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Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II ist eine antikörpervermittelte Immunreaktion. Nur ein Teil der HIT-Patienten entwickelt allerdings lebensbedrohliche Komplikationen wie Thrombosen. Faktor V Leiden, die Prothrombin G20210A-Mutation und der Methylentetrahydrofolatreduktase(MTHFR)-C677T-Polymorphismus gelten als genetische Risikofaktoren für die Entstehung von Thrombosen. In der vorliegenden Arbeit wird der Stellenwert der drei Mutationen als mögliche Risikofaktoren für die Entstehung HIT-assoziierter Thrombosen untersucht. In der Gruppe aller untersuchten HIT-Patienten ließ sich keine signifikant erhöhte Inzidenz der Faktor-V-Leiden-Mutation, des Prothrombin G20210A und des MTHFR-C677T-Polymorphismus im Vergleich zu Kontrollgruppen nachweisen. Auch bei den einzelnen Untergruppen der mit thrombembolischen Komplikationen symptomatischen HIT-Patienten zeigte sich kein Zusammenhang zwischen dem Vorliegen der Mutationen mit venösen oder arteriellen HIT-assoziierten Thrombosen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß keine der drei untersuchten Mutationen ein herausragender Risikofaktor für die Manifestation thrombembolischer Komplikationen bei HIT-Patienten darstellt.
SUMMARY To date, Staphylococcus aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. Beyond this, S. aureus colonises the nasal mucosa of circa 35% of the healthy population, so-called carriers. Importantly, S. aureus nasal carriage is a major risk factor for the development of S. aureus infections, which are commonly caused by the colonising strain. This underlines the importance of host factors for the outcome of S. aureus-host interactions. Despite the clinical importance of nasal carriage, little is known about humoral immune responses triggered by colonisation. Therefore, this thesis was focussed on the anti-staphylococcal antibody responses of S. aureus carriers and noncarriers. Staphylococcal superantigens (SAgs) served as indicator antigens for our studies. SAgs are virulence factors with extraordinary variability in the species S aureus and act as extremely potent T cell mitogens. To date, 19 different SAg gene loci are known in the species S. aureus, but molecular-epidemiological studies on the distribution of these genes are limited. Therefore, we established five multiplex PCRs for the detection of all known SAgs. With this robust and high-throughput technique we analysed the SAg gene patterns of more than 300 isolates, including 107 nasal isolates of S. aureus carriers and 88 blood culture isolates of hospital patients from Western Pomerania. The SAg gene patterns were highly heterogeneous, which can be explained by their localisation on mobile genetic elements (MGE), such as genomic islands, pathogenicity islands, phages and plasmids. Most isolates (~80%) harboured SAg genes, on average five to six, and SAgs of the enterotoxin gene cluster (egc) were by far the most prevalent. Additionally, we observed a strict correlation between the presence of SAg genes and the T cell mitogenic potency of clinical isolates. SAg-encoding MGEs can be distributed by two distinct mechanisms: horizontal transfer by bacteriophages and vertical transmission to daughter cells. To investigate the distribution of SAg genes within the S. aureus population, we determined the clonal relationship of our isolates by spa genotyping. Interestingly, SAg-gene encoding MGEs were not randomly distributed, but rather closely linked to clonal lineages. Each clonal lineage was characterised by defined combinations of SAg genes. These data suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly enhances the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus virulence. Indeed, the comparison of virulence genes within each clonal complex indicated a role in invasiveness for some MGEs, e.g. the exfoliative toxin D-encoding pathogenicity island, while rendering it unlikely for SAgs. It is known that neutralising serum antibodies against the SAgs SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 are frequently present in healthy individuals. However, the neutralising antibody profiles against more recently described SAgs or complex SAg cocktails as secreted by clinical isolates had not been determined so far. Therefore, we screened more than 100 sera for their SAg neutralising capacity with a neutralisation assay. We observed a marked heterogeneity and surprisingly large “gaps” in the neutralising capacity. Interestingly, the egc SAgs were inhibited only rarely (5-10%), whereas between 32 and 86% of the tested sera neutralised “classical” SAgs. This “egc gap” in the SAg-neutralising antibody profiles of healthy individuals was unexpected, since egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. We could demonstrate that the “egc gap” is probably not due to different T cell activating properties of egc SAgs compared to classical SAgs, but rather to a differential regulation of SAg gene expression. S. aureus carriers have an increased risk of developing an S. aureus bacteraemia, which is in most cases caused by the colonising strain. Intriguingly, a large prospective clinical trial revealed a considerably higher mortality in noncarriers with invasive S. aureus strains compared to carriers with invasive disease. To explain these paradoxical findings, we hypothesised that in carriers partial immunity against the colonising strain may contribute to their improved outcome. We used SAgs as strain-specific indicator antigens. Importantly, sera from persistent carriers neutralised SAgs of their colonising strain with significantly higher efficiency than sera from noncarriers. This antibody response was strain-specific, since the antibody response of carriers against other SAgs did not differ from that of noncarriers. Thus, colonisation with S. aureus confers a strong and strain-specific antibody response against staphylococcal SAgs. We suggest that in carriers neutralising antibodies directed against SAgs and other staphylococcal virulence factors confer partial protection during systemic infections. This could explain the better prognosis of carriers with S. aureus bacteraemia compared to noncarriers. Moreover, our data imply that the key to understanding the pathogenesis of S. aureus disease may lie in the identification of host factors rather than bacterial factors. Such host factors could be the immune status and gene polymorphisms that contribute to colonisation, susceptibility to infection and outcome of infection. Finally, while the treatment of S. aureus bacteraemia with pooled immunoglobulins was performed in the past without significant success, our findings on strain-specific antibody profiles suggest that therapies with customised cocktails of monoclonal antibodies could have a higher efficacy.
