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Im Rahmen dieser Dissertation konnten zahlreiche unterschiedliche Substanzklassen mit Hilfe der Laccase verknüpft werden. Die dabei synthetisierten Verbindungen können nicht nur als Feinchemikalien in der organischen Synthese sondern auch für die Herstellung von antimikrobiellen und antikanzerogenen Medikamenten oder funktionellen Biomaterialien genutzt werden. Potential der Laccase zur Herstellung von Wirkstoffen: Die Synthese von antimikrobiellen Wirkstoffen durch die laccasekatalysierte Derivatisierung konzentrierte sich vor allem auf verschiedene Azole und Morpholine. Die isolierten Derivate wurden hinsichtlich ihrer biologischen Wirkung untersucht. Azole und Morpholine sind Bestandteil verschiedener antifungaler Medikamente und Fungizide. Eine Derivatisierung dieser Substanzklassen könnte neue Verbindungen mit neuen Eigenschaften, wie z.B. einem erweiterten Wirkungsspektrum, führen. Synthese der potentiellen Wirkstoffe 1. Für die laccasevermittelte Derivatisierung der Azole und Morpholine wurden para-dihydroxylierte aromatische Verbindungen als Ausgangsstoffe eingesetzt. Im Verlauf der Reaktion erfolgte eine laccasekatalysierte Oxidation der jeweiligen para-dihydroxylierten aromatischen Verbindung zum Chinon, welches dann einer Aminierung durch eine intermolekulare Michael-Addition (1,4-Addition) unterlag und in der Bildung von C N verknüpften monoaminierten Produkten resultierte. Bei einer erneuten laccasevermittelten Oxidation des gebildeten monoaminierten Produktes und anschließender Aminierung entstanden diaminierte Produkte. Die gebildeten Hybridmoleküle bestanden folglich aus einem Molekül der para-dihydroxylierten aromatischen Verbindungen in chinoider Form und einem (monoaminiertes Produkt; Dimer) bzw. zwei (diaminiertes Produkt; Trimer) Molekül/en des Morpholins bzw. Azols. 2. Darüber hinaus wurde die laccasekatalysierte Synthese von neuartigen Zyklisierungsprodukten nachgewiesen, deren Bildung weder mittels Laccase noch mit chemischen Syntheseverfahren bislang beschrieben wurde. Die wichtigsten Gruppen dieser neuen Zyklisierungsprodukte sind Cycloheptene und Cyclooctene. Testung der potentiellen Wirkstoffe hinsichtlich ihrer biologischen Wirkung 3. Zur Prüfung der antimikrobiellen Aktivität gegenüber Candida maltosa und bei ausgewählten Verbindungen gegenüber Candida albicans wurde die Methode des EUCAST discussion document E.Dis 7.1 über die MHK-Bestimmung in Mikrotiterplatten modifiziert. Ein Vergleich der hemmenden Wirkung von ausgewählten Produkten und der für deren Synthese genutzten Ausgangsstoffe gegenüber dem Testorganismus Candida maltosa mit Candida albicans ergab eine weitestgehende Übereinstimmung der MHK-Werte und ermöglicht in hohem Maße die Übertragung der ermittelten MHK-Werte mit Candida maltosa auf die medizinisch relevante Hefe Candida albicans. Zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität wurde ein Agardiffusionstest eingesetzt und die Testung der zytotoxischen Aktivität erfolgte gegenüber einer humanen Blasenkrebszelllinie. 4. Die neu synthetisierten Verbindungen wiesen sowohl eine antibakterielle und antifungale Aktivität als auch eine zytotoxische Wirkung auf. Die Dimere zeigten z.B. eine antibakterielle und antifungale Wirkung während die Trimere keine oder nur vereinzelt eine antimikrobielle Wirkung aufwiesen. Die getesteten Zyklisierungsprodukte zeigten meist nur geringe hemmende Wirkung auf Candida maltosa. Potential der Laccase zur Herstellung von Biomaterialien: Als Vorbild für die Herstellung von Biomaterialien diente der von marinen Muscheln zur Anheftung an den Untergrund gebildete Klebstoff, der durch Polymerisationsreaktionen von Peptiden entsteht. Derartige Polymere könnten zur Herstellung von bioresorbierbaren Klebstoffen, z.B. für die Gesichtschirurgie zur Klebung von Knochensplittern, genutzt werden. 1. Die Derivatisierung von Aminosäuren und Peptiden mit para- und ortho-dihydroxylierten aromatischen Substanzen führte zur Bildung sowohl von di- und trimeren als auch polymeren Reaktionsprodukten. Die Laccase ermöglichte die Derivatisierung von geschützten aber auch ungeschützen Aminosäuren und Peptiden in einer sogenannten "one pot" Reaktion. 