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Das In vitro-Testsystem der Gefäß-simulierenden Durchflusszelle (vessel-simulating flow-through cell, vFTC) ermöglicht die Untersuchung der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Arzneistoff-freisetzenden Stents (drug-eluting stents, DES) zwischen dem Perfusionsmedium, dem Hydrogelkompartiment und dem in der Stentbeschichtung verbliebenden Wirkstoffanteil. Die vorliegende Forschungsarbeit hatte zum Ziel, die physikochemischen Eigenschaften des Gefäß-simulierenden Gelkörpers (ein 3 %iges Alginat-Gel) unter Erhaltung definierter Materialeigenschaften wie Elastizität, Festigkeit und Formstabilität der Hydrogelkompartimente unter Perfusionsbedingungen zu verändern und den Einfluss der Einbettungsbedingungen auf die Wirkstofffreisetzung und -verteilung von mit Modellwirkstoffen-beschichteten Stents in der vFTC zu untersuchen. Die Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des Alginat-basierten Hydrogelkompartimentes konnte durch Integration des hydrophoben Adsorbens LiChroprep® RP-18 sowie durch den Austausch der wässrigen Phase durch die o/w-Emulsion Lipofundin erfolgreich abgeschlossen werden. Dabei zeigte die 5 %ige LiChroprep-Formulierung eine schnelle Gelierung, ergab formstabile Gelkörper und beobachte Auswaschungseffekte des inkorporierten Adsorbens (bei einem Masseanteil im Gel von ≤ 10 %) unter Perfusion in der vFTC blieben aus. Eine maximale Änderungen der Verteilungseigenschaften ergab sich für die Kombination der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren mit dem LiChroprep-Gel (Verteilungskoeffizient von ~ 5). Im Rahmen der Freisetzungs- und Verteilungsuntersuchungen in der vFTC konnte eine Anreicherung im LiChroprep-Gel (gegenüber dem Alginat-Gel) beziehungsweise eine Änderung der Wirkstoffverteilung zwischen den Kompartimenten Freisetzungsmedium, Hydrogel und Stentbeschichtung jedoch nicht bestätigt werden. Die numerische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente zeigte jedoch, dass im Fall von Triamteren der Einfluss einer Gelhydrophobisierung auf die Freisetzung und Verteilung mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit des Modellwirkstoffes aus der Stentbeschichtung zunimmt. Für die In vitro-Testung von DES in der vFTC über einen verlängerten Versuchszeitraum von 28 Tagen konnten geeignete, Langzeit-stabile Gelformulierungen aus Agar, Agarose, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gefunden werden. Diese unterschieden sich hinsichtlich ihrer Herstellungstechnik, ihren Quellungseigenschaften, ihrer makroporösen Gelstruktur, ihren Verteilungs- und Diffusionseigenschaften sowie den Materialeigenschaften, Gelfestigkeit und Elastizität. Der Vergleich der mit Hilfe des Texture Analyser ermittelten Kraft-Deformations-Profile der Gelkörper vor und nach 28-tägiger Perfusion in der vFTC zeigte, dass die untersuchten Materialeigenschaften, Festigkeit und Elastizität, im Fall der Agarose-, Polyacrylamid- und Polyvinylalkohol-Gelkörper trotz kontinuierlicher Scherbeanspruchung durch Perfusion des Gellumens nahezu unverändert waren. Aufgrund der schnellen und simplen Herstellungstechnik, der milden Gelierungsbedingungen, der elastischen Eigenschaften und der nahezu unveränderten mechanischen Stabilität unter Flussbedingungen in der vFTC erscheint das Agarose-Gel der vielversprechendste Kandidat der für die vFTC neu entwickelten Gelformulierung zu sein. Die Untersuchung der Diffusions- und Verteilungseigenschaften in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten ergab eine Gleichverteilung der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren zwischen dem Agar-, dem Agarose- beziehungsweise dem Polyacrylamid-Gel und dem flüssigem Kompartiment, während für die Polyvinylalkohol-Formulierung eine minimale Anreicherung (Verteilungskoeffizient von ~ 2) im Hydrogel gezeigt werden konnte. Die Wirkstoffdiffusion im Gel variierte von 2 x 10-4 mm2/s für Polyvinylalkohol, 5 x 10-4 mm2/s für Alginat und Polyacrylamid bis 8 x 10-4 mm2/s für Agarose. Die theoretische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente-Methode ergab in Abhängigkeit unterschiedlicher Entleerungsgeschwindigkeiten aus dem Wirkstoffreservoir und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verteilungs- und Diffusionseigenschaften von Triamteren