Die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine häufige Herzmuskelerkrankung und ist durch eine eingeschränkte systolische Pumpfunktion mit Erweiterung des linken, des rechten oder beider Ventrikel gekennzeichnet. Es sind eine Vielzahl von Ursachen bekannt, u. a. genetische, infektiöse und toxische. Des Weiteren sind eine Vielzahl von kardiotropen Antikörpern nachgewiesen worden, die bei der Pathogenese der DCM eine Rolle spielen. In dieser Dissertationsschrift sollten die funktionellen Effekte kardiotroper Antikörper bei Patienten mit DCM untersucht werden und ein eventuell bestehender Zusammenhang zwischen der Häufigkeit der Antikörper mit einer begleitenden Virusinfektion, Inflammation oder dem Stadium der Krankheit hergestellt werden. Die Untersuchung des Bindungsmechanismus der Antikörper an kardiale Antigene, bzw. eventuell beteiligte Rezeptoren auf den Kardiomyozyten war ein weiteres Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die therapeutischen Erfolge einer Entfernung von Antikörpern aus dem Plasma von DCM-Patienten (Immunadsorption) sollten mit den gewonnenen Ergebnissen korreliert werden. Die Wirkung der aufgereinigten IgG-Fraktion aus Plasma von Patienten mit DCM auf Kontraktilität und Ca2+-Ratio während eines Kontraktionszyklus wurde auf isolierten Rattenkardiomyozyten getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass das Plasma von 57 % der DCM-Patienten eine negativ inotrope Wirkung auf die isolierten Rattenkardiomyozyten hat. Die Subgruppenanalysen der untersuchten Patienten ergaben keine Hinweise auf eine Korrelation der negativen Inotropie mit einer bestehenden Virusinfektion oder Myokardinflammation. Allerdings konnte bei männlichen Patienten, bei Patienten mit nur leicht reduzierter Pumpfunktion und kürzerer Krankheitsdauer ein erhöhtes Auftreten negativ inotroper Antikörper festgestellt werden. Durch Pepsin-Spaltung negativ inotrop wirksamer Antikörper und der Vorinkubation von isolierten Rattenkardiomyozyten mit F(ab)2-Fragmenten und Fc-Fragmenten konnte gezeigt werden, dass für die negativ inotrope Wirkung sowohl die antigenbindenden Strukturen als auch der Fc-Teil des Antikörpers verantwortlich sind. In diesem Zusammenhang wurde auf Kardiomyozyten erstmals ein Fc-Rezeptor (Fc-Rezeptor IIa; CD32A) mittels Immunfluoreszenz, Westernblot und Elektronenmikroskopie detektiert. Die Therapieerfolge der Entfernung der Antikörper aus dem Plasma von Patienten mittels der Immunadsorptionstherapie konnten mit den in-vitro Untersuchungen korreliert werden. Patienten mit negativ inotrop wirksamen Antikörpern profitieren stärker von der Therapie. Auch der Genotyp des exprimierten Fc-Rezeptors beeinflusst die Verbesserung der kardialen Parameter der Patienten durch die Therapie. Patienten homozygot für Arginin an der Aminosäure 131 des Proteins besitzen den niedrigaffinen Rezeptor und profitieren stärker von einer Entfernung der Antikörper als Patienten mit dem hochaffinen Histidin-Genotyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass bei einem Teil der DCM-Patienten kardiodepressive Antikörper im Plasma vorhanden sind, welche sowohl über den antigenbindenden F(ab)-Teil als auch über den Fc-Teil die Funktion der Kardiomyozyten beeinflussen. Die Entfernung dieser Antikörper führt zu einer Besserung der kardialen Funktion. Die unterschiedliche Affinität der adsorbierten Antikörper zum Fc-Rezeptor IIa, welche beeinflusst wird durch den H/R-131 Genpolymorphismus, bestimmt hierbei das Ansprechen der Patienten auf die Therapie. Mit der vorliegenden Arbeit ist die aktive Rolle kardiotroper Antikörpern in der Pathogenese der Dilatativen Kardiomyopathie unterstrichen worden und mit der Entdeckung des Fc-Rezeptors IIa ein Mechanismus zum Verständnis der physiologischen Wirkungsweise der Antikörper mit verschiedensten Zielepitopen aufgezeigt worden.
Staphylococcus (S.) aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. In contrast, about 35% of the healthy population are colonized with S. aureus in the anterior nares. The genetic make-up of this species is highly diverse. Mobile genetic elements comprise about 15% of the S. aureus genome. They encode many virulence factors like the 21 different known staphylococcal superantigens (SAgs), highly potent activators of T lymphocytes. Besides their well known causative role in food poisoning and toxic shock syndrome, information about SAg involvement in pathogenesis is limited. On the other hand, the human host and its immune response are also highly diverse. This study focuses on SAgs, because they are potent virulence factors that are highly diverse and therefore mirror of the variability of the species S. aureus. The goals of this work were (i) to identify virulence determinants by comparing the prevalence of SAg genes and phages among colonizing and invasive S. aureus isolates and to correlate it with the clonal background, (ii) to determine the prevalence and the development of anti-SAg antibodies in healthy S. aureus carriers and noncarriers as well as in bacteremia patients, and (iii) to elucidate the reasons for the selective lack of neutralizing serum antibodies specific for a subgroup of SAgs, the egc SAgs. In search for a molecular-epidemiological associations between SAgs and different diseases caused by S. aureus we investigated the distribution of SAg genes and/ or bacteriophages and correlated this with the clonal background, determined by spa genotyping. The analysis of more than 700 S. aureus isolates from nasal colonization, bacteremia or furunculosis revealed that SAg-encoding mobile genetic elements and bacteriophages were strongly associated with the clonal background. As a consequence, each clonal lineage was characterized by a typical SAg gene and phage repertoire. Therefore, we suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly increases the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus pathogenesis. However, we found no association of SAg genes with bacteremia or furunculosis. While functional neutralization assays closely mimic the protective action of anti-SAg antibodies in vivo, they are labor-intensive and time-consuming. A fast and easy method for the simultaneous quantification of antibody binding to multiple staphylococcal antigens is the Luminex® technology. Using serum samples from persistent carriers and noncarriers we showed a strong correlation between antibody binding and neutralizing capacity against the SAg TSST-1. This assay confirmed the astonishing lack of antibodies against egc SAgs in healthy carriers and noncarriers, which was previously described by Holtfreter and coworkers. Since colonization is probably not sufficient to induce a robust antibody response as revealed by experimental colonization with S. aureus, we propose that (minor) infections are required to induce the high titers of non-egc SAg-neutralizing antibodies in healthy adults. To test this, we investigated whether SAgs elicit a neutralizing antibody response during S. aureus bacteremia. At the acute phase of the disease most patients already had neutralizing antibodies against non-egc SAgs, and antibody titers frequently increased during infection. Notably, egc SAgs did not elicit a boost or de novo generation of specific antibodies. The “egc gap” in the antibody response, which has now been shown in healthy adults, as well as following systemic infection with S. aureus, is astonishing. After all, egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. In search for an explanation, the intrinsic properties of three recombinant egc (SEI, SElM, SElO) and non-egc SAgs (SEB, SElQ, TSST-1) were compared in depth. Egc and non-egc SAgs were very similar with regard to induced T cell proliferation, cytokine profiles, and gene expression of human immune cells. However, there was a striking difference in the regulation of the two groups of SAgs by S. aureus in bacterial culture. We conclude that the differential regulation of egc and non-egc SAg has an impact on the immune response. But how are SAgs regulated by S. aureus during its interaction with the host? Up until now most research on regulation of virulence factors has been performed in vitro. The immune response can help to shed light on this problem, because it is an exquisitely specific sensor for the exposure to different antigens. The high prevalence of neutralizing serum antibodies against non-egc SAgs indicates that most healthy adults have been exposed to these toxins during their encounters with S. aureus. For egc SAgs this remains an open question. However, initial data indicate that the egc SAg genes are transcribed during nasal colonization.
