufgrund ihrer Toxizität und hormonähnlichen Wirkung eine Vielzahl von Erkrankungen zu begünstigen. Vor allem die Interaktion mit dem Östrogenrezeptor alpha ist gut verstanden. Daher wurde in dieser Arbeit die bakterielle Transformation von acht verschiedenen Bisphenolen (Bisphenol A, AP, B, C, E, F, PH und Z) durch die Umweltisolate Cupriavidus basilensis SBUG 290 und Bacillus amyloliquefaciens SBUG 1837 untersucht und näher charakterisiert. Beide Bakterienstämme waren in der Lage, alle eingesetzten Bisphenole zu transformieren. Dabei war die Transformation auf die Phenolringe oder daran befindliche Substituenten beschränkt. Ein mikrobieller Angriff an der ringverbindenden Kohlenstoffbrücke wurde nicht nachgewiesen. Während B. amyloliquefaciens die Schadstoffe ungeachtet ihrer Struktur jeweils phosphorylierte, transformierte C. basilensis die Bisphenole in Abhängigkeit von ihrer Struktur zu hydroxylierten Derivaten, Ringspaltungsprodukten, Produkten mit Acetamidstruktur oder zu Dimeren. Neben der Strukturaufklärung der mikrobiell gebildeten Produkte wurden die einzelnen Transformationswege für beide Bakterienstämme näher charakterisiert. Hierfür wurden u.a. die Produkte als Transformationssubstrate eingesetzt, der Einfluss der Kultivierung und Inkubationsmedien auf die Biotransformation untersucht sowie Proteomanalysen durchgeführt. Die Bildung von hydrophileren Transformationsprodukten durch die Bakterienstämme führte zur Detoxifizierung und Reduktion der östrogenen Aktivität der hydrophoben Bisphenole.
Das Bovine Virale Diarrhoe Virus (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. BVDV verursacht eine gefährliche Durchfallerkrankung bei Rindern,
besonders Kälbern, die Bovine Virusdiarrhoe (Mucosal Disease). BVDV gehört zu den einzelsträngigen RNA-Viren und ist eng verwandt mit dem Erreger der Klassischen Schweinepest sowie der Border Disease der Schafe. Wie andere Pestiviren, ist BVDV ein behülltes Virus, auf dessen Hülle drei Strukturproteine (Erns, E1 und E2) zu finden sind. In dieser Arbeit wurden die Glykoproteine E1 und E2 genauer charakterisiert, um Hinweise auf den Mechanismus der Knospung (Budding) von Pestiviren zu erhalten. Dazu ist die subzelluläre Lokalisation, die Topologie sowie der Retentionsmechanismus für E1 und E2 genauer untersucht worden. Die subzelluläre Lokalisation der Hüllproteine wurde mit Hilfe von Kolokalisationsanalysen mit spezifischen Kompartimentmarkerproteinen bestimmt. Sowohl als Einzelexpression als auch nach Expression als E1-E2-Vorläuferprotein zeigte sich eine Anreicherung der beiden Proteine vorwiegend im ER. Die Lokalisationsanalyse E2s in mit verschiedenen BVDV-Stämmen infizierten Zellen zeigte ein sehr ähnliches Bild wie die Einzelexpression. Die, die intrazelluläre Retention vermittelnden, Regionen wurden zunächst mit CD72-Fusionsproteinen eingegrenzt und zeigten, dass die Transmembrandomänen der Proteine für die Retention entscheidend waren.
Anhand verschiedenster Mutanten, welche Substitutionen, Insertionen und Deletionen im Bereich des C-Terminus von CD72-E1 bzw. E2 (ohne CD72-Fusionspartner) beinhalteten,
konnten einzelne Aminosäuren identifiziert werden, die essentiell für die Retention sind oder diese zumindest beeinflussen. Für E2 konnte das Arginin an Position 355 als wichtig für die Retention bestätigt und weiterführend untersucht werden. Mit Mutationen des Glutamins an Position 370 konnte außerdem der modulierende Effekt des cytoplasmatischen Rests auf die Retention E2s gezeigt werden. Die Retention von E1 ist unabhängig von der Länge der TMD und wird durch mehrere polare Aminosäuren (K174, R177, Q182) beeinflusst. Die Topologieuntersuchungen
für E1 und E2 nach Einzelexpression mit Tag-markierter Proteinvarienten zeigte, dass die reifen Proteine eine einspännige Transmembrandomäne mit dem N-Terminus auf der luminalen und dem C-Terminus auf der cytosolischen Seite des ERs besitzen.
Die Serin/Threonin Proteinkinase pUS3 ist innerhalb der Alphaherpesvirinae konserviert. Für pUS3-Homologe der Subfamilie wurden bereits zahlreiche Funktionen bei der Beeinflussung des Zellstoffwechsels und der Virusreplikation gezeigt, dennoch ist pUS3 für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. PrV exprimiert zwei unterschiedlich lange Isoformen dieses Proteins in unterschiedlicher Menge, so dass das kürzere pUS3S im Vergleich zu pUS3L die abundante Isoform darstellt. Während die carboxyterminalen Sequenzen beider Isoformen identisch sind, weist der Amino-Terminus der langen Form 54 zusätzliche Aminosäuren auf. Innerhalb der Wirtszelle liegt pUS3S vor allem im Nukleus vor, wohingegen pUS3L vorwiegend im Zytoplasma, der Plasmamembran und den Mitochondrien lokalisiert ist. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der möglichen unterschiedlichen Funktionen der beiden pUS3-Isoformen und der Bedeutung des Expressionsniveaus dieser Isoformen während der Virusmorphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Analyse von Virusmutanten, bei denen die Expression von pUS3S bzw. pUS3L auf unterschiedliche Weise manipuliert wurde oder bei denen eine Inaktivierung der enzymatischen Aktivität erfolgte. Diese wurden auf empfänglichen Zelllinien dreier Tierarten phänotypisch charakterisiert und auf Unterschiede hinsichtlich ihres Replikationsverhaltens untersucht. Ein weiterer Teil dieser Arbeit umfasste Untersuchungen zur Identifizierung potentieller Substrate der Proteinkinase pUS3 mittels 32P-Radioimmunpräzipitation und Proteomanalytik, die eine weitere Analyse der Strukturkomponenten von PrV-Partikeln sowie die Prüfung einer Methode zur Präparation nukleärer Proteine einschloss.
Bisphenol A (BPA) ist ein Umweltschadstoff, der für die Produktion von Polykarbonatplastik und Epoxydharzen verwendet wird. Aufgrund seiner weltweiten Verbreitung, seiner Persistenz in der Umwelt und vor allen Dingen wegen seiner endokrinen Wirkung, stellt diese Verbindung eine große Gefahr für die Tier- und Pflanzenwelt sowie für den Menschen dar. Deshalb wurde aus einem bepflanzten Festbettreaktor, welcher mit BPA behandelt wurde, der Bakterienstamm RW4 isoliert, der fähig ist Bisphenol A als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. Das Gram-negative Bakterium wurde mittels 16S rRNA-Analyse als Cupriavidus basilensis identifiziert und mittel der BIOLOG-Methode charakterisiert. Der Bakterienstamm kann ein sehr großes Spektrum an aliphatischen Stoffen wie Aceton, Ethanol, 1-Oktanol und aromatischen Verbindungen wie Phenol, Mono- und Dihydroxybenzoesäuren für das Wachstum nutzen. C. basilensis RW4 baut Bisphenol A nur sehr langsam ab. Es ist jedoch möglich den BPA-Abbau sowohl in Schüttelkulturen und als auch in kontinuierlich laufenden Sandsäulen durch Zugabe von Phenol als Co-Substrat und Wachstumsstimulanz deutlich zu steigern. Die erfassten Abbauintermediate wie 4-Hydroxyacetophenon und 2-(4-Propanol)-phenol wiesen darauf hin, dass C. basilensis RW4 einen ähnlichen Abbauweg nutzt wie Sphingomonas sp. TTNP3 von Kolvenbach et al. (2007) nutzt. In weiteren Untersuchungen, wurde die toxische Wirkung von Bisphenol A auf den Standardmikroorganismus Pseudomonas putida P8 in Schüttelkulturen und in kontinuierlich laufenden Sandsäulen analysiert. Es zeigte sich, dass BPA das Wachstum von P. putida P8 hemmt und Modifikationen in der Zusammensetzung der Phospholipide in der Membran hervorruft. P. putida P8 reagierte unmittelbar auf das Einwirken von BPA auf der Membranebene durch Veränderung des Verhältnisses der trans-ungesättigten Fettsäuren zu den cis-ungesättigten Fettsäuren, was schon in früheren Untersuchungen für andere organische Lösungsmittel beschrieben wurde. Dementsprechend wurde eine Korrelation zwischen der BPA-Konzentration und dem Anstieg des trans-cis-Verhältnisses ermittelt. Weil diese Anpassungsreaktion eine kurzfristige Antwort auf den einwirkenden Stressor ist, konnte der Anstieg des trans-cis-Verhältnisses nur kurz nach BPA-Zugabe erfasst werden. Somit kann das trans-cis-Verhältnis nur als temporärer Biomarker für die Toxizität von BPA in Schüttelkulturen genutzt werden, jedoch nicht in langfristig laufenden Sandsäulen.
Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit ergaben sich aus zwei Arbeitsschwerpunkten - dem Nachweis einer neuartigen prokaryotischen Phenoloxidase bei dem Bakterienisolat Azotobacter chroococcum SBUG 1484 und der Durchführung Phenoloxidase-katalysierter Biotransformationsreaktionen zur Derivatisierung von ortho- bzw. para-dihydroxylierten Verbindungen. Der zunächst unbekannte, eine neue Phenoloxidase bildende, Bakterienstamm sollte mittels morphologischer und physiologischer Tests sowie 16S-rDNA-Analysen einer Art zugeordnet werden. Da die Expression der Phenoloxidase nur unter bestimmten Bedingungen auftrat sollten die in Abhängigkeit von verschiedenen Kultivierungsparametern zahlreich auftretenden Zelldifferenzierungsprozesse des Stammes untersucht und eine standardisierte Kultivierungsmethode zur Erzielung hoher Phenoloxidase-Aktivitäten entwickelt werden. Die Untersuchung wesentlicher Eigenschaften der neubeschriebenen Phenoloxidase war für eine Zuordnung in die Gruppe der Multikupfer-Oxidasen und eine Prüfung der Eignung des Enzyms für biotechnologische Anwendungen eine unbedingte Voraussetzung. In Phenoloxidase-katalysierten Reaktionen sollte die Aminierung von einfach alkylsubstituierten Brenzkatechinen und Hydrochinonen sowie mehrfach-substituierten ein- bzw. zweikernigen dihydroxylierten Aromaten mit aliphatischen sowie alicyclischen Amindonoren untersucht werden. Im Mittelpunkt der Betrachtungen standen dabei die Aufklärung von Reaktionsmechanismen bei homo- und heteromolekularen Kopplungsreaktionen sowie die Prüfung des Einflusses verschiedener Reaktionsparameter (u.a. Hydroxylierungspositionen der Enzymsubstrate, Substituenten, Eduktkonzentrationen, Katalysatoren, pH-Werte der Reaktionssysteme, Lösungsmittel) auf die Nebenreaktionen und Ausbeuten der anvisierten Zielverbindungen (sekundäre Amine). Eine strukturchemische Analyse der Syntheseprodukte war dazu unerlässlich.
Die Synthese und der Abbau von mikrobieller Biomasse sind fundamentale biologische Prozesse auf unserer Erde. Im Gegensatz zu zellulären Syntheseleistungen wurde der Eliminierung von mikrobieller Biomasse allerdings bisher weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Die Auflösung von Bakterienzellen wird als Bakteriolyse bezeichnet. Innerhalb von natürlichen Bakteriengemeinschaften wird die Bakteriolyse eingeleitet durch verschiedene mikrobielle Prozesse und wird schließlich durch die Degradation komplexer bakterieller Zellwandbausteine bedingt. Sie ist ein fundamentaler Vorgang zur Energie- und Nährstoffversorgung, sowohl im Rahmen der Saprotrophie, also dem Abbau von toten Bakterienzellen, als auch der Bakterivorie, der Prädation an lebenden Bakterien. Der Prozess der Bakteriolyse ist bei beiden Ernährungstypen abhängig von extrazellulären Enzymen und bioaktiven Metaboliten, die den enzymatischen Angriff ermöglichen oder verstärken und letztlich zur Zerstörung des Zellmaterials beitragen. Bakteriolytische Substanzen und Metaboliten besitzen eine hohe Anwendungsrelevanz, beispielsweise für die Zurückdrängung von Bakterien in vielen verschiedenen Bereichen des Lebens und werden in Anbetracht der weltweit steigenden Verbreitung von Krankheits- und Schaderregern sowie von Antibiotikaresistenzen dringend benötigt. Um Zugang zu neuen antimikrobiellen Substanzklassen zu erhalten, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit 35 stark bakteriolytische Bakterienisolate aus Brackwasser gewonnen und charakterisiert, darunter 31 von verschiedenen Probenahmeorten der Ostsee und 4 aus dem brackwasserhaltigen Bereich des Balchaschsees in Kasachstan. Alle bakteriolytischen Isolate wurden morphologisch und physiologisch charakterisiert. Eine Auswahl bakteriolytischer Stämme wurde zusätzlich taxonomisch identifiziert. Von den bakteriolytischen Umweltisolaten aus der Ostsee konnten zehn Stämme eindeutig den vier Bacillus-Arten B. pumilus, B. subtilis, B. megaterium und B. licheniformis zugeordnet werden (Brack et al. 2013). Unter den Isolaten aus dem Balchaschsee wurden drei Stämme als Pseudomonas veronii und ein Stamm als Paenibacillus apiarius identifiziert. Die Isolate aus dem Balchaschsee zeichneten sich durch eine starke Lyseaktivität gegenüber lebenden Zellen von Pseudomonas putida, Escherichia coli, Micrococcus luteus und Arthrobacter citreus aus und waren zum Teil in der Lage, auch autoklavierte Zellen dieser Arten zu degradieren. Für das Isolat Paenibacillus apiarius SBUG 1947 wurde nach Analyse von Wachstumskurven und elektronenmikroskopischen Aufnahmen eine besonders deutliche Lyseaktivität gegenüber lebenden Zellen von A. citreus in Flüssigkultur nachgewiesen (Brack et al. 2014c). In einem umfangreichen systematischen Screening über die bakteriellen Isolate aus der Ostsee zeigten ausgewählte Bacillus-Stämme aller vier identifizierten Arten lytische Aktivitäten gegenüber lebenden Zellen von grampositiven und gramnegativen Bakterien der Arten Arthrobacter citreus, Micrococcus luteus und Pseudomonas putida sowie zum Teil gegenüber Hefen wie Trichosporon mucoides. Diese und weitere Mikroorganismen wie Aeromonas sp., Bacillus subtilis, Chromobacterium violaceum, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa und Serratia marcescens wurden in Form von autoklavierten und pasteurisierten Zellen ebenfalls durch die Bacillus-Stämme lysiert (Brack et al. 2013). Das stark bakteriolytische Isolat B. pumilus SBUG 1800 zeigte zudem in Flüssigkultur eine deutliche Bakteriolyseaktivität gegen pasteurisierte und lebende Zellen von A. citreus, wobei selbst ein geringes Inokulum von B. pumilus zu einer raschen Abtötung sowie Auflösung der Wirtszellen führte, wie in Wachstumsversuchen und mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Aufnahmen gezeigt werden konnte. Die stärkste Lyseaktivität gegenüber lebensfähigen A. citreus-Zellen konnte nach 3,5 bis 4,5 Stunden der Inkubation in Co-Kultur mit verdünnter Nährbouillon beobachtet werden. Um den Bakteriolyseprozess genauer zu charakterisieren, wurden im Folgenden Veränderungen im extrazellulären Metabolom und Proteom unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht. So wiesen die zellfreien Kulturüberstände von B. pumilus SBUG 1800, coinkubiert mit pasteurisierten Zellen von A. citreus, nachweislich eine starke bakteriolytische Aktivität auf, was auf die Anwesenheit von extrazellulären Lysefaktoren hindeutete. Diese lytischen Faktoren sollten mit Hilfe von analytischen Messmethoden nachgewiesen und biochemisch charakterisiert werden. Mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurden im Kulturüberstand von B. pumilus SBUG 1800, inkubiert in Gegenwart von pasteurisierten Zellen von A. citreus, verschiedene 2,5 Diketopiperazine detektiert. Hierdurch gelang der erste wissenschaftliche Nachweis der Sekretion der Diketopiperazine Cyclo(-Ala-Pro), Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Val-Pro), Cyclo( Ile-Pro), Cyclo(-Leu-Pro), Cyclo(-Pro-Pro), Cyclo (-HyP-Pro), Cyclo (-Pro-Met) und Cyclo(-Phe-Pro) durch das Umweltisolat B. pumilus SBUG 1800 aus der Ostsee sowie auch durch den Laborstamm B. pumilus SBUG 1921 (auch B. pumilus Jo2). Beide Stämme reagierten nach 4 h der Inkubation in einem Mineralsalzmedium mit einer erhöhten Produktion der Diketopiperazine Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Ala-Pro) und Cyclo(-Val-Pro) auf das Vorhandensein pasteurisierter A. citreus-Zellen. Auch in zehnfach verdünnter Nährbouillon wurden diese