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The biodiversity of marine microorganisms opens a promising potential for the discovery of new technical enzymes. During this study a characterization of marine microorganisms, isolated from Arctic or Antarctic ice, sea water or sediment from the ocean was performed based on a comprehensive strain collection at the Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung. These marine psychrophilic bacteria indicated a wide spectrum of extracellular cold-active enzymes. 16S rRNA sequencing revealed that many of these psychrophilic bacteria represent new species. Characterization of selected isolates by means of transmission electron or raster electron microscopy showed remarkably pleomorphic cellular structures throughout their growth. The major part of this thesis focuses on a marine Antarctic, psychrophilic bacterium (strain ANT/505) isolated from sea ice covered surface water from the Southern Ocean, which was identified to express a very uncommon enzymatic activity for the marine environment, namely a pectinolytic activity. The sequencing of the 16S rRNA of isolate ANT/505 and biochemical tests indicated a taxonomical affiliation to the specie Pseudoalteromonas haloplanktis. The supernatant of this bacterial isolate showed after growth on citrus pectin three different pectinolytic activities. By activity screening of a genomic DNA library of isolate ANT/505 in Escherichia coli, two different pectinolytic clones could be isolated. Subcloning and sequencing revealed two open reading frames of 1671 and 1968 nt corresponding to proteins of 68 and 75 kDa. The deduced amino acid sequence of the two orfs showed homology to pectate lyases from Erwinia chrysanthemi and Aspergillus nidulans. The pectate lyases contain signal peptides of 17 and 26 amino acids length that were correctly processed after overexpression in E. coli BL21. Both enzymes were purified by anionic exchange chromatography. Maximal enzymatic activities for both pectate lyases were observed at a temperature of 30°C and a pH range of 9-10. The Km values of both lyases for pectate and citrus pectin were 1 g⋅l-1 and 5 g⋅l-1, respectively. Calcium was required for activity on pectic substrates, while the addition of 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) resulted in complete inhibition of the enzymes. These two cold-adapted enzymes represent the first pectate lyases isolated and characterized from a marine bacterium. Further cloning and sequence analyses revealed that PelA from P. haloplanktis is an exceptionally big bifunctional enzyme featuring pectate lyase and pectin methylesterase activity. The deduced amino acid sequence of the pectin methylesterase domain showed homology to group I pectin methylesterases from Erwinia chrysanthemi and Erwinia carotovora. The pectin methylesterase domain of PelA was found to show highest homology to a potential pectin methylesterase from Saccharophagus degradans strain MD2-40. Maximum pectin methylesterase activity of PelA was detected at a pH of 7.5 and a maximum temperature of 30°C. This cold-adapted enzyme revealed high remaining pectin methylesterase activity at low temperatures around 5°C and was quickly unstabilized at temperatures above 45°C. The analysis of the localization of the two pectinolytic genes on the genome of P. haloplanktis ANT/505 revelaed that these pectinase genes are expressed from independent cistrons, which are not clustered but located at distant positions on chromosome I of the P. haloplanktis genome. It was found that the transcription of both pectinase genes is induced by the presence of pectin. By means of primer extension the promoter regions of both cistrons were detected.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden in der 1. eigenen Beurteilung der Bedeutung der Hepatitis B-Infektion bei Hämodialysepatienten mittels einer retrospektiven Krankenblattanalyse im etablierten Dialysezentrum Stralsund, 2. Ermittlung der Serokonversionsraten von Hämodialysepatienten sowie präterminal niereninsuffizienten Patienten nach einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 3. Untersuchung der SCN‾-Spiegel bei Hämodialysepatienten, Einfluß der Hämodialyse auf diese Spiegel und Eruierung der Möglichkeiten zur Erlangung physiologischer Verhältnisse, 4. Untersuchung des Einflusses einer oralen SCN‾-Supplementierung auf die Immunantwort bei Hämodialysepatienten im Rahmen einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 5. Spiegelbestimmungen von Neopterin und Procalcitonin bei Hämodialysepatienten und mögliche Einflüsse einer Immunisierung gegen Hepatitis B auf deren Höhe. Mittels der eigenen retrospektiven Krankenblattanalyse konnte die deutlich höhere Prävalenz hinsichtlich des Auftretens der Virushepatitis B bei Hämodialysepatienten herausgearbeitet werden. Zudem waren nicht nur hohe Infektionszahlen sondern auch häufiger chronische Verläufe nachweisbar. Aufgrund der ebenfalls darstellbaren deutlich reduzierten Serokonversionsraten nach eingeführter Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten und präterminal niereninsuffizienten Patienten blieb