Untersuchung zur Assoziation von Antikörpern gegen PF4/Heparin-Komplexe mit Parodontalerkrankungen
(2010)
Ziel dieser Fall-Kontroll-Studie war es, zu evaluieren, ob eine Assoziation zwischen dem Vorliegen einer Parodontitis und dem Vorhandensein von PF4/Heparin-Komplex Antikörpern besteht. PF4 ist ein Chemokin, welches vermehrt durch Thrombozyten bei deren Aktivierung ausgeschüttet wird. PF4 kann Komplexe mit negativ geladenen Molekülen bilden. Die Prototypreaktion ist die Formation von PF4/Heparin-Komplexen. Mit Heparin behandelte Patienten können gegen diese Komplexe Antikörper bilden, die zur komplexen Aktivierung der Blutgerinnung mit erhöhtem Risiko zu thrombembolischen Ergeignissen führen können. Diese Antikörper konnten aber auch in nicht mit Heparin behandelten Patienten nachgewiesen werden. Daraus entwickelte sich die Hypothese, dass parodontale Infektionen/Entzündungen möglicherweise über die Aktivierung der Thrombozyten und vermehrte Freisetzung von PF4 die Formation von PF4-Komplexen und Antikörperbildung induzieren könnten. Das Serum von 937 Blutspendern mit einem Alter von 40 - 60 Jahren wurde auf PF4/Heparin-Komplex Antikörper der Klassen IgG, IgA und IgM (ELISA) untersucht. Zu den 99 positiv getesteten Blutspendern (40 Fallprobanden, mittleres Alter 47,9 Jahre) wurden 40 Kontrollprobanden (mittleres Alter 48,1 Jahre) nach Alter (±2 Jahre), Geschlecht, Rauch- und Bildungsstatus gematcht. Die klinischen Parameter waren Zahnzahl, Sondierungstiefe, Attachmentverlust und Bluten nach Sondieren. 50% der Probanden waren männlich, 35% Nichtraucher, 25% ehemalige Raucher und 40% Raucher. 80% (15%) der Probanden haben ein mittleres (hohes) Bildungsniveau. Die Probanden der Fallgruppe hatten einen schlechteren parodontalen Gesundheitszustand als die Kontrollgruppe. Das Risiko eines positiven PF4/Heparin-Komplex-Antikörper-Status’ war 2 bis 7-fach erhöht bei schweren mittleren Sondierungstiefen wie auch bei moderatem und schwerem mittleren Attachmentverlust. Die vorliegende Untersuchung zeigte, dass parodontal erkrankte Probanden ein höheres Risiko für das Auftreten von anti-PF4/Heparin Antikörpern aufwiesen als parodontal gesündere Probanden. Parodontitis könnte mit dem Auftreten von natürlichen anti-PF4/Heparin-Komplex Antikörpern assoziiert sein. Um einen möglichen kausalen Zusammenhang zu evaluieren, sind weitere Studien mit größerem Stichprobenumfang und longitudinalem Design erforderlich.
LOX-1 ist ein membranständiger Rezeptor, der u.a. auf Endothelzellen exprimiert wird. Für Veränderungen in der Rezeptorexpression wurden verschiedene Faktoren identifiziert. Neben oxidiertem LDL und Angiotensin II stellen Zytokine wie beispielsweise TNF-α entscheidende Faktoren dar. LOX-1 stellt zudem ein Adhäsionsmolekül für Leukozyten und Bakterien dar. In dieser Arbeit wurde in einem tierexperimentellen Modell die Inhibition von LOX-1-Rezeptoren durch spezifische Antikörper bei experimenteller Endotoxinämie untersucht. Als Hypothese wurde angenommen, dass eine Blockierung von LOX-1-Rezeptoren mit einem spezifischen Antikörper eine Verbesserung der intestinalen Mikrozirkulation mit Abnahme der Leukozytenadhärenz bewirkt. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Verabreichung von LOX-1-Antikörpern zu einer Reduktion der Leukozytenadhärenz führt. Auf m-RNA Ebene konnte eine signifikante Minderung der Expression von LOX-1 nach Applikation des LOX-1-Antikörpers nachgewiesen werden. Gegenwärtig ist die Bedeutung von LOX-1 in den pathophysiologischen Zusammenhängen der Sepsis noch nicht ausreichend verstanden. Weitere Arbeiten sind diesbezüglich erforderlich. Diese Arbeit bestätigt, dass die LOX-1-Inhibition ein attraktives Target in der Modulation der endotoxinvermittelten Leukozytenaktivierung in der Mikrozirkulation bei Sepsis darstellt.
Staphylococcus (S.) aureus besiedelt bei 30 % der gesunden Bevölkerung den Nasenraum, meist ohne Symptome zu verursachen (sog. Carrier). Die Bakterienspezies ist aber auch eine der häufigsten Ursachen für nosokomiale Infektionen mit zum Teil hoher Letalität, wie z. B. bei einer S. aureus-Sepsis. In den letzen Jahrzehnten haben sich multiresistente S. aureus-Isolate in und außerhalb der Krankenhäuser stark ausgebreitet. Dies lässt befürchten, dass eine erfolgreiche antibiotische Behandlung schwerer S. aureus-Infektionen in der Zukunft immer seltener möglich sein wird. Deshalb werden andere präventive und therapeutische Strategien wie Impfstoffe benötigt. Die Impfstoffentwicklung gestaltet sich jedoch schwierig. Zum einen ist die Variabilität der Spezies S. aureus sehr groß: Zwei Isolate können sich in bis zu 20 % ihres Genoms unterscheiden. Zum anderen ist auch die Immunantwort des Wirts sehr komplex. Die Mechanismen der angeborenen Immunabwehr sind bereits gut untersucht, das Zusammenspiel von S. aureus mit dem adaptiven Immunsystem dagegen weniger umfassend charakterisiert. Dabei ist gerade dies für die Vakzineentwicklung bedeutsam, denn jede erfolgreiche Vakzinierung beruht auf der Bildung eines Immungedächtnisses, der Kernkompetenz des adaptiven Immunsystems. Da sich die gegen S. aureus gerichtete adaptive Immunantwort von Individuum zu Individuum stark unterscheidet, ist die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Mechanismen eine besondere Herausforderung. Die rasche Entwicklung von OMICs-Techniken ermöglicht nun erstmals eine umfassende Charakterisierung des Immunoms von S. aureus; der Gesamtheit der von B-Zellen (und Antikörpern) und T-Zellen erkannten bakteriellen Antigene. In dieser Arbeit sollten diese modernen Methoden eingesetzt werden, um einen Beitrag zum Verständnis der vielfältigen Interaktionen zwischen S. aureus und dem adaptiven Immunsystem zu leisten; mittelfristig soll dieses Projekt zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen S. aureus beitragen. Informativ erschien ein Vergleich der adaptiven Immunantwort bei S. aureus-Carriern und Patienten, weil er Aufschluss darüber verspricht, wie die Interaktion zwischen Erreger und Wirt in der Balance gehalten wird und was dieses Gleichgewicht stört. Weil die individuelle Antiköperantwort (IgG, IgA und IgM) in ihrer Komplexität und Variabilität erfasst werden sollte, wurde ein personalisierter Ansatz gewählt, d.h. mittels zweidimensionaler Immunoblots (2D-IB) wurde bei jedem S. aureus-Carrier oder Patienten die Antikörperantwort auf den eigenen kolonisierenden bzw. invasiven S. aureus-Stamm untersucht. Durch die Kombination mit massenspektrometrischen Analysen ließ sich das S. aureus-Immunom der Kolonisierung und der Bakteriämie herauskristallisieren. Um in der Zukunft auch S. aureus-spezifische T-Zellen charakterisieren zu können, wurde ein Verfahren für die Herstellung von humanen T-Zellbanken entwickelt, das die funktionelle Analyse von T-Lymphozyten auf Einzelzellebene ermöglicht.