in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten die schnellste Wirkstofffreisetzung in das Gel und die höchste Wirkstoffanreicherung im Gel im Fall des Polyvinylalkohol-Gelkörpers. In Abhängigkeit unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Modellgel (bei konstantem Verteilungskoeffizienten- und gleichbleibenden Entleerungsgeschwindigkeiten aus der Polymerbeschichtung) konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Wirkstofffreigabe ins Freisetzungsmedium mit steigender Wirkstoffdiffusion im Hydrogel reduziert ist. Gleichzeitig ist die Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir gesenkt, während der absolut ins Hydrogel eluierte Wirkstoffanteil steigt sowie terminal anschließend langsamer ins Medium rückverteilt wird. So scheinen die physikochemischen Eigenschaften des Hydrogelkompartimentes im Rahmen der experimentell durchgeführten Gelmodifikationen/Gelbildnersubstitution eine untergeordnete Rolle auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten der Modellwirkstoffe aus DES in der vFTC zu spielen. Die numerischen Modellierungen der experimentellen Wirkstofffreisetzung zeigen jedoch, dass eine Änderung der Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten im Hydrogel und in der Stentbeschichtung zu Konzentrationsunterschieden in den Verteilungskompartimenten führen kann. So nimmt mit zunehmender Hydrophobisierung des Hydrogelkompartimentes, mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir und einer verlangsamten Diffusion im Hydrogel der Einfluss des Hydrogelkompartimentes auf die Wirkstofffreisetzung und verteilung in der vFTC zunimmt.
There is a growing interest in the application of non-thermal atmospheric pressure plasma for the treatment of wounds. Due to the generation of various ROS and RNS, UV radiation and electric fields plasma is a very promising tool which can stimulate skin and immune cells. However, not much is known about the mammalian cell responses after plasma treatments on a molecular level. The present work focusses on the impact of plasma on cell signaling in the human keratinocyte cell line HaCaT by using the methods DNA microarray, qPCR, ELISA and flow cytometry. Here, cell signaling mediators such as cytokines and growth factors which could promote wound healing by enhancing angiogenesis, reepithelization, migration and proliferation were of major interest. Additionally, the crosstalk between keratinocytes and monocytes was studied using a co-culture. For the first time extensive investigations on the impact of plasma on cell signaling in human keratinocytes were conducted. The most prominent cytokines and growth factors which were regulated by plasma at gene and protein level were VEGF-A, GM-CSF, HB-EGF, IL-8, and IL-6. The latter was not activated due to the JAK/STAT-pathway but probably by a combined activation of MAPK- and PI3K/Akt-pathways. By the use of conditioned medium it was found out that ROS and RNS generated directly after plasma treatment induced larger effects on cell signaling in keratinocytes than the subsequently secreted growth factors and cytokines. Furthermore, monocytes and keratinocytes hardly altered their secretion profiles in co-culture. From these results it is deduced that the plasma generated reactive species are the main actors during cell signaling. In order to differentiate the impact of ROS and RNS on the cellular response the ambience of the plasma effluent was controlled, varying the ambient gas composition from pure nitrogen to pure oxygen. Thereby a first step towards the attribution of the cellular response to specific plasma generated reactive species was achieved. While IL-6 expression correlated with ROS generated by the plasma source, the cell signaling mediators VEGF-A, GM-CSF and HB-EGF were significantly changed by RONS. Above all hydrogen peroxide was found to play a dominant role for observed cell responses. In summary, plasma activates wound healing related cell signaling mediators as cytokines and growth factors in keratinocytes. It was also shown that the generated reactive species mainly induced cell signaling. For the first time cell responses can be correlated to ROS and RONS in plasma treated cells. These results underline the potential of non-thermal atmospheric pressure plasma sources for their applications in wound treatment.