Diketopiperazine produziert. Die detektierten antimikrobiellen Diketopiperazine wiesen gegenüber verschiedenen Teststämmen eine Hemmwirkung auf, die bereits bei sehr geringen Konzentrationen von 1 µg ml-1 einsetzte. Für die Diketopiperazine konnte jedoch keine bakteriolytische Funktion nachgewiesen werden, weder gegenüber lebenden noch gegenüber abgetöteten Bakterienzellen (Brack et al. 2014a). Sie wirken daher als Stoffwechsel inaktivierende Vorstufe für einen nachfolgend einsetzenden bakteriolytischen Prozess. Um den unbekannten Lysefaktor aus dem zellfreien Überstand von B. pumilus SBUG 1800 zu identifizieren, wurde unter anderem die Lipopeptid-Fraktion der Zellen gewonnen und mittels LC-MS analysiert. Dabei wurden neun verschiedene Pumilacidine, darunter zwei bislang unbeschriebene Lipopeptide mit den Molekülmassen 1007 und 1021, detektiert. Da die Lipopeptidextrakte lebende Wirtzellen lysierten, können die Pumilacidine als eine erste Gruppe von wirksamen Lysefaktoren im untersuchten Prädator-Wirt-System angesehen werden. Die Konzentration der Pumilacidine ist ähnlich der Diketopiperazin-Konzentration nach vier Stunden der Inkubation in verdünnter Nährbouillon höher in Anwesenheit von pasteurisierten oder lebenden Zellen von A. citreus als im Kontrollmedium ohne Wirtszellen. Neben den antimikrobiellen Diketopiperazinen und den bakteriolytischen Pumilacidinen konnte mittels Gelelektrophorese die bakteriolytische Wirksamkeit einer großen Bandbreite von extrazellulären Enzymen aus B. pumilus SBUG 1800 nachgewiesen werden. Zwei der bakteriolytisch wirksamen Enzyme konnten mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden als die Zellwandhydrolasen N-Acetylmuramoyl-L-Alaninamidase und β N Acetylglukosaminidase identifiziert werden (Brack et al. 2014b). Im Kontext der aktuellen Fachliteratur deuten die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass Bacillus-Arten sich als Intragilden-Prädatoren in das marine mikrobielle Nahrungsnetz einordnen lassen. Bei Nahrungsmangel, vergleichbar mit dem Wachstum in der vielfach verwendeten, zehnfach verdünnten Nährbouillon, greift B. pumilus benachbarte Mikroorganismen an, um diese als Nährstoff- und Energiequellen für das eigene Überleben zu nutzen durch die damit verbundene Lyse von Nahrungskonkurrenten den Prozess der eigenen Sporulation zu retardieren. Der Vorgang der Bakteriolyse im untersuchten Prädator-Wirt-System läuft dabei nach dem dargelegten Kenntnisstand folgendermaßen ab. In der Co-Kultur wird das Wachstum der Wirtsbakterienart A. citreus durch neun verschiedene Diketopiperazine mit antibakterieller Wirksamkeit inhibiert. Die Gesamtkonzentration der Diketopiperazine liegt bei über 80 µg ml-1. Gleichzeitig verursachen die ausgeschiedenen Pumilacidine A bis I als Hauptfaktoren der Bakteriolyse die initiale Zellpermeabilisierung, und den Zelltod der Wirtsbakterien, wahrscheinlich bedingt durch eine Desintegration von Membranstrukturen, woraufhin der austretende Zellinhalt im Medium verfügbar wird. Für die Degradation der freiwerdenden makromolekularen Nährstoffe sekretiert B. pumilus ein breites Spektrum von verschiedenen hydrolytischen extrazellulären Enzymen, welche die komplexen Zellbestandteile zu metabolisierbaren Oligomeren und Monomeren zersetzen (Brack et al. 2014b). Auf der Grundlage der neuen Erkenntnisse über den Hergang der Bakteriolyse im ausgewählten Prädator-Wirt-System können neue, anwendungsrelevante Ansätze für die Zurückdrängung von schädlichen Mikroorganismen abgeleitet werden. Neben der detailliert untersuchten Art Bacillus pumilus stehen weitere lytische Bakterien zur Verfügung, deren Wirkstoffe und lytische Enzyme, ein großes Potential zur Zerstörung von mikrobiellen Zellen und
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet.
Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt.
Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen.
Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben.
Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert.
Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität.
In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.
The aim of this work was to characterize the distribution of TULV in European common vole populations, to clarify the host association of TULV and to investigate correlations between host population dynamics and changes in TULV prevalence. Furthermore, the potential of common voles as reservoir for other rodent-borne pathogens was examined in comparison to other rodent species.
Molecular and serological analysis of rodents captured at 87 locations in Germany, France, Luxembourg, and Austria revealed TULV infections at 53.6 % of all trapping locations. The seroprevalence in common voles was low with a mean of 8.5 % (range: 0 – 19 %). TULV RNA was more often detected (mean: 15.3 %, range 0 - 37.5 %). Field voles (Microtus agrestis) and water voles (Arvicola amphibius) were less often tested positive for TULV: mean seroprevalence was 7 % for field voles and 6.7 % for water voles. RNA could be detected in 5.4 % of all tested field voles and 3.2 % of water voles and with exception of a single field vole only when TULV-RNA-positive common voles were trapped at the same location. Those results indicate that TULV infections of field and water voles are spillover infections from sympatric TULV-infected common voles. Phylogenetic analysis revealed distinct genetic differences between TULV sequences of regions of greater geographical distance which were associated with different evolutionary common vole lineages. Furthermore, we could detect genetic differences between TULV strains from trapping sites close to each other (ca. 10 km).
In a capture-mark-recapture study 1042 common voles captured in live traps in Germany were sampled as well as 225 captured in snap traps. When analyzing the seroprevalence of fluctuating common vole populations over several years and seasons we found a negative correlation between prevalence and population density in the current season but a delayed density-dependent positive correlation between the current population density and seroprevalence in the next season. However, this trend varied geographically between the four trapping locations. Usually, population density as well as seroprevalence peaked at the end of the reproductive period in autumn with the exception of Weissach (2010-2012), Jeeser (2010) and Gotha (2012) where population peaks in summer were observed.
In a pilot study in Austria common voles were captured as well as three other rodent species. They were investigated not only for presence of different viruses (TULV, Dobrava- Belgrade orthohantavirus (DOBV), Puumala orthohantavirus (PUUV), Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus (LCMV), Cowpox virus (CPXV)) but also pathogenic bacteria and endoparasites (Leptospira spp., Toxoplasma gondii, Borrelia afzelii, Coxiella burnetii, Rickettsia spp. und Bartonella spp.). Of all four captured species, common voles were most often infected with at least one pathogen (66.7 %), followed by wood mice (Apodemus sylvaticus) (57.7 %), bank voles (Myodes glareolus) (35 %) and yellow-necked field mice (Apodemus flavicollis) (34.5 %). Common voles were also exceptionally susceptible to multiple infections: 66.7 % of them were infected with two or three different pathogens, compared to 6.9 % of yellow-necked field mice and 2.5 % of bank voles. No multiple infections could be detected in wood mice.