Relevanz der prätransfusionellen Anti-Human-Globulin-Kreuzprobe bei unauffälligem Antikörpersuchtest
(2011)
Die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten ist eine Basistherapie der Medizin. Gefürchtete Transfusionsrisiken für den Patienten sind immunhämolytische Reaktionen auf Grund AB0-inkompatibler Erythrozytenkonzentrate oder irregulärer Alloantikörper. Präventiv werden vor jeder geplanten Transfusion deshalb die Blutgruppenmerkmale des Patienten bestimmt und sein Plasma in einem hochsensitiven Verfahren auf irreguläre erythrozytäre Antikörper untersucht (Antikörpersuchtest). Prätransfusionell verpflichtend ist in Deutschland dabei auch die serologische Anti-Human-Globulin-Kreuzprobe, wobei das Restrisiko einer immunologischen Unverträglichkeit zwischen Patientenplasma und Blutkonserve trotz zuvor negativer Antikörpersuche ausgeschlossen werden soll. Bei einer reaktiven Kreuzprobe nach unauffälligem Antikörpersuchtest sind insbesondere die Folgeuntersuchungen sehr zeitaufwändig. Die Patientenversorgung kann dann in hohem Maße verzögert werden, was im Falle einer dringenden Transfusionsindikation zur Gefahr für den Patienten werden kann. In Notfallsituationen wird aus diesem Grund auf die Kreuzprobe verzichtet. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Kreuzprobe nach negativer Antikörpersuche überhaupt die Sicherheit der Transfusion erhöht und über den Notfall hinaus noch sinnvoll erscheint. In der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse der Anti-Human-Globulin- Kreuzproben ausgewertet, die im zuvor durchgeführten Antikörpersuchtest negativ reagiert hatten. Über einen Zeitraum von 8 Jahren wurden unterschiedliche serologische Verfahrensweisen (Kreuzprobe im konventionellen Röhrchentest versus Gelkartentechnik, Antikörpersuche mit 2 versus 3 erythrozytären Suchzellen) untersucht. Zwischen 2000 und 2007 wurden 312.275 Kreuzproben bei 53.512 Patienten durchgeführt. Davon waren 566 Kreuzproben nach negativer Antikörpersuche bei 296 Patienten reaktiv. Nach Umstellung der Kreuzprobentechnik vom Röhrchen- auf die Gelkartentechnik im Jahr 2003 erhöhte sich der Anteil reaktiver Kreuzproben trotz negativer Antikörpersuche von 0,05% (Röhrchentest) auf 0,25% (Gelkarte) erheblich (p<0,001). Ursache für die Reaktivität waren in 15% irreguläre Anti-A1-Antikörper, nur in 1,8% wurden andere irreguläre Alloantikörper gefunden. Hingegen konnten in über 80% der reaktiven Kreuzproben gar keine oder keine klinisch relevanten Ursachen (Autoantikörper beim Spender oder Patienten) gefunden werden. Insgesamt wurden in 0,0032% (10 von 312.275 Kreuzproben) irreguläre Alloantikörper primär durch die Kreuzprobe aufgedeckt. Theoretisch/statistisch wäre demnach eine von 31.228 Transfusionen mit einem potentiellen immunologischen Inkompatibilitätsrisiko verbunden gewesen, würde die biologische Relevanz aller detektierten Alloantikörper unberücksichtigt bleiben. Bei Betrachtung jedoch der biologisch relevanten Antikörper hätte das Risiko für eine immunologisch inkompatible Transfusion nur bei einer von 78.069 Transfusionen bestanden. Nachdem in der Antikörpersuche (unter Verwendung der sensitiven Gelkartentechnik) die Anzahl der Suchzellen von 2 auf 3 erhöht wurde, sind keine biologisch relevanten Alloantikörper mehr übersehen worden. Ähnliche Untersuchungen haben in anderen Ländern bereits dazu geführt, dass nach einer negativen Antikörpersuche auf die serologische Kreuzprobe verzichtet wird. Diese Option sollte auch in Deutschland eröffnet werden.
Plättchenfaktor 4 (PF4, CXCL4) ist ein 7.8 kDa stark positiv geladenes Protein, das zur Familie der CXC-Chemokine gehört. PF4 wird als Tetramer in den alpha-Granula von Thrombozyten gespeichert und bei deren Aktivierung freigesetzt. Seine biologische Funktion ist weitgehend unbekannt. Allerdings spielt PF4 eine wichtige Rolle bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT), einer der häufigsten immunologisch bedingten Arzneimittelkomplikationen, die Blutzellen betreffen. PF4 und Heparin bilden Komplexe, die Neoepitope generieren und die Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern induzieren. Resultierende Immunkomplexe aktivieren Thrombozyten Fc-Rezeptor-vermittelt und führen zu einer paradoxen Thrombinbildung. Die Folgen können Thrombozytopenie und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die pathogenen Antikörper sind nicht spezifisch für Heparin und erkennen auch PF4 gebunden an andere Polyanionen. Die Immunantwort der HIT zeigt einige Besonderheiten. Bereits bei erstmaliger Heparinexposition treten anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgG bereits nach 4-6 Tagen auf. Dies kann keine primäre Immunantwort sein, da bei dieser IgG-Antikörper erst deutlich später gebildet werden. Damit muss eine Vorimmunisierung mit natürlich auftretenden PF4/Polyanion-Komplexen stattgefunden haben. Eine mögliche Quelle wären negativ geladene Strukturen, die auf bakteriellen Zelloberflächen vorkommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Bindung von PF4 an Zelloberflächen zu charakterisieren und insbesondere die Frage zu klären, ob PF4 auf der Bakterienoberfläche Komplexe bildet. Zunächst erfolgte die Etablierung einer durchflusszytometrischen Analysemethode zur Messung der PF4-Bindung an Thrombozyten in Abhängigkeit von antikoagulatorischen Polyanionen. Die PF4-Bindung war nicht von der antikoagulatorischen Wirksamkeit der Polyanionen abhängig, sondern von der negativen Ladungsdichte. Geringe Konzentrationen von Heparin haben die PF4-Bindung an Thrombozyten verstärkt, wohingegen hohe Konzentrationen die PF4-Bindung inhibierten. Auch mit PF4 exprimierenden HEK-Zellen konnte eine ladungsabhängige Bindung von PF4 nachgewiesen werden. Als nächstes wurde die Bindung von PF4 an Bakterien untersucht. PF4 hat auch hier, konzentrations- und ladungsabhängig, an Gram-positive und Gram-negative Bakterien gebunden. Mittels der Adsorptions-Elutions-Technik konnte dann gezeigt werden, dass es durch die Bindung von PF4 an Bakterien zur Ausbildung PF4/Heparin-ähnlicher Epitope kommt, welche von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aus Patientenserum erkannt werden. Mit einem Phagozytoseassay wurde dann nachgewiesen, dass die durch PF4 vermittelte Bindung der anti-PF4/Heparin-Antikörper an Bakterien die Phagozytose durch polymorph nukleäre Zellen (PMN) fördert. Dass dieser Abwehrmechanismus tatsächlich in vivo bedeutsam ist, konnte in dem Maus-Sepsis-Modell Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) gezeigt werden. Die 6-8 Wochen jungen Mäuse entwickelten ab 3 Tagen nach der CASP-Operation anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM und ab 14 Tagen der Klasse IgG. Dieser Antikörperverlauf passt zur Immunreaktion nach erstmaligem Antigenkontakt und beweist, dass Bakterienkontakt im Rahmen der Sepsis eine primäre Immunisierung gegen PF4/Heparin induzieren kann. Jedoch ist die Sepsis, eine lebensbedrohliche Erkrankung, viel zu selten um das Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern in der Normalbevölkerung (18.8% anti-PF4/Heparin IgM, 6.1% anti-PF4/Heparin IgG) und bei 50% der Patienten nach kardiochirurgischem Eingriff erklären zu können. Eine häufiger auftretende, chronische, bakterielle Infektion ist die Parodontitis. Im Rahmen der SHIP-Studie (Study of Health in Pomerania) konnte dann gezeigt werden, dass der Parodontitis-Status mit dem Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern korreliert. Unterstützend konnte gezeigt werden, dass PF4 auch von parodontalpathogenen Bakterien gebunden wird und darüber die Bindung von anti-PF4/Heparin-Antikörpern ermöglicht wird. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine bislang unbekannte Funktion von PF4 in der anti-bakteriellen Wirtsabwehr. Gleichzeitig wurde die Frage geklärt, warum Patienten, die das erste Mal Heparin erhalten bereits an Tag 4-6 IgG-Antikörper gegen PF4/Heparin bilden. Somit konnte ein wichtiger Beitrag zur pathophysiologischen Erklärung einer der derzeit häufigsten immunvermittelten, unerwünschten Arzneimittelwirkungen geleistet werden. Hinsichtlich der biologischen Bedeutung von PF4 ist von besonderer Wichtigkeit, dass PF4 ladungsabhängig an viele verschiedene Bakterienspezies bindet. Damit sind Antikörper gegen PF4/Polyanion-Komplexe nicht spezifisch für eine Bakterienspezies, sondern können eine Form der Wirtsabwehr darstellen, bei der eine IgG-Spezifität eine Vielzahl von PF4-markierten Bakterien bindet. Es wäre denkbar, dass es sich hierbei um ein grundlegendes, evolutionär altes Abwehrprinzip handelt, dass möglicherweise auch bei anderen immunvermittelten Erkrankungen Relevanz hat.