2. Ein Vergleich der Reaktionen mit Laccase und dem chemischen Katalysator Natriumiodat ergab für die Reaktionen der Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tryptophan mit 2,5-Dihydroxyacetophenon einen klaren Vorteil der Laccase. Die Ergebnisse der einzelnen Reaktionen belegen, dass eine effektive Derivatisierung von verschiedenen Substanzklassen mit Hilfe der Laccase als einem biologischen Katalysator möglich ist. Die relativ einfach durchführbare und effiziente laccasevermittelte Reaktion kann dabei auch für die Herstellung von neuartigen Verbindungen mit biologischer Wirkung genutzt werden. Die weitere Charakterisierung der Wirkstoffe wird zeigen, ob und inwieweit diese Verbindungen konkurrenzfähig gegenüber Standardverbindungen sind, die in der Human- und Veterinärmedizin aber auch der Landwirtschaft eingesetzt werden.
Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze
(2009)
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Bakterien- und Hefestämme der Stammsammlung Biologie des Institutes für Mikrobiologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (SBUG) auf einen Umsatz von 9H-Carbazol untersucht. Neben Ralstonia spec. SBUG 290, Rhodococcus erythropolis SBUG 271 sowie den zwei im Rahmen dieser Arbeit als Pseudomonas putida identifizierten Stämmen SBUG 272 und SBUG 295 zählten zu den Bakterienstämmen 22 weitere noch nicht abschließend charakterisierte Isolate. Die geprüften Hefestämme umfassten neben 7 Vertretern der Gattung Trichosporon auch 19 nicht identifizierte Stämme. Basierend auf der für diese Mikroorganismen bereits nachgewiesenen Verwertung von Biphenyl beziehungsweise Dibenzofuran bestand die Hypothese, dass diese Stämme aufgrund von Strukturanalogien der Substrate auch in der Lage sind, weitere Heterozyklen zu transformieren. Angesichts des sehr breiten pharmakologischen Wirkungs- und Anwendungsspektrums von Carbazol-Derivaten wurde primär geprüft, inwieweit sich mit Hilfe dieser spezialisierten Mikroorganismen hydroxylierte Carbazol-Derivate als Ausgangssubstanzen für spätere Synthesen herstellen lassen. Da die verwendeten Bakterien im Gegensatz zu den Hefen zu einer Transformation von 9H-Carbazol befähigt waren, wurden mit diesen Stämmen Untersuchungen zur mikrobiellen Transformation von insgesamt 9 zusätzlichen stickstoffhaltigen Biarylverbindungen (2,3,4,9-Tetrahydro-1H-carbazol, 9-Methyl-9H-carbazol, Carbazol-9-yl-methanol, Carbazol-9-yl-essigsäure, 3-Carbazol-9-yl-propionsäure, 2-Carbazol-9-yl-ethanol, Acridin, 10H-Acridin-9-on, Phenazin) durchgeführt. Aufgrund der im Unterschied zu bisherigen Publikationen zum Umsatz von Biarylen festgestellten abweichenden Produktbildung bei Inkubation mit 9H-Carbazol wurden die Bakterienstämme für vergleichende Analysen ebenfalls auf die Transformation von Dibenzothiophen sowie 9H-Fluoren geprüft. Insgesamt wurden bei der Transformation der getesteten Biarylverbindungen 55 Produkte untersucht, von denen 34 bislang für Bakterien noch nicht beschrieben wurden. Basierend auf GCMS-, LCMS- und NMR-Analysen konnten insgesamt 29 Verbindungen identifiziert und für 14 Transformationsprodukte anhand der erhaltenen Daten vorläufige Strukturvorschläge unterbreitet werden. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit für weitere 8 der in den Versuchen gebildeten Produkte bereits eine erste strukturanalytische Charakterisierung vorgenommen. In weiterführenden Versuchen wurden die durch die Bakterienstämme gebildeten Produkte als Substrate eingesetzt, um zu analysieren auf welche Weise die über primäre Hydroxylierungsreaktionen hinausgehenden Transformationen dieser Substanzen erfolgen. Dazu wurden, in erster Linie am Beispiel von Ralstonia spec. SBUG 290, insgesamt 28 der gebildeten Produkte auf einen weiteren Umsatz geprüft, darunter 14 Substanzen, die kommerziell nicht verfügbar sind und daher zuvor in größeren Mengen aus den Transformationsansätzen gereinigt wurden. Basierend auf diesen Untersuchungen konnten schließlich anhand der nachgewiesenen Produkte Aussagen zu den durch die Stämme katalysierten Transformationswegen abgeleitet werden. In Versuchen mit dem rekombinanten Stamm Escherichia coli DH5alpha SBUG 1575, der die Gene bphA1–A3 der Biphenyl-2,3-dioxygenase aus Ralstonia spec. SBUG 290 trägt, wurde die Beteiligung dieses Enzyms am Umsatz der eingesetzten Biarylverbindungen untersucht.
