Das in der Transplantationsmedizin hĂ€ufig verwendete Immunsuppressivum Cyclosporin A (CsA) hemmt wichtige Transportproteine in der Niere, induziert oxidativen Stress und trĂ€gt zur Entwicklung einer Dysfunktion des GefĂ€Ăsystems bei. Neben der durch CsA vermittelten arteriellen Hypertonie sind die akute und die chronische NephrotoxizitĂ€t weitere Folgen des Medikamenteneinsatzes. Die akute CsA-Nephropathie ist reversibel und geht mit hĂ€modynamischen VerĂ€nderungen einher, die in einer Reduktion des renalen Blutflusses, einer Erhöhung des renalen GefĂ€Ăwiderstandes und einer Verminderung der glomerulĂ€ren Filtrationsrate bestehen. Die genauen Mechanismen, die zu diesen hĂ€modynamischen VerĂ€nderungen fĂŒhren, sind allerdings unklar. Cyclosporin A wird hauptsĂ€chlich hepatisch eliminiert, aber auch renal unter Beteiligung transepithelialer Transportprozesse ausgeschieden. Zu den Transportproteinen, die das Pharmakon ĂŒber die apikale Membran der proximalen Tubulusepithelzellen sezernieren, zĂ€hlt multidrug resistance-related protein 2 (Mrp2). Experimentelle Studien zeigen, dass eine generalisierte Mrp2-Defizienz mit der Akkumulation von Mrp2-Substraten in Geweben und extrazellulĂ€ren FlĂŒssigkeiten assoziiert ist. Die Bedeutung einer Fehlfunktion dieser Effluxpumpe fĂŒr die renale CsA-Substanzelimination und die CsA-NephrotoxizitĂ€t ist bisher jedoch nur wenig definiert. In unseren Untersuchungen stellte die hochdosierte Cyclosporin A-Behandlung in Kombination mit der nieren-spezifischen Ausschaltung des Transporters Mrp2 den experimentellen Ansatz fĂŒr die Bearbeitung der Fragestellung dar, ob eine renale Mrp2-Funktionsminderung die akute CsA-NephrotoxizitĂ€t verstĂ€rkt. Der Fokus wurde dabei auf die in-vivo-Untersuchung vaskulĂ€rer Mechanismen gelegt, die zum nichtimmunologisch bedingten Versagen von Nierentransplantaten beitragen können. Zu diesem Zweck wurden Nierenkreuztransplantationsexperimente durchgefĂŒhrt, bei denen durch die Wahl des Spendertieres bzw. Transplantates eine nierenspezifische Mrp2-Defizienz in den EmpfĂ€ngertieren erzeugt werden konnte. Bei den gewĂ€hlten RattenstĂ€mmen tritt aufgrund der hochgradigen genetischen Ăbereinstimmung keine TransplantatabstoĂung auf, wodurch potenziell toxische Cyclosporin-A-Effekte weitgehend unabhĂ€ngig von entzĂŒndlichen Prozessen untersucht werden können. Den Versuchstieren wurde peroral entweder CsA in einer Dosierung von 30 mg*kg-1*d-1 oder Placebo ĂŒber einen Zeitraum von sieben Tagen verabreicht. An Tag 28 post transplantionem wurden die akuten Experimente zur Untersuchung der renalen HĂ€modynamik durchgefĂŒhrt. Nach Instrumentierung der narkotisierten Tieren und Erhebung der Messwerte fĂŒr die Herzfrequenz, den arteriellen Blutdruck sowie die basalen renalen hĂ€modynamischen Parameter wurde Urin zur spĂ€teren Bestimmung der glomerulĂ€ren Filtrationsrate mittels Inulin-Clearance gewonnen. FĂŒr die Untersuchung der endothelialen Funktion und der Agonist-induzierten Vasokonstriktion der renalen NierentransplantatgefĂ€Ăe wurde ein um die A. renalis des Transplantates platzierter Ultraschalltransitzeit-Durchflussmesser genutzt, mit welchem