Bei der DCM führt eine ausgeprägte Dilatation einer oder beider Herzkammern zu einer fortschreitenden Herzinsuffizienz, wobei oft nur eine Herztransplantation die einzige Heilungsoption darstellt. Die Immunadsorption bietet bei der Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie eine Therapieoption, welche neben der konventionellen medikamentösen Herzinsuffizienztherapie in der Pathophysiologie dieser Erkrankung angreift. Kardiotrope Autoantikörper als Folge eines inflammatorischen Autoimmunprozesses können hierbei effektiv ausgewaschen werden. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Immunadsorption auf die klinische Entwicklung bei DCM-Patienten über ein Jahr, in Abhängigkeit von verschiedenen Charakteristika untersucht werden. Ausserdem wurde experimentell die Wirkung von IgG-Fraktionen dieser Patienten auf isolierte Rattenkardiomyozyten vor der Immunadsorption und im Verlauf untersucht. Es sollte eine Aussage über den Effekt der Immunadsorption nach einem Jahr, besonders profitierende Patientenkollektive sowie die Korrelation von klinischer Entwicklung und messbarem Kontraktions- und Kalziumtransientverhalten an isolierten Rattenkardiomyozyten getroffen werden. Es wurden dafür jeweils die IgG-Fraktionen des Plasmas der DCM-Patienten vor der Immunadsorption, am 5.Tag nach der Intervention sowie im Verlauf nach 3, 6 und 12 Monaten unter einem Fluoreszenzmikroskop über isolierte Rattenkardiomyozyten geleitet. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wurde der kardiotrope Effekt evaluiert und ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass einige Patientenproben einen negativ-inotropen, andere hingegen keinen Effekt auf das Kontraktionsverhalten der Zellen hatten. Es konnte gezeigt werden, dass vor und nach Immunadsorption eine Korrelation zwischen der klinischen Entwicklung der Patienten und experimentellen Ergebnissen besteht. Die negative-inotrope Gruppe zeigte im Verlauf deutlichere Verbesserungen hinsichtlich der linksventrikulären Pumpfunktion (LVEF) und Verminderung der linksventrikulären Dilatation. Beide Gruppen profitieren von der Immunadsorption, betrachtet man die klinische Einschätzung der Herzinsuffizienz (NYHA-Stadien) und Spiroergometriedaten. Ältere Patienten konnten nach Immunadsorption einen stärkeren Anstieg der LVEF verzeichnen als Jüngere. Es wurden Hinweise gefunden, dass eine kurze Krankheitsdauer eine schlechtere LVEF und einen höheren kardiodepressiven Effekt mit sich bringt. Außerdem scheint ein initial hoher Inflammationsgrad (MHC-II-Grad) einen nur geringen LVEF-Anstieg im Verlauf zu bewirken. Es wurden kein Einfluss des Geschlechtes oder einer Virusinfektion auf den Verlauf klinischer und experimenteller Parameter nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass eine erneut zunehmende negative Inotropie nach 12 Monaten beobachtet werden konnte.
The immune system of all vertebrates primarily is responsible to maintain the organisms homeostasis by either eliminating neoplastic or altered body cells and to protect against foreign invaders (viruses, bacteria, fungi, parasites) (Murphy 2012). It is a highly regulated network of innate and adaptive mechanisms between humoral factors and leukocytes. The successful elimination or protection is crucially based on differentiation of self from non-self. Pathogens and altered body cells are recognized by different receptor complexes on immune cells. Expressed pathogen- or danger-associated molecular patterns (PAMPs or DAMPs, respectively) are bound by pattern recognition receptors (PRR) (Takeuchi and Akira 2010). Missing major histocompatibility (MHC) class I molecules or non-self (e.g. allogeneic or xenogeneic cells) MHC are recognized by natural killer cell receptors (Fischer, Koppang and Nakanishi 2013, Raulet 2006). Foreign non-self peptides are presented through MHC class I (intracellular) or through MHC class II (extracellular) to B- cell or T cell receptor complexes. This initial activation is regulated by humoral factors or cellular interactions (receptor-ligand interactions) resulting in the activation, proliferation and effector function within an immune response. Some of the cellular receptors are permanently expressed on all leukocytes on a high level (MHC class I), whereas others only are expressed during certain developmental or activation stages or on certain leukocyte populations (monocytes, granulocytes, NK cells, lymphocytes) (Murphy 2012, Biosciences 2010). For different mammals (man, mouse, rat, but also swine, cattle, dog), a system of characterized leukocyte surface molecules primarily based on the recognition of these molecules by specific monoclonal antibodies (mabs) was summarized at international workshops as clusters of differentiation (CD) (Cobbold and Metcalfe 1994, Hopkins, Ross and Dutia 1993, Haverson et al. 2001, Mason et al. 2001). Using these mabs, it is not only possible to characterize the developmental and functional stage of different leukocyte subpopulations but also to define the interactions between these populations. For bony fish, such a system does not exist. Only a limited number of mabs against leukocyte surface molecules is available and most of them are strongly specific for species (Köllner et al. 2004, Köllner et al. 2001, Zhang et al. 2010, Ramirez-Gomez et al. 2012, Wen et al. 2011, DeLuca, Wilson and Warr 1983, Toda et al. 2011, Toda et al. 2009, Takizawa et al. 2011a, Hetland et al. 2010, Araki et al. 2008). The goal of this PhD work, therefore, was to develop monoclonal antibodies against surface markers of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) T cell population (chapter 2). The lymphocytes are characterized by the expression of a T cell receptor complex composed of TCR chains (α and β) and CD3 chains (α, β, γ, δ, ε and ζ). Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) binds to MHC class I bound peptide on the infected host cell using their T cell receptor (TCR) and its co-receptor CD8 resulting in specific killing. Th cells recognize peptides through their T cell receptor (TCR) and their co-receptor CD4 after extracellular antigens uptake, processing and presentation via MHC class II by professional antigen presenting cells (macrophages, dendritic cells and B cells). During recent years, genes encoding MHC class I and II, TCR and their co-receptors CD8 and CD4 have been cloned in several fish species and antibodies have been developed to study protein expression in morphological and functional contexts. However, mabs specific for TCR or CD3 have not been established yet. Therefore, using pan-T cell marker specific mabs, the activation and kinetics of T cell subpopulation should be investigated (chapter 2). Moreover, a flow cytometry method was established using different lineage marker specific mabs to measure different leukocyte populations and their involvement in immune mechanisms of trout using a single tube assay (chapter 3). The first line of defense against altered body cells or pathogens is provided by evolutionarily ancient macrophages and natural killer (NK) cells. These innate mechanisms are well developed in bony fish. Two types of NK cell homologues have been described in fish: non-specific cytotoxic cells and NK-like cells (Shen et al. 2002, Shen et al. 2003, Shen et al. 2004, Fischer et al. 2013). Functional assays for innate and adaptive lymphocyte responses have been developed in only a few fish species. However, there are no tools available until now in trout to follow these cells directly in the immune response. The molecular characteristics and the expression on leukocyte subpopulations of CD56 were therefore analyzed. Furthermore, a mab that is specific for a molecule expressed only in NK cells but with uncommon expression kinetics was established (chapter 4). Overall, the established tools and methods allow a more detailed characterization of cellular immune mechanisms against intracellular pathogens in rainbow trout.