The introduction of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) enabled the separation and visualization of a substantial fraction of an organism’s entire proteome, and when mass spectrometry entered protein science, these proteins became even amenable to identification on a grand scale. Nevertheless, important classes of proteins elude a separation on classical 2 D gels, as the ones showing extremes in isoelectric point or molecular weight, and foremost very hydrophobic proteins naturally embedded in lipid membranes. This thesis aimed at the establishment and adaptation of alternatives to 2-D PAGE. New techniques allowing for an identification and quantification of critical protein classes were designed and adopted to physiological questions in the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. In a comprehensive study on cytoplasmic proteins of S. aureus COL the number of proteins identified by a 2-D gel based approach could be extended by 650 proteins employing gel free technologies. Application of these complementary methods resulted in the establishment of a comprehensive reference map of the cytosolic proteome in growing and non-growing S. aureus cells which can serve as basis for further physiological investigations. Gel free separation of complex protein digests was likewise used in a quantitative study on heat stress in B. subtilis. By implementation of the iTRAQ® technology four different physiological states could be relatively quantified in one experiment. A parallel generation of 2-D gel based data enabled the depiction of strengths and weaknesses of protein quantitation by both, spot intensities on 2-D gels and iTRAQ® signal intensities in MS/MS spectra. Furthermore, new insights into heat sensitivity of pivotal enzymes involved in amino acid biosynthesis could be delivered. The institution of gel free approaches and advancements in 2-D PAGE provide the tools to penetrate into yet unamenable scopes of proteomes. A review on proteome coverage in B. subtilis gives an overview on the strategies which have been explored for most comprehensive protein identification in various sub-proteomes. Although more than one third of B. subtilis’ open reading frames could be demonstrated on protein level, one has to be aware of the fact that it still is a long way to achieve complete coverage of its proteome. Integral membrane proteins make up about one quarter of the entirety of proteins in a cell. Despite their large portion they are clearly understudied due to the intricacy of identification. Their low abundance and non-accessibility of membrane-spanning domains represent major experimental difficulties. The establishment of a protocol efficiently depleting cytosolic proteins by membrane shaving and targeting trans-membrane peptides by novel digestion strategies essentially facilitated identification of highly hydrophobic integral membrane proteins. This protocol was not only successfully applied to the membrane proteome of growing S. aureus cells, but was shown to be applicable in B. subtilis as well. Both studies displayed the novel membrane shaving approach to be highly complementary to a previously established separation of membrane proteins via 1 D PAGE. A combination of the two techniques resulted in identification of about half of the theoretical membrane proteome in both bacteria, and hence layed the foundation for advanced and quantitative analyses. In this regard, 14N/15N metabolically labeled membrane samples of growing and non-growing cells of S. aureus COL were relatively quantified revealing a significant difference in amount for more than one third of the proteins. A corresponding experimental setup was used to compare the membrane proteomes of S. aureus SA113 and its mutant deficient in the lysylphosphatidylglycerol synthetase MprF. Interesting quantitative differences were obtained for proteins most likely involved in the regulation of cellular surface net charge as well as for virulence-associated proteins.