der renale Blutfluss nach Applikation der vasoaktiven Substanzen Acetylcholin, Phenylephrin und Angiotensin II gemessen werden konnte. Die Pharmaka-Applikation erfolgte unter Nutzung einer Minikassettenpumpe lokal in die Nierenarterie, um systemische Effekte der Pharmaka auf den Blutdruck und Blutdruck regulierende Systeme weitgehend auszuschlieĂen. Die Auswertung der basalen hĂ€modynamischen Daten fĂŒr die Herzfrequenz, den arteriellen Blutdruck, den renalen Blutfluss und den renalen GefĂ€Ăwiderstand zeigte keine statistisch signifikanten Gruppenunterschiede in dem fĂŒr die vorliegenden Untersuchungen genutzten Transplantationsmodell. Auch hatten weder die hochdosierte CsA-Behandlung noch der renale Mrp2-Expressionsstatus einen signifikanten Einfluss auf die endotheliale Funktion, die Agonist-induzierten renalen GefĂ€Ăantworten, den reaktiven renalen GefĂ€Ăwiderstand und die renale Morphologie. Die hochdosierte CsA-Be-handlung verminderte jedoch statistisch signifikant die glomerulĂ€re Filtrationsrate und das Gewicht der EmpfĂ€ngertiere. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dass die durch die hochdosierte CsA-Behandlung in dem verwendeten Transplantationsmodell induzierten hĂ€modynamischen Effekte unabhĂ€ngig von der nierenspezifischen Mrp2-Expression waren, was gegen einen entscheidenden Einfluss dieses Transportproteins auf die akute CsA-induzierte Nephropathie spricht.
Das Zusammenspiel von Transportproteinen in den Nieren, der Leber und im Intestinaltrakt ist notwendig fĂŒr die effiziente Elimination von potentiell giftigen Metaboliten und die Erhaltung von essentiellen Metaboliten fĂŒr den Organismus. Dabei spielen die Effluxmechanismen der Multidrug Resistance-related Proteine (Mrp) eine wichtige Rolle in der Absorption, Verteilung und Elimination von endogenen und xenobiotischen Substanzen. In den Epithelzellen des Nierentubulus sind Mrp2 (Abcc2) und Mrp4 (Abcc4) apikal exprimiert wĂ€hrend sich Mrp3 (Abcc3) in der basolateralen Membran befindet. Die Rolle der Mrp-Transporter in der Regulation des zellulĂ€ren Redoxstatus ist noch nicht aufgeklĂ€rt. Die systemische Mrp2-Defizienz induziert die mRNA-Expression antioxidativer Proteine in der Niere. Auch die AktivitĂ€t des sympathischen Nervensystems ist wichtig fĂŒr die Nierenfunktion. Der Einfluss der renalen Innervation auf den Transport organischer Ionen ist bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Hypothese getestet werden, dass das sympathische Nervensystem einen Einfluss auf die Expression und Funktion der Mrp-Transporter hat. ZunĂ€chst sollte nach renaler Denervation von Lewisratten und kongenen Mrp2-defizienten Ratten die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 bestimmt werden. WeiterfĂŒhrend sollte als Modell fĂŒr eine NierenschĂ€digung die 5/6-Nephrektomie nach drei bzw. sieben Wochen beschrieben und der Einfluss der renalen Denervation auf die Expression von Mrp2, Mrp3 und Mrp4 bestimmt werden. Ein anderer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Rolle von Mrp2 bei der zellulĂ€ren Redoxregulation unter nephrotoxischen Bedingungen. Es wurde die Hypothese getestet, dass die renale