Refine
Year of publication
- 2006 (2) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Language
- German (2) (remove)
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- no (2)
Keywords
- RNS (2) (remove)
Die Immobilisation von Muskulatur ging bisher immer mit einer Athropie des Muskels und somit mit einer verringerten Vaskularisierung und Durchblutung einher. Allerdings wurden diese Ergebnisse durch eine Denervierung des Muskels erzielt, oder über eine Unterbrechung der Reizleitung am synaptischen Spalt mit z. B. Tetrodotoxin. Dadurch konnte überhaupt keine Kontraktion der betroffenen Muskulatur stattfinden. Bei der Immobilisation von Muskulatur mit dem osteoinduktiven Knochenersatzmaterial P3HB bleibt die Muskulatur innerviert und durchblutet, es kann eine isotone Kontraktion stattfinden. Dadurch kommt es zu mehreren, sich überlagernden Vorgängen im Muskel. Die Muskulatur reagiert auf die Krafteinwirkung des osteoinduktiven Implantates, der Knochenersatz selbst und die Stimulation des Muskels über die Motoneuronen haben einen Einfluss auf die Veränderungen des umliegenden Gewebes und auf dessen Durchblutung. Die Myosine sind die Hauptkomponenten des kontraktilen Apparates der Muskulatur. Sie reagieren auf Beanspruchung bzw. mechanische Kraft in einer Umwandlung ihrer Myosin-Heavy-Chain- (MHC-) Komposition, einer sogenannten Shift der Muskelfasern. Diese Umwandlung geht mit einer Veränderung des metabolischen Profils, von der anaeroben hin zur aeroben Energiegewinnung oder umgekehrt, einher. Es kommt zu einer Veränderung der Mitochondrien- und Kapillardichte. Die Muskulatur kann folglich auf äussere Einflüsse mit einer Reorganisation bzw. Anpassung ihrer Struktur reagieren Veränderungen in der Genexpression in den Zellen eines Organismus gehen immer mit einer Veränderung des mRNA-Gehaltes einher. Dies ist ein Mechanismus, mit dem Organismen auf Umwelteinflüsse reagieren und sich phänotypisch adaptieren. Mit der in dieser Arbeit durchgeführten Quantifizierung der mRNA wurde folglich die Anpassung der Myosine des m. latissimus dorsi an das implantierte Knochenersatzmaterial untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche, langfristige Verschiebung der Muskelfasertypen auch hinsichtlich eines erhöhten regenerativen Potentials. Der Versuchsaufbau und das Tiermodell bringen neue zu berücksichtigende Parameter und Fragestellungen in die gegebene Thematik mit ein. Die experimentelle Arbeit schafft eine Basis für weitere Versuche mit ähnlicher Thematik bzw. vergleichbaren Tiermodellen.
Verschiedene Strategien sind heute in der Entwicklung, um mit Hilfe von RNA Molekülen die genetische Information auf Transkriptebene zu korrigieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Twinribozyme durch den Austausch kleiner RNA Fragmente das Potential zur RNA Reparatur und ortsspezifischen RNA Funktionalisierung besitzen. Das Hairpinribozym katalysiert je nach Stabilität des Ribozym-Substrat-Komplexes die Spaltung bzw. die Ligation seines Substrats. Twinribozyme wurden durch Verknüpfung von zwei Hairpinribozymeinheiten entwickelt. Die Spaltung eines RNA Substrates an den zwei katalytischen Stellen produziert drei Fragmente: beide äußeren binden fest an das Twinribozym, während die Bindung des mittleren Fragments durch einen Vier-Nukleotid-Loop im Ribozymstrang destabilisiert wird. Dies fördert dessen Dissoziation gegenüber dessen Rückligation. Die Zugabe eines so genannten Reparaturoligonukleotids, das stabil an das Twinribozym anstelle des mittleren Fragments bindet, begünstigt dessen Assoziation zum Ribozym und dessen Ligation zu den übrigen Substratfragmenten. Das Ergebnis ist ein um vier Nukleotide verlängertes Reparaturprodukt. Dies stellt ein Modell für die Reparatur einer Vier-Nukleotid-Deletion auf mRNA Ebene dar. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die bestehende Reaktion kinetisch und thermodynamisch zu charakterisieren. Weiter wurde das Potential von Twinribozymen für die Reparatur anderer RNA Defekte und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung untersucht. Schließlich wurde die Twinribozym vermittelte Reparaturreaktion in Zellkulturen getestet. Beim ursprünglichen Vier-Nukleotid-Deletionsmodell wurden unter äquimolaren Konzentrationen aller Fragmente und bei 10 mM Magnesiumchlorid und 37 °C 35 % Reparaturprodukt erhalten. Kinetische Untersuchungen jeder Einzelreaktion konnten zeigen, dass die Tamdemkonfiguration des Twinribozyms die Spalt- und Ligationseigenschaften nicht beeinträchtigt. In thermodynamischen und kinetischen Bindungsuntersuchungen von Modellduplexen, die der Austauschregion ähneln, wurde gezeigt, dass die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes den Austausch der mittleren Fragmente stark fördert. Eine Voraussetzung zur biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen von RNA Molekülen ist ihre ortsspezifische Markierung. Dies wird für bis zu 80 Nukleotide lange RNA Stränge durch chemische Synthese erreicht. Längere modifizierte RNA Moleküle werden mühsam durch Ligation mehrerer Stränge synthetisiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, native RNAs durch in situ Hybridisierung zu markieren. Keine Methode steht somit zur Verfügung, um in vitro Transkripte oder native RNAs intern und kovalent zu modifizieren. Ein synthetisches Substrat konnte ohne Ausbeuteverluste mit verschiedenen Fluoreszenzmolekülen, die chemisch in das Reparaturoligonukleotid eingebaut wurden, mit dem Twinribozym markiert werden. Verschiedene Transkripte wurden ebenfalls erfolgreich mit dem Twinribozym funktionalisiert. Drei verschiedene Modelle wurden untersucht: die Markierung der Transkripte resultierte entweder in einer Verlängerung um vier Nukleotide, in der Einführung von drei Einzelbasenmutationen oder in gar keinem Sequenzunterschied. Um die Ribozymzugänglichkeit der Zielsequenzen zu verbessern wurden erhöhte Temperaturen sowie DNA Oligonukleotide verwendet, die an das Transkript im Bereich der Flanken zur Ribozymbindungssequenz binden. Markierungsausbeuten von jeweils 53, 47 und 11 % wurden erzielt. Die potentielle Anwendung von Twinribozymen für die therapeutische RNA Reparatur erfordert eine effektive Zellaktivität. In vitro Versuche konnten zeigen, dass Twinribozyme unter zellähnlichen Bedingungen aktiv sind. Ein Versuch, die bestehende in vitro Reaktion in menschlichen Zellkulturen durchzuführen und das Reparaturprodukt nach Zelllyse nachzuweisen, scheiterte, da das Ribozym während der Analyse nicht deaktiviert werden konnte. Weiter wurde ein Luciferasereportergen durch die Einführung verschiedener Mutationen so deaktiviert, dass ein neues entwickeltes Twinribozym die Fehler auf mRNA Ebene reparieren sollte. In vitro Versuche mit kurzen synthetischen Substraten zeigten, dass das Ribozym die Fehler effizient prozessiert. Reparaturansätze mit den mutierten Transkripten lieferten aber Reparaturausbeuten unter 1 %, möglicherweise wegen der schlechten Ribozymzugänglichkeit der langen Transkripten. Durch Lumineszenzzellversuche konnte leider keine RNA Reparatur nachgewiesen werden. Twinribozyme erlauben den Austausch kurzer RNA Fragmente innerhalb synthetischer RNAs und Transkripte und akzeptieren dabei modifizierte Sequenzen. Dies öffnet Twinribozymen den Weg als molekulares Werkzeug für die RNA Reparatur und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung. Die Erarbeitung von Möglichkeiten, die schlechte Zugänglichkeit der Zielsequenzen zu umgehen, sowie der Erhalt positiver Zellversuche werden über die Verwendung dieses potentialreichen RNA Werkzeugs entscheiden.