Introduction: For a successful pregnancy, a set of physiological requirements has to be fulfilled. The mother has to provide enough nutrients and the proper anatomical environment for the developing fetus and protect him and herself against pathogens. The cells of the im-mune system constantly monitor the organism in search for pathogens and mount a response to eradicate the threat. The favourable outcome of an immune response re-lays on the capacity of those cells to recognize structures that shouldn’t be present in the organism and the speed or strength at which the cells react. During pregnancy, however, a fetus is able to establish a firm contact with the endometrium of the mother and then grow for an extended period of time. This “exception to the rule” hides behind a set of fine-tuned regulations of the immune responses which are not completely un-derstood. Though many cell types have been extensively investigated in the past dec-ades, B cells play yet enigmatic roles. The aim of this work is to uncover the events occurring within the B cell development during pregnancy and to study the role of certain subtypes in healthy pregnancy and pregnancy miscarriage. Methods: For all experiments, 8-weeks-old female mice either non-pregnant, having normal preg-nancies or miscarriage were used. Organs were removed and cells isolated using standard protocols. The analysis of the population distribution was performed by Flow Cytometry. For in vitro experiments, specific cell subsets were isolated using MACS Cell Separation. Bio-plex method was used for the assessment of Immunoglobulin isotypes in serum, while CBA Array was the method used to measure cytokine levels in the supernatant of cell cultures. Statistical analysis was done using GraphPad Prism software. Results: Pregnancy had a strong impact on the murine B cell development. The restructuration of the B cell compartment could be appreciated already from the bone marrow progeni-tors, reduced in pregnant mice. Peripheral subsets drastically adapted their develop-mental pathways, with a drift towards the generation of marginal zone B cells. B cells also showed functional adaptations to gravidity, as evidenced by the changes in the immunoglobulin production and immunomodulatory capacity. Conclusions: For the first time a deep investigation of the consequences of pregnancy on the B cell development was performed, covering several aspects of B cell functionality. This work shows that B lymphocyte compartment is remodelled during pregnancy. Aberration of this process may lead to pregnancy complications including miscarriage.
Protamine is administered as protamine sulfate to reverse the anticoagulant effect of heparin following cardiopulmonary bypass surgery. Immunogenicity of protamine has been recognized for decades in several patient groups including vasectomized men, diabetic patients on protamine-containing insulin and patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. Anti-protamine/heparin antibodies are a newly described class of heparin-dependent antibodies found in about 30% of patients exposed to protamine and heparin during cardiac surgery. A subset of seropositive patients especially who tested positive for platelet-activating anti-protamine/heparin immunoglobulin G (IgG) antibodies before surgery have prolonged postoperative thrombocytopenia with an increased risk for arterial occlusions. Studies presented in this thesis shed light on potential approaches that may prevent antibody-mediated platelet activation by anti-protamine/heparin antibodies. Two approaches are presented in this thesis, partially desulfated heparin (ODSH) and low molecular weight protamine (LMWP). Our studies demonstrated the ability of ODSH to inhibit anti-protamine/heparin antibody-mediated platelet destruction in the NOD/SCID mouse model by: i) reduction of antibody binding to preformed protamine/heparin complexes, as shown by enzyme immunoassay, ii) interfering with the binding of protamine/heparin complexes to platelets as shown by flow cytometry and fluorescence microscopy, and iii) inhibition of antibody-mediated platelet activation. Interestingly, ODSH was also able to block ongoing platelet destruction by displacing pre-bound complexes from the platelet surface. In addition, our data suggest the use of synthesized LMWP as a substitute for protamine in heparin reversal. The in vitro investigations showed that synthesized LMWP efficiently neutralizes heparin using the activated partial thromboplastin time. Anti-protamine/heparin antibodies have low binding properties to LMWP/heparin complexes as indicated in enzyme immunoassay. The ability of platelet-activating anti-protamine/heparin antibodies to induce platelet activation in the functional assay was significantly reduced in the presence of LMWP/heparin compared to protamine/heparin complexes. Owing to findings obtained in our studies, both approaches might be a promising future option to reduce anti-protamine/heparin antibody-mediated adverse effects.