Mrp2-Defizienz eine akute CsA-induzierte NephrotoxizitĂ€t verstĂ€rkt. Die kongene Transplantation von Mrp2-defizienten Nieren auf WildtypempfĂ€nger (Lewisratten) erzeugte eine isolierte renale Mrp2-Defizienz. Als Kontrollen dienten syngene Transplantationen unter Lewisratten. Die Tiere wurden fĂŒr eine Woche mit CsA in einer immunsuppressiv wirkenden Dosis bzw. einer zusĂ€tzlich nephrotoxisch wirkenden Dosis oder mit einer PlacebodiĂ€t behandelt. Zur ĂberprĂŒfung der Hypothesen wurde die Transporterfunktion durch Clearance-Messungen und die Transporterexpression durch Real-time PCR, Western blot und Immunhistologie untersucht. DarĂŒber hinaus charakterisierte ein PCR-Array das nephrotoxisch-verĂ€nderte Expressionsmuster. AuĂerdem wurden EnzymaktivitĂ€ten durch Lucigenin-verstĂ€rkte Chemilumineszenz und fotometrische EnzymaktivitĂ€tsassays sowie die Glutathionkonzentration fotometrisch ermittelt. Die renale Denervation ohne Reduktion der Nierenmasse hatte keinen Einfluss auf die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 in der Niere. Die 5/6-Nephrektomie fĂŒhrte zu erhöhten Mrp2- und Mrp4-mRNA-Gehalten und zu einem reduzierten Mrp3-Proteingehalt im renalen Kortexgewebe. Durch zusĂ€tzliche renale Denervation bei 5/6-Nephrektomie war der mRNA-Gehalt von Mrp3 signifikant erhöht. Bei 5/6-Nephrektomie war nach drei Wochen ein erhöhter Glutathionquotient als Indikator fĂŒr oxidativen Stress im Nierengewebe messbar, der durch die renale Denervation signifikant reduziert wurde. Sieben Wochen nach der Denervation bei 5/6-Nephrektomie war die Expression und Lokalisation der Mrp-Transporter nicht verĂ€ndert. Des Weiteren war zu diesem Zeitpunkt der renale Gesamtglutathiongehalt unabhĂ€ngig von der renalen Denervation reduziert. Nach sieben Wochen vermehrt auftretende Hydronephrosen im Nierenkortex lassen sich als ein histologisches Anzeichen fĂŒr einen Nierenschaden deuten. Die durch CsA-Behandlung höheren mRNA-Gehalte der UDP-Glucuronosyltransferase 1a6 und der Glutathionperoxidase 2 waren im Falle einer nierenspezifischen Mrp2-Defizienz zusĂ€tzlich erhöht. Dieser Effekt und auch der durch Mrp2-Defizienz erhöhte mRNA-Gehalt des Cytochroms 1a1 weisen auf eine erhöhte metabolische und oxidative Belastung im Transplantatgewebe durch das Fehlen von Mrp2 bei CsA-induzierter NephrotoxizitĂ€t hin. Durch die Behandlung mit CsA trat dosisabhĂ€ngig ein erhöhter Glutathionquotient im Transplantatgewebe auf. Die nierenspezifische Mrp2-Defizienz fĂŒhrte nicht zu einem signifikant erhöhten Glutathionquotienten. Eine mögliche funktionelle Redundanz anderer renaler Transporter wie Mdr1 könnte den Effekt der Mrp2-Defizienz limitieren. In dieser Arbeit konnte eine mit oxidativem Stress assoziierte AbhĂ€ngigkeit des mRNA-Gehalts des basolateralen Transporters Mrp3 vom sympathischen Nervensystem unter Reduktion der Nierenmasse nachgewiesen werden. AuĂerdem verstĂ€rkt die renale Mrp2-Defizienz nicht die akute CsA-induzierte NephrotoxizitĂ€t, was möglicherweise auf eine kompensatorische Induktion der Glutathionperoxidase 2, der UDP-Glucuronosyl-transferase 1a6 oder des renalen Transporters Mdr1 zurĂŒckgeht.