The broad geographic distribution of TULV in its reservoir host is in contrast to the rare reports of human infection but might be explained with a low pathogenicity for humans or with the low prevalence in host populations. In addition, the rare detection of human TULV infections could be a result of the used diagnostic methods. Since the reservoir population is known for its dramatic changes in population density and recurring superabundances which facilitates frequent contact to humans, TULV should more often be considered as cause for human disease in future analysis. In
addition, several other zoonotic pathogens could be detected in common voles which could influence TULV infections in the reservoir host but also TULV transmission to humans and therefore deserve more attention in future research.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
The thyroid gland is of crucial importance in human metabolism. Its main secretion products, L-thyroxine (T4) and 3,3’,5-triiodo-L-thyronine (T3), are essential for proper development of multiple tissues and organs as well as for their functioning in the adult organism. The secretion of thyroid hormones (TH) is stimulated by thyrotropin (TSH) released from the pituitary gland. This tight connection between both hormones is of crucial importance for the clinical diagnosis of thyroid dysfunction. During the last two decades the concept of TH action developed to increased complexity. However, most of the recent advances in the field of TH research are based either on cell culture, tissue or animal models or stem from studies investigating specific hypotheses in humans. Thus, experimental approaches for the comprehensive, hypothesis-free characterization of metabolic effects of classical and non-classical TH in human are urgently needed. This holds true in particular for the TH derivative 3,5-diiodothyronine (3,5-T2). It was described to alleviate the typical detrimental metabolic consequences of a high-fat diet and even reversed hepatic steatosis. To replicate these experimental findings from rodents in humans, comprehensive data from the population-based Study of Health in Pomerania (SHIP) was analyzed in the present work. Based on a euthyroid, diabetes-free SHIP-subsample (N=761), non-linear associations between the serum concentrations of 3,5-T2 and glucose as well as TSH were detected. In contrast, no significant 3,5-T2 associations with several anthropometric markers or blood lipid parameters were observed, partially questioning the transferability of the beneficial metabolic 3,5-T2 effects reported for pharmacological intervention studies on rodents to humans. Recent advances in technological development now allow for the use of high-throughput spectrometric platforms to characterize the small molecule content (metabolome) of blood and urine samples. The detected metabolome constituents can be associated with any relevant parameters of interest, thereby extending the scope of classical association studies. Therefore, in the second part of the present thesis, the metabolic fingerprints of FT4, TSH as well as the ratio log(TSH)/FT4 as markers of thyroid function were profiled. Strong differences between the metabolic fingerprints of FT4 and TSH were observed, partially alleviated by the log(TSH)/FT4 ratio. These findings not only emphasize the high diagnostic value of the combined evaluation of TSH and FT4 in the assessment of thyroid function but additionally argue for a holistic approach in the diagnosis of thyroid function. More moderate endogenous effects of 3,5-T2 were evaluated by comparing its urinary metabolic fingerprint with that of the classical TH. A number of associations became apparent, indicating a function of endogenous 3,5-T2 in intermediary metabolism. Besides partially confirming associations with respect to the presented findings in animal studies, the strongest 3,5-T2-association was observed with trigonelline, a metabolite described earlier to exhibit similar beneficial effects as 3,5-T2 on glucose metabolism when used as a pharmacological agent in animal studies. An association towards hippurate indicated a partial overlap with the metabolic profile of TSH and hence consolidated results from the first two projects in the sense of a thyromimetic role of 3,5-T2 in the feedback regulation of TH. The diagnosis of thyroid disorders based on the classical markers TSH and FT4 suffers from restricted sensitivity in the subclinical range as both parameters have broad reference ranges in the general population. Therefore, in an approach to detect novel peripheral biomarkers of thyroid function, sixteen healthy young men were challenged with 250 µg of levothyroxine (L-T4) over a period of eight weeks in the fourth project presented here as part of this thesis. Monitoring of the volunteers over a period of sixteen weeks allowed delineation of the metabolic shifts first towards thyrotoxicosis and later in the context of the restoration of euthyroidism. The use of mass spectrometry for the comprehensive characterization of the metabolite as well as the protein content of samples taken at the different time points revealed profound molecular alterations, despite the lack of any clinical symptoms in the volunteers. Molecular signatures of thyrotoxicosis indicated increased energy expenditure, pronounced defense against systemic oxidative stress, a general drop in apolipoproteins, as well as increased abundances of proteins related to the coagulation cascade and the complement system. Good and robust classification of the thyroid state independent of TSH and FT4 was achieved using random forest analysis with a subset of fifteen metabolites and proteins, indicating new options in the individualized diagnosis of thyroid disorders.
Type I interferonopathies cover a phenotypically heterogeneous group of rare genetic diseases including the recently described proteasome-associated autoinflammatory syndromes (PRAAS). By definition, PRAAS are caused by inherited and/or de novo loss-of-function mutations in genes encoding proteasome subunits such as PSMB8, PSMB9, PSMB7, PSMA3, or proteasome assembly factors including POMP and PSMG2, respectively. Disruption of any of these subunits results in perturbed intracellular protein homeostasis including accumulation of ubiquitinated proteins which is accompanied by a type I interferon (IFN) signature. The observation that, similarly to pathogens, proteasome dysfunctions are potent type I IFN inducers is quite unexpected and, up to now, the underlying molecular mechanisms of this process remain largely unknown. One promising candidate for triggering type I IFN under sterile conditions is the unfolded protein response (UPR) which is typically initiated in response to an accumulation of unfolded and/or misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) (also referred to as ER stress). The recent observation that the UPR is engaged in subjects carrying POMP mutations strongly suggests its possible implication in the cause-and-effect relationship between proteasome impairment and interferonopathy onset. The purpose of this present review is therefore to discuss the possible role of the UPR in the pathogenesis of PRAAS. We will particularly focus on pathways initiated by the four ER-membrane proteins ATF6, PERK, IRE1-α, and TCF11/Nrf1 which undergo activation under proteasome inhibition. An overview of the current understanding of the mechanisms and potential cross-talk between the UPR and inflammatory signaling casacades is provided to convey a more integrated picture of the pathophysiology of PRAAS and shed light on potential biomarkers and therapeutic targets.
Coding constraints imposed by the very small genome sizes of negative-strand RNA viruses (NSVs) have led to the development of numerous strategies that increase viral protein diversity, enabling the virus to both establish a productive viral replication cycle and effectively control the host antiviral response. Arenaviruses are no exception to this, and previous findings have demonstrated that the nucleoprotein (NP) of the highly pathogenic Junín virus (JUNV) exists as three additional N-terminally truncated isoforms of 53 kD (NP53kD), 47 kD (NP47kD), and 40 kD (NP40kD). The two smaller isoforms (i.e. NP47kD and NP40kD) have been characterized as products of caspase cleavage, which appears to serve a decoy function to inhibit apoptosis induction. However, whether they have additional functions in the viral replication cycle remains unknown. Further, the origin and function of NP53kD has not yet been described.