die Prävalenz der Hepatitis B-Infektion im Dialysezentrum weiter hoch. Erst die Möglichkeit einer konsequenten Distanzierung von Patienten mit serologischen Zeichen einer Virushepatitis B gestaltete die Prävention neuer Infektionen erfolgreich. In der Untersuchung konnte gezeigt werden, dass sich die SCN‾-Spiegel der Dialysepatienten vor der Hämodialyse im unteren Bereich der physiologischen Norm und nach erfolgter Hämodialyse unter der physiologischen Norm befinden. Mittels oraler Substitution von SCN‾ gelingt ein vollständiger Ausgleich des hämodialysebedingten SCN‾-Verlustes und führt zu durchgängig physiologischen Spiegeln. Die Serokonversionsrate nach erfolgter Boosterung der Hepatitis BImmunisierung konnte bei den mit zusätzlich SCN‾ versorgten Patienten signifikant gesteigert werden. Bei 12 der 14 in den Versuch einbezogenen Hämodialysepatienten konnte ein stimulierender Effekt unabhängig von der Zahl der vorangegangenen Boosterimpfungen beobachtet werden. Eine Beziehung zwischen Impferfolg und Parametern des Dialysestatus der untersuchten Patienten konnte nicht hergestellt werden. Somit gelingt auch mittels dieser Untersuchung die wünschenswerte Unterscheidung zwischen Respondern und Nonrespondern nicht. In der vorliegenden Untersuchung konnte bestätigt werden, dass bei Hämodialysepatienten die Neopterinspiegel gegenüber der Norm erhöht sind. Dabei war die individuelle Streuung der Neopterinspiegel dieser Patienten hoch. So macht erst die Kenntnis der individuellen Neopterinspiegelverhältnisse der Hämodialysepatienten eine diagnostische Verwertung hinsichtlich Erkennung von Viruserkrankungen möglich. Die Neopterinspiegel stiegen nach Immunisierung gegen Hepatitis B an, das Maximum dieses Anstieges trat jedoch zu unterschiedlichen Zeiten nach der Impfung auf. Diese erhöhten Neopterinspiegel blieben noch mehrere Tage nach der Impfung nachweisbar. Zudem konnte eine Beziehung zwischen Anstieg des Neopterinspiegels nach erfolgter Immunisierung und Anstieg des Antikörpertiters nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Hämodialysepatienten wiesen überwiegend stabile, geringradig über der physiologischen Norm liegende Procalcitoninspiegel auf. Signifikante Unterschiede der Procalcitoninspiegel vor und nach Hämodialyse waren nicht nachweisbar. Berücksichtigt man die geringradige Erhöhung der stabil nachweisbaren Procalcitoninspiegel bei Hämodialysepatienten, kann das Procalcitonin als diagnostisches Merkmal bei bestimmten inflammatorischen Reaktionen genutzt werden. Beziehungen zwischen Höhe der Procalcitoninspiegel und der erfolgten Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten ergaben sich nicht.
Synthesis and evaluation of pseudosaccharin amine derivatives as potential elastase inhibitions
(2006)
Elastase is a serine protease which by definition is able to solubilize elastin by hydrolytic cleavage.Human Leukocyte Elastase, HLE (EC 3.4.21.37), is involved in deseases such as adult respiatory distress syndrome, pulmonary emphysema, smoking related chronic bronchitits, ischemic-reperfusion injury and rheumatoid arthritis. Hence, the elastase inhibitors have clinical utility in these diseases. Heterocyclic compounds are one of the most important classes of the elastase inhibitiors. In the present work different pseudosaccharin amine derivatives were synthesized and tested against the elastase. The synthesis of pseudosaccharin amine dervatives was carried out from the amines and(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylsulfanyl)acetonitrile in different solvents. Futhermore, the pseudosaccharin amines were obtained by refluxing the thiosaccarinates in absolute acetic acid. The reaction of 3-ethoxybenzo[d]isothiazole 1,1-dioxide with different amines in dioxane under reflux resulted into the desired pseudosaccharin amine derivatives in higher yields. Pseudosaccharin chloride was also used in the synthesis of these derivatives.A detail study of the synthesis of pseudosaccharin amine dervatives from the above differnt routes is described. Peptides were also synthesized by using the mixed anhydride method. The ester, acid, amide and peptide derivatives were tested against the Porcine Pancreatic Elastase (PPE) and Human Leukocyte Elastase (HLE). The esters were found to be the reversible inhibitors of HLE. The process of the PPE inhibion by cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate was studied. Michaelis-Menten curve and Lineweaver-Burk double reciprocal plot were constructed in order to study the kinetic of this reaction. The compounds showing high inhibition of HLE were further stuied for determination of their inhibitory constant(Ki). The esters were found to be the higly active compounds against HLE. The cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate and cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate showed the competitive reversible inhibition of HLE.The cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate is highly potent inhibitor of HLE. The possible mechanism of inhibition of elastase by these compounds is discussed. Molecular modelling of some of the ester derivatives is also discussed.