Die Transportproteine Multidrug Resistance-associated Protein (MRP) 1, MRP2, MRP3, MRP4 und P-Glykoprotein (Pgp) nehmen SchlĂŒsselrollen bei der zellulĂ€ren Detoxifikation und bei der Elimination harnpflichtiger sowie hepato-biliĂ€r ausgeschiedener Substanzen ein und zeichnen sich durch gemeinsame SubstratspezifitĂ€ten aus. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Kreuztransplantationsmodell der Nieren zwischen Lewis-1W-Ratten (Wildtyp) und kongenen MRP2-defizienten (MRP2[-/-]) Ratten etabliert, bei dem Wildtyp- und MRP2[-/-]-Ratten jeweils als Spender und als EmpfĂ€nger dienten. Anhand dieses Modells konnten die Hypothesen untersucht werden, dass die renalen und hepatischen Transkriptgehalte von MRP1, MRP2, MRP3, MRP4 und Pgp bei nativen MRP2[-/-]-Ratten durch die MRP2-Defizienz (erste Hypothese), durch nierenspezifische MRP2-Defizienz (zweite Hypothese) und durch die Nierentransplantation an sich bei MRP2-defizienten Ratten stĂ€rker als bei Wildtyp-Ratten (dritte Hypothese) beeinflusst werden. Bei nativen MRP2[-/-]-Ratten wurden erhöhte hepatische MRP3- und Pgp-Transkriptgehalte sowie ein erniedrigter renaler Pgp-Transkriptgehalt gefunden. Nierenspezifische MRP2-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Transkriptgehalte. Andererseits waren bei MRP2[-/-]-EmpfĂ€ngern die MRP1-Transkriptgehalte in der Niere höher und in der Leber niedriger als die bei Wildtyp-EmpfĂ€ngern unabhĂ€ngig vom genetischen Hintergrund der transplantierten Nieren. Der Pgp-Transkriptgehalt transplantierter Wildtyp-Nieren war bei Wildtyp-EmpfĂ€ngern höher als bei MRP2[-/-]-EmpfĂ€ngern. Nach Transplantation von MRP2-/--Nieren war der hepatische MRP3-Transkriptgehalt bei MRP2[-/-]-EmpfĂ€ngern höher als bei Wildtyp-EmpfĂ€ngern. BezĂŒglich des hepatischen Pgp-Transkriptgehalts war es umgekehrt. Nach syngener Wildtyp-Nierentransplantation war im Vergleich zu nativen Wildtyp-Ratten lediglich der hepatische Pgp-Transkriptgehalt erhöht. Nach syngener MRP2[-/-]-Nierentransplantation waren die renalen MRP1- und MRP4-Transkriptgehalte höher und die hepatischen niedriger als die bei nativen MRP2[-/-]-Ratten. Der Pgp-Transkriptgehalt syngen transplantierter MRP2[-/-]-Nieren war höher als bei autochthonen Nieren nativer MRP2[-/-]-Ratten. Zusammenfassend konnte die MRP2-Defizienz der nativen MRP2[-/-]-Ratten auf transkriptionaler Ebene bestĂ€tigt werden. Durch die MRP2-Defizienz wurde die transkriptionale Regulation von MRP3 und Pgp bei nativen Ratten beeinflusst (erste Hypothese). Nach Nierenkreuztransplantationen wurden zwar keine VerĂ€nderungen auf transkriptionaler Ebene gefunden, publizierte Daten zum renalen MRP4-Proteingehalt geben jedoch Hinweise auf post-transkriptionale Regulationsmechanismen (Grisk et al., 2009). AuĂerdem scheint der genetische Hintergrund der EmpfĂ€nger bei Transplantationen von Wildtyp- und MRP2[-/-]-Nieren fĂŒr die untersuchten Transkriptgehalte von MRP1, MRP3 und Pgp von Bedeutung zu sein (zweite Hypothese). Die untersuchten Transkriptgehalte scheinen bei MRP2[-/-]-Ratten durch die syngene Nierentransplantation in gröĂerem Umfang beeinflusst zu werden als bei Wildtyp-Ratten (dritte Hypothese).