Bisphenol A (BPA) ist ein Umweltschadstoff, der für die Produktion von Polykarbonatplastik und Epoxydharzen verwendet wird. Aufgrund seiner weltweiten Verbreitung, seiner Persistenz in der Umwelt und vor allen Dingen wegen seiner endokrinen Wirkung, stellt diese Verbindung eine große Gefahr für die Tier- und Pflanzenwelt sowie für den Menschen dar. Deshalb wurde aus einem bepflanzten Festbettreaktor, welcher mit BPA behandelt wurde, der Bakterienstamm RW4 isoliert, der fähig ist Bisphenol A als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. Das Gram-negative Bakterium wurde mittels 16S rRNA-Analyse als Cupriavidus basilensis identifiziert und mittel der BIOLOG-Methode charakterisiert. Der Bakterienstamm kann ein sehr großes Spektrum an aliphatischen Stoffen wie Aceton, Ethanol, 1-Oktanol und aromatischen Verbindungen wie Phenol, Mono- und Dihydroxybenzoesäuren für das Wachstum nutzen. C. basilensis RW4 baut Bisphenol A nur sehr langsam ab. Es ist jedoch möglich den BPA-Abbau sowohl in Schüttelkulturen und als auch in kontinuierlich laufenden Sandsäulen durch Zugabe von Phenol als Co-Substrat und Wachstumsstimulanz deutlich zu steigern. Die erfassten Abbauintermediate wie 4-Hydroxyacetophenon und 2-(4-Propanol)-phenol wiesen darauf hin, dass C. basilensis RW4 einen ähnlichen Abbauweg nutzt wie Sphingomonas sp. TTNP3 von Kolvenbach et al. (2007) nutzt. In weiteren Untersuchungen, wurde die toxische Wirkung von Bisphenol A auf den Standardmikroorganismus Pseudomonas putida P8 in Schüttelkulturen und in kontinuierlich laufenden Sandsäulen analysiert. Es zeigte sich, dass BPA das Wachstum von P. putida P8 hemmt und Modifikationen in der Zusammensetzung der Phospholipide in der Membran hervorruft. P. putida P8 reagierte unmittelbar auf das Einwirken von BPA auf der Membranebene durch Veränderung des Verhältnisses der trans-ungesättigten Fettsäuren zu den cis-ungesättigten Fettsäuren, was schon in früheren Untersuchungen für andere organische Lösungsmittel beschrieben wurde. Dementsprechend wurde eine Korrelation zwischen der BPA-Konzentration und dem Anstieg des trans-cis-Verhältnisses ermittelt. Weil diese Anpassungsreaktion eine kurzfristige Antwort auf den einwirkenden Stressor ist, konnte der Anstieg des trans-cis-Verhältnisses nur kurz nach BPA-Zugabe erfasst werden. Somit kann das trans-cis-Verhältnis nur als temporärer Biomarker für die Toxizität von BPA in Schüttelkulturen genutzt werden, jedoch nicht in langfristig laufenden Sandsäulen.