Die Transfusionsassoziierte Akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist die häufigste tödliche Nebenwirkung der Transfusion von Blutprodukten und wird oft durch mittransfundierte leukozytenreaktive Antikörper (AK) induziert. AK gegen das Humane Neutrophilenantigen (HNA)-3a verursachen häufig schwere Fälle der TRALI. HNA-3a ist auf dem Großteil der Blutzelltypen exprimiert und entsteht durch einen Einzelnukleotidpolymorphismus im Gen des „choline transporter-like protein 2“ (CTL2), welcher zur Substitution der Aminosäureposition 154 in der Sequenz des Proteins führt. Klinische Beobachtungen und zahlreiche Studien legen nahe, dass TRALI-induzierende AK die Akkumulation und Aktivierung von Granulozyten im Lungenkapillarbett verursachen. Durch den Zusammenbruch der Kapillarbarriere kommt es in der Folge zu einem Lungenödem. Die Entwicklung eines Hochdurchsatzverfahrens zur Detektion von HNA-3a-AK in Blutprodukten und die Identifizierung therapierelevanter Schaltstellen, im Pathomechanismus der HNA-3a-AK-induzierten TRALI, waren daher Hauptschwerpunkte dieser Studie. In diesem Zusammenhang wurde ein Nachweissystem für HNA-3a-AK auf der Grundlage von CTL2-Fragmenten etabliert. Ein Screening zahlreicher Anti-HNA-3a-Plasmen ergab, dass mit CTL2-Peptiden in Festphasentests jedoch nur etwa 50% aller HNA-3a-AK nachgewiesen werden können. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Detektion aller HNA-3a-AK nur mit zellbasierten Methoden möglich ist, bei denen CTL2 in seiner natürlichen Konformation vorliegt. Diese Studie leistet damit einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung des konformationssensitiven Epitops der HNA-3a-AK und identifiziert wichtige Grundvoraussetzungen für Methoden zum Nachweis dieser AK. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Interaktion zwischen HNA-3a-AK und Granulozyten. Dieser experimentelle Ansatz gründet auf histopathologischen Lungenuntersuchungen verstorbener TRALI-Patienten, die eine massive Akkumulation und Aggregation von Granulozyten in den Kapillaren aufzeigen. Aus diesem Grund erfolgte die Untersuchung dieser Interaktion zunächst hinsichtlich verschiedener Parameter, die zu einer gesteigerten Sequestrierung von Granulozyten in der Lunge führen können. Hierzu gehören die Granulozytenaggregation (GA), die Versteifung von Zellen und die Zelladhäsion. Die Modifikation des Standard-Granulozytenaggregationstests ergab, dass die HNA-2- und HNA-3a-AK-induzierte GA aktive Prozesse sind, welche unabhängig von Plasmafaktoren stattfinden, jedoch von der Aktivität einer bislang noch nicht identifizierten Serinprotease abhängig sind. Hierbei wurden potente Aggregationsinhibitoren identifiziert welche auch als potenzielle Therapeutika zur Behandlung von TRALI in Frage kommen. Mit Hilfe desselben Testsystems konnte ermittelt werden, dass voraktivierte Granulozyten eine erhöhte Aggregationsneigung aufweisen. Im Zusammenhang mit dem Schwellenwertmodell der TRALI liefert dieses Ergebnis eine mögliche Erklärung, warum Patienten mit schweren Vorerkrankungen häufiger an TRALI erkranken. Neben der GA wurden in dieser Studie zwei weitere Eigenschaften identifiziert, die eine Akkumulation der Zellen in den engen Lungenkapillaren erklären: deren Elastizität und Adhäsivität. Mithilfe der Rasterkraftmikroskopie wurde nachgewiesen, dass HNA-3a-AK eine Versteifung von Granulozyten induzieren. Ebenso wurde gezeigt, dass HNA-3a-AK das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18) auf der Granulozytenoberfläche aktivieren, was zu einer verstärkten Adhäsion der Zellen an Fibrinogen führt. Steifere und adhäsivere Granulozyten akkumulieren möglicherweise vermehrt in den Lungenkapillaren. Eine weitere wichtige Fragestellung dieser Studie war, ob HNA-3a-AK eine direkte Aktivierung von Granulozyten auslösen. Die Untersuchungen ergaben, dass die Aktivierung von CD11b, weder mit der Erhöhung der CD11b-Expression, bzw. mit der proteolytischen Abspaltung von L-Selektin, noch mit einer Sauerstoffradikalproduktion einhergeht. Dieses ungewöhnliche Muster an Veränderungen deutet nicht auf eine Aktivierung zytotoxischer Antworten hin. Seit kurzem ist bekannt, dass HNA-3a-AK Kapillarendothelzellen auch auf direktem Wege aktivieren und dass selbst in Granulozyten-depletierten Mäusen schwache TRALI-Symptome auftreten. Demzufolge ergibt sich ein neues Modell der HNA-3a-AK-induzierten TRALI: Nach Transfusion von HNA-3a-AK bleiben aggregierte, steifere und adhäsivere Granulozyten in den engen Lungenkapillaren stecken und interagieren dort mit dem aktivierten Gefäßendothel. Durch diese Interaktion kommt es vermutlich zur Aktivierung der Granulozyten und zu einer starken Inflammationsreaktion, welche eine weitere Zerstörung der Lungenkapillaren und schließlich ein schweres Lungenödem zur Folge hat. Die besondere Schwere der HNA-3a-AK-induzierter TRALI entsteht also vermutlich nicht aufgrund einer direkten und starken Granulozytenaktivierung, sondern vielmehr durch die gleichzeitige Beeinflussung verschiedener epitoptragender Zelltypen.
Sepsis ist die dritthäufigste Todesursache in Deutschland und verursacht jährliche Krankenhauskosten von mehr als 8 Mrd. €. Über die Pathophysiologie ist noch immer vieles unbekannt. Bei der Bekämpfung von extrazellulären Infektionserregern spielt vor allem das humorale Immunsystem eine wichtige Rolle, da die von B-Zellen/ Plasmazellen gebildeten Antikörper wichtige antiinfektive Agenzien darstellen. Dennoch ist die Rolle der B-Zellen bei einer Sepsis nicht gut verstanden. Ergebnisse aus Mausmodellen, aber auch aus klinischen Studien mit Sepsispatienten zeigen einerseits die vermehrte Apoptose von B-Zellen, anderseits wurde auch eine polyklonale B-Zellaktivierung beschrieben, die mit einem unspezifischen Anstieg der Antikörperkonzentrationen im Blut einhergeht.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob während einer systemischen bakteriellen Infektion, wie der Sepsis, auch eine Erreger-spezifische Antikörperantwort ausgebildet wird. Mit Hilfe von zwei serologischen Assays wurde die Antikörperantwort von Sepsispatienten gegen extrazelluläre Proteine von 16 typischen Sepsiserregern bestimmt. Anhand von Plasmaproben aus zwei prospektiven Studien konnte die Antikörperkinetik von einem Zeitpunkt vor der klinischen Diagnose bis maximal 16 Tage nach Diagnose ermittelt werden.
Mittels eines Simple Western Assays - einem semi-quantitativen Immunoblot-Assay - wurde zunächst die Erreger-spezifische Antikörperantwort von Patienten mit einer vorliegenden mikrobiologischen Erregerdiagnose untersucht. 54 % der Patienten zeigten eine spezifische humorale Immunantwort gegen den mikrobiologisch diagnostizierten Erreger, wohingegen die Antikörperspiegel für das Kontrollantigen TT unverändert blieben.
Zur Untersuchung der zweiten Patientenkohorte wurde ein Bead-basierter Suspensions-Array auf Grundlage der xMAP-Technologie (Luminex®) entwickelt. Der Infection Array ermöglichte die gleichzeitige Quantifizierung der spezifischen Antikörperantwort gegen 16 verschiedene Erreger. Bei 64 der 76 untersuchten Patienten wurden Anstiege der IgG-Antikörper gegen einen oder mehrere dieser Erreger beobachtet. In 62,5 % der Fälle stimmten diese Anstiege mit der mikrobiologischen Diagnose überein. Bei 20/64 Patienten wurden signifikante Anstiege der IgG-Spiegel spezifisch für einen oder zwei Erreger nachgewiesen, in 44/64 Fällen wurden Anstiege gegen mehr als zwei Erreger beobachtet. Bei Letzteren richtete sich die Antikörperantwort hauptsächlich gegen Enterokokken und Enterobacteriaceae, was primär auf zwei Ursachen zurückgeführt werden kann: (i) Ein Großteil dieser Patienten hatte einen intraabdominellen Infektionsfokus. Polymikrobielle Infektionen durch endogene Darmbakterien, typischerweise verursacht durch eine Darmruptur oder die Insuffizienz einer chirurgischen Darmnaht, sind hierbei ein plausibler Befund, der der mikrobiologischen Diagnostik offenbar häufig entgeht. (ii) Außerdem können Sepsis-bedingte Organstörungen zu einer gesteigerten Darmpermeabilität führen, die wiederum die Translokation intestinaler Bakterien erleichtert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass die beobachteten Antikörperreaktionen auf eine Antigen-spezifische Memoryantwort zurückzuführen sind. In etwa 2/3 der Fälle wird eine Sepsis endogen durch Bakterien des eigenen Mikrobioms verursacht. Entsprechend war es nicht überraschend, dass gegen alle untersuchten Erreger bereits vor der Infektion und auch bei gesunden Kontrollpersonen basale antibakterielle IgG-Spiegel gemessen wurden. Zudem waren die IgG-Anstiege oft bereits zwischen Tag 0 und Tag 8 zu beobachten. Bei einer Primärantwort mit dem Erreger würde die Aktivierung der Zellen und der Klassenwechsel der Antikörper deutlich mehr Zeit erfordern.