In order to first identify the mechanism responsible for production of the NP53kD variant, a possible role of additional caspase cleavage sites was first excluded using a site mutagenesis approach. Subsequently, alanine mutagenesis was then used to identify a region responsible for NP53kD production. As a result, three methionine residues were identified within the characterized sequence segment of NP, linking the production of NP53kD to an alternative in-frame translation initiation. Further site-directed mutagenesis of the previously identified putative in-frame methionine codons (i.e. M78, M80 and M100) finally led to the identification of translation initiation at M80 as being predominantly responsible for the production of NP53kD. Once the identity of all three NP isoforms was known, it was then of further interest to more deeply characterize their functional roles. Consistent with the N-terminal domain containing RNA binding and homotrimerization motifs that are relevant for the viral RNA synthesis process, it could be demonstrated that all three truncated NP isoforms lost the ability to support viral RNA synthesis in a minigenome assay. However, they also did not interfere with viral RNA synthesis by full-length NP, nor did they affect the ability of the matrix protein Z to inhibit viral RNA synthesis. Moreover, it was observed that loss of the oligomerization motifs in the N-terminus also affected the subcellular localization of all three NP isoforms, which were no longer localized in discrete perinuclear inclusion bodies, but rather showed a diffuse distribution throughout the cytoplasm, with the smallest isoform NP40kD also being able to enter the nucleus. Surprisingly, the 3'-5' exonuclease function of NP, which is associated with the C-terminal domain and plays a role in inhibiting interferon induction by digestion of double-stranded RNAs, was found to be retained only by the NP40kD isoform, despite that all three isoforms retained the associated domain. Finally, previous studies using transfected NP and chemical induction of apoptosis have suggested that cleavage of NP at the caspase motifs responsible for generating NP47kD and NP40kD plays a role in controlling activation of the apoptosis pathway. Therefore, to further characterize the connection between the generation of NP isoforms and the regulation of apoptosis in a viral context, recombinant JUNVs deficient in the respective isoforms were generated. Unlike infections with wild-type JUNV, mutations of the caspase cleavage sites resulted in the induction of caspases activation. Surprisingly, however, this was also the case for mutation of the alternate start codon responsible for NP53kD generation.
Taken together, the data from this study suggest a model whereby JUNV generates a pool of smaller NP isoforms with a predominantly cytoplasmic distribution. As a result of this altered localization, NP53kD appears to be able to serve as the substrate for further generation of NP47kD and NP40kD by caspase cleavage. Not only does this cleavage inhibit apoptosis induction during JUNV infection, it also results in a cytoplasmic isoform of NP that retains strong 3'-5' exonuclease activity (i.e. NP40kD) and thus may play an important role in preventing viral double-stranded RNA accumulation in the cytoplasm, where it can lead to activation of IFN signaling. Overall, such results emphasize the relevance of alternative protein isoforms in virus biology, and particularly in regulation of the host response to infection.
Introduction: Inhibition of androgen synthesis by abiraterone acetate (AA) entails enhanced overall survival rates and clinical benefit for patients with locally advanced and metastasized prostate cancer (PC). The expression of heat shock protein 27 (HSP27) is generally associated with cytoprotection and was demonstrated to mediate chemoresistance under cytostatic therapy, for instance, docetaxel treatment. In this study, we investigated the impact of AA treatment on HSP27 expression and PC cell growth. Materials and Methods: HSP27 expression levels in docetaxel and AA-treated PC cell lines LNCaP and PC-3 were determined by SDS PAGE and Western blot analysis. Proliferation assays were performed using a CASY Cell Counter and Analyzer Model TT (Roche Applied Science). Results: Despite significantly increased HSP27 expression in PC cells incubated with docetaxel, Western blot analysis implicated a significant reduction of the cytoprotective HSP27 in AA-treated PC cells. Notably, HSP27 stably overexpressed in PC-3-HSP27 cells did not appear as an HSP27-mediated proliferation benefit in the presence of AA as shown in docetaxel incubation studies. Conclusion: In contrast to repeatedly demonstrated HSP27-driven chemoresistance related to chemotherapeutics, our results may constitute a broader molecular mode of action of AA chemotherapy. AA efficacy may exert an HSP27 suppressive role that goes beyond the primarily assumed inhibition of androgen biosynthesis.
Degradation of branched chain aliphatic and aromatic petroleum hydrocarbons by microorganisms
(2008)
The overall aim of the work was to investigate the ability of several Gram-positive bacteria including Mycocbacterium neoaurum SBUG 109, Nocardia cyriacigeorgica SBUG 1472 and Rhodococcus ruber SBUG 82 and the yeast Trichosporon mucoides SBUG-Y 801 to degrade and transform branched chain hydrocarbons which occur in petroleum and its fraction products such as gasoline or gas oil and which are known as important and recalcitrant environmental pollutants. Pristane, iso-pentylbenzene and sec-octylbenzene were used in this work as model compounds. These compounds represent significant groups of petroleum constituents (branched chain alkanes and aromatic hydrocarbons). Three bacteria and the yeast T. mucoides SBUG-Y 801 were selected in a screen of 16 hydrocarbon-utilizing strains in the SBUG collection and from 21 isolated hydrocarbon-utilizing strains from oil-contaminated habitats of Saudi Arabian Desert and of Vietnam. The bacteria were identified in cooperation with DSZM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) as M. neoaurum SBUG 109, N. cyriacigeorgica SBUG 1472, R. ruber SBUG 82. These bacterial and yeast strains were shown to possess high potential for degrading and transforming pristane, iso-pentylbenzene and sec-octylbenzene. The intermediates produced by these bacteria during incubation with pristane were analyzed by GC and GC/MS. The products 4-methyl pentanoic acid; methyl butanedioic acid; 2-methyl pentadioic acid; methyl propanedioic acid; 4-methyl heptanedioic acid and 2,6,10,14–tetramethyl-pentadecan–3–one were detected in M. neoaurum cultures. In R. ruber, methyl butanedioic acid; 2-methyl pentadioic acid; 4,8-dimethylnonanoic acid, 4-methyl heptanedioic acid; 2,6,10–trimethylundecanoic acid; 3,7-dimethyl decanedioic acid and 2,6,10,14–tetramethyl–pentadecan–3-one were identified. In N. cyriacigeorgica, 2-methylpentanedioic acid; 4,8-dimethylnonanedioic acid; 2,6-dimethylheptanedioic acid and pristanic acid were found. The detection of 11 intermediates during pristane degradation by the three Gram-positive bacteria provided sufficient information to elucidate in detail three degradative pathways of pristane involving mono-, di- and sub-terminal oxidations. The sub-terminal oxidation by M. neoaurum and R. ruber was demonstrated for the first time. This occurence of a sub-terminal oxidation in these strains was strengthened by further results of aromatic compounds transformation (see below). During this pathway, ketone mono-oxygenation reactions seem to be involved. Because of this it will be of interest to look more closely at the catalytic processes involved and their possible extension to the bio-degradation of other branched chain hydrocarbons. Since in the present study 59 %, 51 % and 84 % of pristane were degraded in 3 weeks by M. neoaurum, R. ruber and N. cyriacigeorgica, this illustrated that the degradation rates of this isoprenoid alkane were high. The bacteria we studied were not only effective degraders of multiple branched chain alkane but also useful transformers of aromatic hydrocarbons. The intermediates produced were analyzed by comparing the retention times and UV/Vis spectra of the HPLC elution profile as well as the retention times and mass spectra of the GC/MS with those of available standards. Using iso-pentylbenzene as a substrate, 8 metabolites were generated by M. neoaurum transformation including product A (phenylacetic acid), B (acetophenone), D (iso-valerophenone), E (succinic acid), F (benzoic acid), G [(2-hydroxy-phenyl)-acetic acid] and H (2-methyl-4-phenyl-butyric acid). We additionally identified an alkyl hydroxylated iso-pentylbenzene derivative as 2-methyl-4-phenyl-butan-2-ol or 2-methyl-4-phenyl-butan-1-ol. Two metabolites (C and D) were detected by N. cyriacigeorgica transformation and three metabolites (A, D and F) were identified by R. ruber transformation which led to the complete biotransformation of this substance. iso-Pentylbenzene transformation by M. neoaurum was initiated by attack on the alkyl side chain followed by ring cleavage. The appearance of iso-valeorophenone confirmed the occurrence of a sub-terminal oxidation mechanism in M. neoaurum and R. ruber. In addition to products A, C, D and G, the identification X-(3–methyl–butyl)-phenol (X means that position of the hydroxy group on the aromatic ring system, such as 2, 3 or 4 remained unclear) in T. mucoides cultivation demonstrated for the first time the capacity of alkyl side chain attack by this organism which was hitherto known only for its ability of ring cleavage. The detection of 15 degradation products of sec-octylbenzene (including 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, ß-methylcinnamic acid, 5-phenylhexanoic acid, acetophenone, 2-hydroxy-acetophenone, 2,3-dihydroxy-benzoic acid, succinic acid, 7-phenyloctan-2-one, benzoic acid, phenylacetic acid, 7-phenyl-octan-2-ol, hydroxy-phenylacetic acid and 2-hydroxybenzoic acid), in the studied bacteria pointed to an effective sec-octylbenzene degradation pathway in which dehydrogenation of 3-phenylbutyric acid to form ß-methylcinnamic acid is a newly described option. The identification of 2-phenylpropionic acid and 3-phenylbutyric acid in sec-octylbenzene transformation experiments by T. mucoides confirmed the possibility of alkyl side chain attack by this yeast. Summarizing the results, we describe for the first time in detail the biotransformation of sec-octylbenzene by M. neoaurum, N. cyriacigeorgica, R. ruber and T. mucoides. Our results suggest that these microorganisms may be useful as potential strains for hydrocarbon degradation and it may be of interest to investigate their suitability to solve specific environmental pollutant problems associated with branched chain aliphatic and alkyl-branched compounds which contribute to the persistence of hydrocarbon fractions in the environment.