The investigated bacterial strain 64G3 was isolated from an offshore oil reservoir in Vung Tau, Vietnam. By means of 16S rDNA sequence alignment and DNA-DNA hybridization with Petrotoga mexicana DSM 14811, the isolate was identified as Petrotoga mexicana species. Morphologically, the 64G3 cells were rod-shaped and cell sizes varied widely from 1.0 µm up to 60 µm in length and from 0.6 to 1.2 µm in width. The cells appeared single, pairwise or in chains within a sheath-like structure (a typical characteristic of the order Thermotogales) that ballooned over the cell ends. Cells were immobile and no flagella were observed. Strain 64G3 grew anaerobically at temperatures ranging from 30 to 65°C and within the pH range of 5.0 to 8.5 with optimum growth at 55°C and the pH 7.0. Elemental sulfur and thiosulfate served as alternative electron acceptors whereas sulfate did not. Cellular extract of strain 64G3 grown in a basal medium containing soluble starch displayed hydrolytic activity towards soluble starch. The amylase system includes at least two individual enzymes. Amylase activity of the cell extract was detected in a wide temperature range (30-80°C), with optimal enzyme activity at 75°C. By using degenerate primer for PCR amplification of GH13 enzyme coding regions in combination with other molecular methods, a full amylase coding gene containing four conserved regions of α-amylase was obtained. The deduced sequence showed low identities (up to 40%) to other known amylases. This 1992 bp coding gene was heterologously expressed in E. coli and its product (amylase) was characterized. Under common expression conditions, the 77 kDa amylase (rAmyA) was predominantly produced as inclusion bodies (insoluble protein). The minor amount of soluble active amylase was used for purification and characterization of the enzyme. rAmyA was active on starch at temperatures between 30-55°C, with an optimum at 45oC. It is not thermostable because it was completely inactive after incubation at 65°C for 15 min. The enzyme was active over a pH range from 4.5-8.0, with an optimum at pH 6.5. Beside starch, rAmyA also hydrolysed glycogen, amylose, amylopectin and other oligosaccharides. Pullulan and cyclodextrins were not the substrates for this amylase. The enzyme hydrolyzed starch in an endo-acting manner, releasing maltose and maltotriose as major products and a lesser amount of glucose. On the basis of the primary structure, the substrate specificities and the hydrolysis pattern, rAmyA was classified as an endo-acting α-amylase (EC. 3.2.1.1). The cpn10/60 operon from psychrophilic O. antarctica was cloned and expressed in B. subtilis using a multi-copy plasmid. The amounts of soluble 60 kDa Cpn60 and 10 kDa Cpn10 produced at temperature ranging from 10 - 30°C were high and stable during cell growth. To investigate the impact of psychrophilic chaperonin on cold adaptation, cells with (cpn+) and without (cpn-) cpn10/60 operon were grown at 10 and 15°C. Growth comparison between two strains revealed that psychrophilic chaperonin did not support cold adaptation of B. subtilis at 10 and 15°C as it did in E. coli. A single copy of O. antarctica cpn10/60 operon was integrated into the amyE locus of the B. subtilis chromosome. The yeast α-glucosidase, a theoretic protein substrate for this chaperonin, was heterologously produced in B. subtilis at temperatures ranging from 15-30°C. Within this temperature range, the major amount of this protein appeared as inclusion bodies. Co-expression of O. antarctica cpn10/60 operon at 15°C, however, did not result in a higher activity of glucosidase. Moreover, SDS-PAGE analysis of cellular insoluble fractions revealed that the amount of insoluble enzyme produced in cpn+ cells did not decrease in comparison with that produced in cpn- cells, indicating that the recombinant chaperonin had no impact on recovery of active α-glucosidase from the inclusion bodies.