Die Untersuchung der Erreger-spezifischen Antikörperantwort hat gezeigt, dass ein serologischer Assay Rückschlüsse auf den Infektionserreger zulässt. Außerdem zeigen die Daten, dass auch Kommensale wie Darmbakterien das Immunsystem prägen, was wiederum Einfluss auf die humorale Immunantwort während einer Infektion haben kann. Dieser Aspekt wird bei Mausmodellen oft vernachlässigt, kann aber entscheidend für die Translation der Ergebnisse aus Tierversuchen auf den Menschen sein. Aber auch diagnostisch bietet der Infection Array Einsatzmöglichkeiten. Im Gegensatz zur konventionellen Erregerdiagnostik ist die Serologie robust gegenüber einer bereits begonnenen Antibiotikagabe, und sie könnte dabei helfen, zwischen einer Kontamination und dem Infektionserreger zu unterscheiden, z. B. im Fall von KNS wie S. epidermidis. Ebenso wäre der Einsatz bei Biofilm-assoziierten Infektionen wie z. B. Protheseninfektionen oder Endokarditis denkbar. Hier besteht die Infektion oft bereits lange asymptomatisch, bevor sie klinisch diagnostiziert wird. Bei Diagnose bestehen meist bereits erhöhte Antikörperspiegel, die sich von denen gesunder Individuen unterscheiden. Ein serologischer Test könnte hier invasive Eingriffe, um an Material für die mikrobiologische Diagnose heranzukommen, reduzieren und die Sensitivität der Erregerdiagnostik erhöhen. Durch den Einsatz rekombinanter Proteine kann die Spezifität des Assays in der Zukunft erhöht werden. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit bereits erste immunogene Proteine identifiziert. Durch die Verwendung rekombinanter Proteine wäre zudem zukünftig die Erweiterung des Erregerpanels um typische, aber womöglich schwerkultivierbare Erreger möglich. Damit könnte die Sepsisforschung Neuland betreten.
Hintergrund
Migräne ist eine hochprävalente Erkrankung, die bei betroffenen Patient*innen eine hohe Belastung sowohl durch die Kopfschmerzen an sich als auch durch die Einschränkung ihres Sozial- und Berufslebens hervorruft. Die Therapie besteht aus einer Akuttherapie der Kopfschmerzattacken sowie einer prophylaktischen Therapie zur Reduktion der Kopfschmerzfrequenz und -schwere. In der Prophylaxe stehen mit Antikörpern gegen das Calcitonin-gene-related-peptide (CGRP) und dessen Rezeptor erstmalig für die Migräne entwickelte gezielte prophylaktische Therapien zur Verfügung. Es stellt sich jedoch hierbei die Frage, ob CGRP-Antikörper lediglich symptomatisch in der Peripherie des trigemino-vaskulären-Systems wirken oder auch im zentralen Nervensystem die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen beeinflussen, was einer krankheitsmodifizierenden Wirkung entspräche. Ziel unserer Studie war es, die Nullhypothese einer rein symptomatischen Wirkung gegen die Alternativhypothese einer Krankheitsmodifikation und somit zentralnervösen Wirkung, zu prüfen, indem bei Patient*innen mit episodischer Migräne der nozizeptive Blinkreflex vor und nach der Behandlung mit CGRP-Antikörpern untersucht wurde.
Methoden
22 Patient*innen mit episodischer Migräne (21 Frauen, 46,2 ± 13,8 Jahre alt) und 22 alters- und geschlechts-gematchte Kontrollen wurden im Rahmen dieser prospektiven Beobachtungsstudie eingeschlossen. Sie erhielten einen umfassenden Fragebogen zur Erhebung demografischer Charakteristika sowie der Kopfschmerzanamnese. Es erfolgte eine Messung des Blinkreflexes (10 Durchgänge à 6 Stimuli) vor (V0) und 3 Monate (V3) nach der Behandlung mit CGRP-Antikörpern (Kontrollen wurden einmalig gemessen). Im Rahmen der Messung wurden wiederholt schmerzhafte Stimuli supraorbital appliziert, die direkte Rückschlüsse auf die zentralnervöse Erregbarkeit des Hirnstamms als pathophysiologisch zentralen Mechanismus im Rahmen der Migräneentstehung zulassen. Die Area-under-the-curve (AUC) der R2-Komponente der Muskelsummenaktionspotentiale des Blinkreflexes sowie das Habituationsverhalten (Regressionskoeffizient über mehrere Blöcke) der stimulierten sowie nicht-stimulierten Seite wurden über 10 Blöcke hinweg evaluiert (primärer Endpunkt). Es wurde jeweils zuerst ein Test auf globale Veränderungen durchgeführt, der dann durch post-hoc-Analysen weiter spezifiziert wurde.
Ergebnisse
Alle Patient*innen zeigten eine signifikante Reduktion der Kopfschmerztage/Monat (V0: 12,4±3,3, V3: 6,6 ± 4,9) nach Beginn der Behandlung mit einem CGRP-/Rezeptorantikörper. Auf der stimulierten Seite reduzierte sich die AUC signifikant in den Blöcken eins, zwei sowie acht (Fglobal=5,86, p<0,001; block 1: R2a_s: -28%, p<0,001). Auf der nicht-stimulierten Seite zeigten sich Block eins, zwei, drei, acht sowie zehn als signifikant reduziert (Fglobal=8,22, p<0,001, block 1: R2a_ns: -22%, p=0,003). Die Veränderung der Habituation erwies sich in den Blöcken sechs, sieben, acht und zehn auf der nicht-stimulierten Seite als signifikant (Fglobal=3,07, p<0,001; block 6: R2h_ns: r=-1,36, p=0,007). Weder die AUC noch die Habituation des ersten Messtermins (V0) korrelierte mit dem späteren klinischen Ansprechen, sodass kein Prädiktor für das Therapieansprechen detektiert werden konnte (binär logistische Regression; alle Prädiktoren p>0,05).
Diskussion & Zusammenfassung
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die dreimonatige Therapie mit CGRP-Antikörpern die Erregbarkeit des Hirnstamms als Antwort auf wiederholte schmerzhafte Stimuli bei Patient*innen mit Migräne normalisiert und liefert somit Hinweise für ein krankheitsmodifizierendes Potenzial. Veränderungen der Habituation korrelierten signifikant mit der Verringerung der Kopfschmerz-Frequenz, weitere Studien sind jedoch nötig, um zu eruieren, ob Parameter als Prädiktor geeignet sind um eine Voraussage über das Therapieansprechen und das Risiko einer Verschlechterung nach Beendigung der Therapie zu ermöglichen.