The anaerobic bacterium Clostridioides difficile represents one of the most problematic pathogens, especially in hospitals. Dysbiosis has been proven to largely reduce colonization resistance against this intestinal pathogen. The beneficial effect of the microbiota is closely associated with the metabolic activity of intestinal microbes such as the ability to transform primary bile acids into secondary ones. However, the basis and the molecular action of bile acids (BAs) on the pathogen are not well understood. We stressed the pathogen with the four most abundant human bile acids: cholic acid (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA) and lithocholic acid (LCA). Thin layer chromatography (TLC), confocal laser scanning microscopy (CLSM), and electron microscopy (EM) were employed to track the enrichment and destination of bile acids in the bacterial cell. TLC not only revealed a strong accumulation of LCA in C. difficile, but also indicated changes in the composition of membrane lipids in BA-treated cells. Furthermore, morphological changes induced by BAs were determined, most pronounced in the virtually complete loss of flagella in LCA-stressed cells and a flagella reduction after DCA and CDCA challenge. Quantification of both, protein and RNA of the main flagella component FliC proved the decrease in flagella to originate from a change in gene expression on transcriptional level. Notably, the loss of flagella provoked by LCA did not reduce adhesion ability of C. difficile to Caco-2 cells. Most remarkably, extracellular toxin A levels in the presence of BAs showed a similar pattern as flagella expression. That is, CA did not affect toxin expression, whereas lower secretion of toxin A was determined in cells stressed with LCA, DCA or CDCA. In summary, the various BAs were shown to differentially modify virulence determinants, such as flagella expression, host cell adhesion and toxin synthesis. Our results indicate differences of BAs in cellular localization and impact on membrane composition, which could be a reason of their diverse effects. This study is a starting point in the elucidation of the molecular mechanisms underlying the differences in BA action, which in turn can be vital regarding the outcome of a C. difficile infection.
The following work is describing the development of two innovative biosensors for the detection of biologically relevant molecules in the field of ecology and medical diagnostics. Biosensors have the particularity to possess a biological partner which recognizes the target molecule and a physical detection method responsible for the transformation of this biological interaction into measurable information. In the present case, both biosensors are designed following the same strategy and use a recombinant produced human receptor as biological partner and the surface plasmon resonance (SPR) technique to transform the biological interaction in quantitative information. The progesterone biosensor is aimed to detect and quantify substances with affinity to the human progesterone receptor. The recent discoveries that some chemicals present in low quantities in the ecosystem called endocrine disrupting chemicals (EDCs) have a negative impact on the aquatic life fitness raised concerns about the effects of these same molecules to the human health. In order to assess the effects of these EDCs, the use of classical analytical detection methods like high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography (GC) is not sufficient as these techniques only quantify a defined molecule without giving information about its biological activity. By integrating a recombinant human progesterone receptor, the progesterone biosensor can determine the biological activity of an unknown molecule or of a mixture of molecules in a real sample. In this work, two different yeasts – one methylotrophic (Hansenula polymorpha) and one non-methylotrophic (Arxula adeninivorans) - were selected as host for the recombinant protein production and their performances were compared. Different purification strategies were assayed and the binding activity of the purified progesterone receptor was then confirmed by enzyme like receptor assay (ELRA) and SPR. This led to the design of a first version of the biosensor with the immobilization of a progesterone-BSA ligand to the surface of a SPR chip and the use of a progesterone receptor mixed with the target molecule as sample. This competitive assay format was successfully utilized with a commercial progesterone-BSA ligand as target molecule and the next step will be the adaptation of this biosensor for real samples measurements. The HER-2 biosensor was developed as an answer for one of the most critical issue in the field of breast cancer diagnostics. In approximately 30 % of cancer cases, the transmembrane protein HER-2 can be found in large amount at the surface of the carcinoma cells and these cases are known to be particularly aggressive. Based on the amount of HER-2 protein at the surface of the cells, the pathologists established a scale with four levels to adapt the treatment to each patient. Although effective therapies have been developed to treat the HER-2 positive breast cancer, one of the major challenges remains the classification of breast sample in this scale as the only accepted determination methods are immunohistochemistry (IHC) and fluorescent in situ hybridization (FISH) which are only qualitative. In this work, a biosensor has been designed to quantify the amount of the HER-2 protein in a crude cell extract from a breast cancer tissue sample. To achieve this, the strategy is to utilize an antibody specifically targeted against the HER-2 protein and bound to a SPR chip. As the development of this biosensor necessitated the use of large amount of purified HER-2 protein, it was decided to produce recombinant full-length HER-2 in two different yeasts and to purify it by chromatography. This recombinant protein production required particular attention due to the membrane localization of HER-2. The structural integrity of the recombinant protein was confirmed by Western Blot and ELISA and different antibodies were bound to SPR chips in order to detect the HER-2 protein. After finding the conditions giving an optimal SPR signal, a protocol was developed to extract native HER-2 from breast tissue sample and the biosensor was assayed with this crude cell extract.
The genus Capripoxvirus of the family Poxviridae consists of the species lumpy skin disease virus, sheeppox virus and goatpox virus that affect cattle, sheep and goats, respectively. Whereas lumpy skin disease virus (LSDV) is transmitted mainly mechanically via blood-feeding insects and possibly hard ticks, the major transmission routes of sheeppox virus (SPPV) and goatpox virus (GTPV) are via direct contact and aerosols. Affected animals develop fever and display clinical signs such as ocular and nasal discharge, lymphadenopathy and characteristic lesions of the skin. Severe clinical course, especially in combination with respiratory signs, can result in the death of the affected animals. In endemic regions, mortality of capripox virus-induced diseases is low (1-10%). However, mortalities of up to 75% have been reported for LSDV and up to 100% for SPPV and GTPV in exotic breeds and high-producing dairy or beef animals. The loss of quality of the leather, reduced weight gain and milk yield as well as complete loss of affected animals have severe impact on national and global economies. Therefore, capripox virus-induced diseases have significant impact on both the affected individual animal as well as on the existence of small-scale farmers and large agricultural enterprises. However, until now, only live attenuated vaccines are commercially available. These attenuated vaccines are not authorized in the European Union and their administration would comprise the disease-free status of the respective country. Thus, reliable diagnostic tools for the detection and characterization of capripox viruses as well as safe and efficient control measures are of high importance.
The objectives of the present thesis were the development, validation and comparison of diagnostic tools, the establishment of challenge infection models and the performance of pathogenesis studies for all three capripox virus species, and the development and testing of different inactivated prototype vaccine candidates against LSDV.