Kurzfassung: Im Rahmen dieser Arbeit sollten 10 verschiedene organische Schadstoffe und Lösungsmittel, darunter BTEX-Verbindungen (Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol), (chlorierte) Phenole und aliphatische Alkanole hinsichtlich ihrer Wirkung auf das Wachstum von Modellorganismen, die unter unterschiedlichen anoxischen Bedingungen wuchsen, geprüft werden. Dabei wurden mit Thauera aromatica, Geobacter sulfurreducens und Desulfococcus multivorans – Arten untersucht, die unterschiedlichen anaeroben Stoffwechselgruppierungen angehören. Trotz geringerer Wachstumsraten der untersuchten anaeroben Mikroorganismen, wurde die Toxizität der Chemikalien mittels eines Wachstumshemmtest abgeschätzt, der bereits für aerobe Bakterien etabliert wurde. Die Toxizitäten der Verbindung wurden dabei als 50% Effektive Konzentrationen (EC50) ausgedrückt, also der Chemikalienkonzentration, die benötigt wird um die Wachstumsrate der Mikroorganismen um 50% zu vermindern. Eine direkte Beziehung zwischen der Toxizität und der Hydrophobizität (log P-Wert) der organischen Verbindungen wurde für alle drei anaeroben Bakterien erfasst. Dabei zeigte sich, dass die drei anaeroben Stämme generell etwas empfindlicher auf die Substanzen reagierten als bisher getestete aerobe Mikroorganismen. Zudem wurden Reaktionen untersucht, die den Bakterien das Überleben in Anwesenheit organischer Lösungsmittel gestattet. Da Membranen die Berührungspunkte zwischen den Mikroorganismen und dem umgebenden Medium darstellen, sind die meisten Anpassungsreaktionen mit der Aufrechterhaltung der Membranfluidität und –stabilität verbunden. Die Änderung der Membranzusammensetzung insbesondere die der Phospholipidfettsäuren (PLFA) spielt dabei eine immense Rolle. T. aromatica und G. sulfurreducens, deren Fettsäuremuster von der Palmitinsäure (C16:0) und der Palmitoleinsäure (C16:1cis) dominiert wurden, reagierten während des Wachstums in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, mit einem Anstieg des Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren. Das Fettsäurespektrum von D. multivorans wurde durch Palmitinsäure (C16:0) und anteiso-verzweigte Fettsäuren charakterisiert. Insbesondere auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen reagierten die Zellen des Sulfatreduzierers mit einem Anstieg des Verhältnisses zwischen unverzweigten gesättigten Fettsäuren (C14:0, C16:0, C18:0) und den anteiso-verzweigten Fettsäuren (C15:0anteiso, C17:0anteiso, C17:1anteiso). Die beobachteten Modifikationen auf Ebene der zellulären Fettsäurezusammensetzung sind jedoch nur mittels de novo Synthese der Fettsäuren möglich – einem Prozess, der eng mit Zellwachstum verbunden ist. Die Wachstumsraten der untersuchten, anaeroben Bakterien sind jedoch deutlich geringer als die bisher getesteter aerober Bakterien, somit wird für die Ausprägung der Anpassungsreaktionen mehr Zeit benötigt, was die höhere Empfindlichkeit anaerober Bakterien gegenüber Lösungsmitteln erklären könnte.
Untersuchung der zytotoxischen Aktivität unterschiedlich virulenter NDV-Stämme auf Krebszelllinien
(2009)
In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen NDV-Stamm und onkolytischer Wirkung auf Tumorzellen untersucht. Die Analyse der onkolytischen Eigenschaft ausgewählter NDV zeigte, dass die Wirkung auf die Tumorzellen von der Art des NDV abhängt. Desweiteren erfolgte die Herstellung und Charakterisierung von rekombinanten Viren mit substituierten Oberflächenproteinen.