First, new real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays for robust detection and differentiation of LSDV field strains, LSDV vaccine strains, SPPV and GTPV were developed and extensively validated. In the following, two single assays were combined to duplex assays, one for the differentiation between LSDV field strains and LSDV vaccine strains, and the second for discrimination of SPPV and GTPV. Finally, a diagnostic workflow based on these new duplex assays in combination with already published methods was established. This workflow enables time-saving, robust and reliable detection, species-specific identification and genetic and phylogenetic characterization of all three capripox virus species. In addition, already existing serological examination methods (serum neutralization assay and commercial enzyme-linked immunosorbent assay) were compared regarding their sensitivity and specificity. Furthermore, pathogenesis studies with different capripox virus isolates were performed in the respective target species, and the suitability of selected virus isolates as challenge viruses for future vaccine studies was analyzed. Pathogenesis studies with isolates GTPV-“V/103” and LSDV-“Macedonia2016” revealed that both are proper candidates for challenge models. Finally, three different SPPV isolates (SPPV-“V/104”, SPPV-“India/2013/Surankote” and SPPV-“Egypt/2018”) were tested in sheep regarding their virulence to find a suitable challenge model for SPPV, and SPPV-“India/2013/Surankote” was chosen for future vaccine studies.
Once appropriate challenge models were established, different inactivated prototype vaccines against LSDV were developed, and vaccine safety as well as vaccine efficacy were tested in cattle. Eventually, a Polygen-adjuvanted inactivated LSDV-vaccine candidate was selected that is able to fully prevent cattle from any LSDV-related clinical signs after severe challenge infection. Furthermore, molecular and serological data indicate that this inactivated prototype vaccine is even able to induce a kind of “sterile immunity” against LSDV in those cattle. It has to be mentioned that a commercially available vaccine similar to this prototype vaccine would be a great advance for the control of LSDV.
In the future, additional studies addressing diagnostics and optimized control of capripox viruses should be performed. Firstly, probe-based real-time qPCR assays for the differentiation of SPPV and GTPV vaccine strains from their respective virulent field strains should be developed and included into the diagnostic workflow. Secondly, further tests of the inactivated prototype vaccine, e.g. determination of the minimum protective dose and the possibility of cross-protection in sheep and goats against SPPV and GTPV, respectively, should be performed.
Die McsB Argininkinase spielt in grampositiven Bakterien wie Bazillen, Staphylokokken und Listerien durch die Phosphorylierung von Guanidinogruppen eine gesonderte Rolle innerhalb der Familie der Kinasen. Insbesondere während der bakteriellen Stressadaptation scheint diese Art der posttranslationalen Proteinmodifikation von großer Bedeutung zu sein. Um die Funktionsweise der McsB Kinasefunktion in Verbindung mit dessen McsA Modulatorprotein besser verstehen zu können, wurden konservierte Arginine gegen Lysin substituiert. Auf diese Weise konnten entscheidende intramolekulare Positionen identifiziert werden, die für die Ausbildung der Autokinase- bzw. Phospho-Transferase Aktivität von Bedeutung sind. Diese konnten darüber hinaus in Einklang mit der McsB Struktur (Suskiewicz et al., 2019) gebracht werden.
Eines der Zielproteine für die McsB vermittelte Argininphosphorylierung (Arg-P) ist dabei der CtsR Regulator, welcher die Genexpression der Clp-Maschinerie in Bacillus subtilis reprimiert. Mit Hilfe globaler Transkriptomanalysen war es möglich, neben den bereits etablierten Zielgenen auch eine Art fine-tuning Regulation des MhqR Regulons aufzuzeigen.
Zwei weitere Proteine, die durch McsB vermittelte Arg-Ps beeinflusst werden, sind der Modulator der generellen Stressantwort, MgsR, und die intrinsisch inaktive Glutamat-Dehydrogenase GudB. Insbesondere GudB fällt durch die Identifikation von 15 Phospho-sites auf, wohingegen lediglich zwei Arg-P Bindungsstellen für MgsR nachgewiesen werden konnten (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Dennoch ist die GudB Stabilität nur geringfügig durch die McsB Kinasefunktion beeinflusst, wohingegen die MgsR Degradation entscheidend durch Arg-Ps beeinflusst scheint. Durch die Substitution der Arginine von MgsR gegen Glutamat wurde eine Art Phospho-Mimikry integriert. So konnten die Auswirkungen auf Regulatoraktivität und Stabilität von MgsR durch mögliche Arg-Ps im Detail untersucht werden.
In diesem Zusammenhang wurden durch detaillierte Untersuchungen der MgsR Degradation zusätzliche Informationen zur Funktionsweise von McsB als Adapterprotein gesammelt. Dieses legten die Vermutung nahe, dass McsB nicht nur als ClpC-Adapterprotein fungiert, sondern darüber hinaus auch die ClpX-abhängige Proteindegradation unterstützt.
Pneumokokken haben verschiedene Virulenzfaktoren, die nicht nur den Kolonisierungsprozess unterstützen, sondern auch das Vordringen des Pathogens in tiefere Gewebsschichten ermöglichen oder einen Schutz vor den Komponenten des Immunsystems vermitteln. Diese Virulenzfaktoren stehen im Mittelpunkt der Untersuchungen für die aktuelle Impfstoffentwicklung. Die genomische Analyse verschiedener Streptococcus pneumoniae Stämme identifizierte den Pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB) als LPXTG-verankertes Oberflächenprotein. PavB enthält repetitive SSURE-Sequenzen (Streptococcal Surface Repeats), die mit humanem Fibronektin interagieren. Das Molekulargewicht des hochkonservierten Proteins wird von der Anzahl der SSURE-Domänen bestimmt und variiert zwischen den unterschiedlichen Pneumokokkenstämmen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PavB ein Adhäsin auf der Oberfläche von Pneumokokken darstellt und am Kolonisierungsprozess der Pneumokokken unter in vivo Bedingungen beteiligt ist. Mäuse, die intranasal mit pavB-Deletions-Mutanten infiziert wurden, überlebten signifikant länger als die mit den Wildtypbakterien infizierten Tiere. Der PavB-defiziente Stamm zeigte im Vergleich zum parentalen Wildtyp eine verringerte Kolonisierung des Nasopharynx sowie eine verzögerte Ausbreitung in die Lunge. Dies konnte in Echtzeit unter Verwendung von biolumineszierenden Pneumokokken gezeigt werden. In Koinfektionsexperimenten mit gleichen Infektionsdosen von Wildtyp-Pneumokokken und isogenen pavB-Mutanten war die Mutante in ihrer Fähigkeit, sich in den Organen der oberen und unteren Atemwege auszubreiten, eingeschränkt. Im Gegensatz dazu war die Pathogenese einer Meningitis nach intrazerebraler Injektion der Pneumokokken, sowie die Erkennung und Phagozytose durch phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems, unabhängig von der Produktion des PavB Proteins. Die Immunogenität des Oberflächenproteins unter relevanten Bedingungen wurde durch den Nachweis von PavB-spezifischen Antikörpern in Patientenseren gezeigt. Auf eine Rolle des Oberflächenproteins PavB während der bakteriellen Adhäsion an eukaryotische Zellen deuteten die Infektionsexperimente mit humanen Epithelzelllinien. Es wurden verschiede His6-getaggte PavB-Derivate (SSURE2, SSURE2+3, SSURE1-5) für die weitere funktionelle Charakterisierung von PavB gereinigt und in Bindungsstudien eingesetzt. Die Funktion von PavB als Adhäsin konnte in Kompetitionsexperimenten unter Verwendung eines PavB-Derivats als Inhibitor bestätigt werden. Ebenso konnte die direkte Bindung des Proteins an eukaryotische Zellen nachgewiesen werden, wobei der eukaryotische Rezeptor noch nicht identifiziert wurde. In Protein-Protein-Interaktionsstudien wurden zusätzlich zu Fibronektin weitere humane Proteine des Plasmas und der extrazellulären Matrix (EZM), die im Laufe einer Infektion mit Pneumokokken einen Vorteil für das bakterielle Überleben im Wirt vermitteln könnten, als Bindungspartner für die drei gereinigten SSURE-Proteine identifiziert. Als neues Fibronektin-Bindungsprotein (FnBP) von S. pneumoniae diente PavB desweiteren für die Bestimmung der Bindungsregion von FnBPs von Pneumokokken im Fibronektinmolekül. Die Verwendung rekombinanter Fibronektinfragmente (His6-FnIII-Fragmente) ermöglichte den Nachweis der Beteiligung der Typ III-Domänen des C-terminalen Bereichs von Plasmafibronektin an der Interaktion zwischen PavB-Derivaten und Fibronektin. Die Bedeutung von Plasmafibronektin (pFn) für die Pathogenese einer Pneumonie wurde in einem induzierbaren knockout-Mausmodell für Plasmafibronektin untersucht. Nach intranasaler Infektion der Mäuse mit S. pneumoniae hatte der Verlust des Plasmaproteins unter den verwendeten Bedingungen keine signifikante Auswirkung auf die Entstehung einer Lungenentzündung oder die Überlebensaussicht der pFn-knockout-Mäuse. Unter in vitro Bedingungen bewirkte die Bindung von pFn an phagozytierende Zellen eine erhöhte Bindung der Pneumokokken an die Phagozyten. Dagegen beeinflusste die Rekrutierung von pFn an die Pneumokokkenoberfläche nicht die Phagozytose. Bisher konnte nicht eindeutig geklärt werden, welche Funktion Fibronektin während der Infektion mit Pneumokokken ausübt. Neben seinen multifunktionellen Bindungseigenschaften stellt das hochkonservierte Protein PavB einen interessanten Bestandteil für ein neues, Protein-basiertes Pneumokokkenvakzin dar.
Clostridioides difficile is an intestinal human pathogen that uses the opportunity of a depleted microbiota to cause an infection. It is known, that the composition of the intestinal bile acid cocktail has a great impact on the susceptibility toward a C. difficile infection. However, the specific response of growing C. difficile cells to diverse bile acids on the molecular level has not been described yet. In this study, we recorded proteome signatures of shock and long-term (LT) stress with the four main bile acids cholic acid
(CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), and lithocholic acid (LCA). A general overlapping response to all tested bile acids could be determined particularly in shock experiments which appears plausible in the light of their common steroid structure. However, during LT stress several proteins showed an altered abundance
in the presence of only a single or a few of the bile acids indicating the existence of specific adaptation mechanisms. Our results point at a differential induction of the groEL and dnaKJgrpE chaperone systems, both belonging to the class I heat shock genes. Additionally, central metabolic pathways involving butyrate fermentation and the reductive Stickland fermentation of leucine were effected, although CA caused a
proteome signature different from the other three bile acids. Furthermore, quantitative proteomics revealed a loss of flagellar proteins in LT stress with LCA. The absence of flagella could be substantiated by electron microscopy which also indicated less
flagellated cells in the presence of DCA and CDCA and no influence on flagella formation by CA. Our data break down the bile acid stress response of C. difficile into a general and a specific adaptation. The latter cannot simply be divided into a response to primary and secondary bile acids, but rather reflects a complex and variable adaptation process enabling C. difficile to survive and to cause an infection in the intestinal tract.
The present study deals with the spread and population genetics of the invasive Asian bush
mosquito Ae. japonicus in Europe and Germany. Since the first detection of Ae. japonicus
in Europe in 2000, the species spread rapidly through Europe, either actively by flying or
passively by human activities. In 2017, four confirmed populations of Ae. japonicus existed
in Europe. The largest population covered western Germany, parts of France, Switzerland,
Liechtenstein, Austria and Italy. The most northern population around Hanover, Germany,
did not spread since 2013. A very small population existed in Belgium and the second largest
population covered parts of Austria, Italy, Slovenia, Croatia and Hungary. By 2019, Ae.
japonicus had established in 15 European countries.
Most of the monitoring programmes in Europe dealing with the distribution and spread of
Ae. japoncus investigate cemeteries for juvenile stages. However, activities are not
harmonised, e.g. regarding numbers of investigated collection sites and declaration of
negative sites, making data comparison between different studies difficult. Therefore,
suggestions for a standardised Ae. japonicus monitoring method have been developed and
provided.
In the present study, 445 individuals of Ae. japonicus originating from five different
European countries were investigated for population genetic analyses by sequencing parts
of the nad4 gene and genotyping seven polymorphic microsatellite loci. In total, 16 different
nad4 haplotypes were identified with haplotype H1 being the most common and widespread
one through all populations.
Within Germany, Ae. japonicus has been spreading immensely over the last decade. Even
though the present results (2017) demonstrate incipient genetic admixture of populations as
compared to previous studies (2012-2015), no complete genetic mixture has taken place yet.
The populations of Ae. japonicus still fall into two genetic clusters, but the genetic diversity
on individual level had increased considerably (from three nad4 haplotypes in 2012 to 12
according to the present thesis). Both additional introductions and mutation are possible
reasons, but determining the origin of the German populations is not possible anymore.
In the years following the invasion of Germany, Ae. japonicus spread to southeastern
Europe. In 2013, it established in Croatia, in 2017 in Bosnia and Herzegovina and in 2018
in Serbia. In the current study, immature stages of Ae. japonicus were found at 19 sites in
Croatia, two sites in Bosnia and Herzegovina and one site in Serbia. The population genetic
analyses indicate at least two independent introductions in that area. Aedes japonicus collected west of Orahovica (Croatia) seemed to be genetically similar to samples previously
investigated from Southeast Germany/Austria and Austria/Slovenia. By contrast, samples
from east of Orahovica, together with those from Serbia and Bosnia and Herzegovina, were
characterised by another genetic make-up, but their origin could not be determined.
In 2021, individuals of Ae. japonicus were detected at two collection sites in the Czech
Republic for the first time: Prachatice close to the Czech-German border and Mikulov on
the Czech-Austrian border. Population genetics and comparison of genetic data showed a
close relationship of the Prachatice samples to a German population, while for Ae. japonicus
from Mikulov close relatives could not be identified.
In the future, the global spread and establishment of invasive mosquitoes through
international trade and travel will increase. Potential vectors, like the Asian bush mosquito
Ae. japonicus, can become a problem in Europe and Germany, especially in the course of
global warming which supports pathogen transmission. Monitoring the known populations
and identifying introduction and migration routes are therefore essential for vector
managing.
Abstract
DNA extraction and preservation bias is a recurring topic in DNA sequencing‐based microbial ecology. The different methodologies can lead to distinct outcomes, which has been demonstrated especially in studies investigating prokaryotic community composition. Eukaryotic microbes are ubiquitous, diverse, and increasingly a subject of investigation in addition to bacteria and archaea. However, little is known about how the choice of DNA preservation and extraction methodology impacts perceived eukaryotic community composition. In this study, we compared the effect of two DNA preservation methods and six DNA extraction methods on the community profiles of both eukaryotes and prokaryotes in phototrophic biofilms on seagrass (Zostera marina) leaves from the Baltic Sea. We found that, whereas both DNA preservation and extraction method caused significant bias in perceived community composition for both eukaryotes and prokaryotes, extraction bias was more pronounced for eukaryotes than for prokaryotes. In particular, soft‐bodied and hard‐shelled eukaryotes like nematodes and diatoms, respectively, were differentially abundant depending on the extraction method. We conclude that careful consideration of DNA preservation and extraction methodology is crucial to achieving representative community profiles of eukaryotes in marine biofilms and likely all other habitats containing diverse eukaryotic microbial communities.
We analyzed the proteomic response of the Gram-negative fish pathogen A. salmonicida to iron limitation, an elevated incubation temperature, and the antibiotic florfenicol. Proteins from different subcellular fractions (cytosol, inner membrane, outer membrane, extracellular and outer membrane vesicles) were enriched and analyzed. We identified several iron-regulated proteins that were not reported in the literature for A. salmonicida before. We could also show that hemolysin, an oxidative-stress-resistance chaperone, a putative hemin receptor, an M36 peptidase, and an uncharacterized protein were significantly higher in abundance not only under iron limitation but also with an elevated incubation temperature. This may indicate that these proteins involved in the infection process of A. salmonicida are induced by both factors. The analysis of the outer membrane vesicles (OMVs) with and without applied stresses revealed significant differences in the proteomes. OMVs were smaller and contained more cytoplasmic proteins after antibiotic treatment. After cultivation with low iron availability, several iron-regulated proteins were found in the OMVs, indicating that A. salmonicida OMVs potentially have a function in iron acquisition, as reported for other bacteria. The presence of iron-regulated transporters further indicates that OMVs obtained from ‘stressed’ bacteria might be suitable vaccine candidates that induce a protective anti-virulence immune response.