In many industrial sectors biotechnological production processes have replaced pure chemical methods and allowed new, ecologically friendly and enzyme-based processes. Microorganisms, such as modified Bacillus strains are used in particular for the industrial enzyme synthesis. The two organisms Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus are of great industrial importance. B. licheniformis is able to secrete proteins in large amounts, while B. pumilus shows high resistance to oxidative stress. During production processes different conditions can occur that affect the physiology of the production hosts and may result in a quantitative, but also a qualitative impairment of the products. This influence is based on e.g. chemical processes, the setting of temperature, pH, or oxygen availability and can lead to various stress situations for the bacteria. Cells respond to changes in their environment by sensing stressors and initiate a response to the stress, which is usually implemented by an induction or derepression of various regulons. In order to conduct an optimal production process, the metabolism and stress responses of the utilized bacteria should be known exactly. The aim of this study was to analyze of the stress response of B. licheniformis to heat and salt stress, and the stress response of B. licheniformis and B. pumilus to oxidative stress. These analyses were performed at the level of transcriptomics using cDNA microarrays, which is the most direct and global method for the analysis of changes in the physiology of a cell. The identification of stress specific markers genes and their differentiation from the SigB regulated general stress response has been another purpose of this work. Knowledge of these marker genes enables a prompt analysis of the fermentation conditions and thus a possible optimization of the process. The transcriptome analyses of this work show that B. licheniformis responds to heat stress by the induction of heat shock genes belonging to different regulons. These include the htpG gene, the HrcA regulon or the CtsR regulon, encoding chaperones and proteases, which mainly contribute to the protein quality control. The heat stress response of B. licheniformis revealed no fundamental differences to the heat stress response of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. The general stress response (SigB regulon), which is activated by heat stress, could be analyzed in more detail by the study of a ΔsigB mutant of B. licheniformis. Salt stress also provokes a strong induction of the general stress response in B. licheniformis. Genes for the transport and synthesis of compatible solutes were strongly induced, as well as several genes for transport systems with more or less known functions. The synthesis of the osmoprotective metabolites proline and glycine betaine could be verified in more detail by a metabolomics approach. The response to oxidative stress showed differences between both B. licheniformis and B. pumilus, and also to the oxidative stress response of B. subtilis. In B. licheniformis, the genes of the glyoxylate cycle are induced during oxidative stress. An activation of the glyoxylate bypass under oxidative conditions could be confirmed by a metabolome analysis of B. licheniformis. In addition, the PerR regulon of B. licheniformis is extended to include another two genes compared to B. subtilis. In contrast, several genes of the PerR regulon lack in the genome of B. pumilus, such as katA (vegetative catalase) or ahpCF (alkyl hydroperoxide reductase). However, other genes were induced in B. pumilus that were upregulated under oxidative stress conditions neither in B. subtilis nor in B. licheniformis. In addition, known regulons, regulated by e.g. Spx, CtsR or SOS were induced in both organisms. In summary, this dissertation transcriptionally analyzes the stress responses of B. licheniformis to heat, salt and oxidative stress, and in addition the oxidative stress response of B. pumilus. Several stress-specific regulons were identified in both, B. pumilus and B. licheniformis, which also correspond to the stress response of B. subtilis. However, it was possible to additionally assign genes to the stress specific responses of both organisms and to find differences, such as the absence of parts of the PerR regulon of B. pumilus, or the activation of the glyoxylate pathway in B. licheniformis during oxidative stress.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.
Die zielgerichtete Steuerung einer Arzneiform zu einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltraktes ist ein wesentlicher Punkt, wenn es um die Erhöhung der Bioverfügbarkeit und um die Verringerung von möglichen Nebenwirkungen geht. Im Zuge dessen macht man sich die physiologischen Unterschiede entlang des Verdauungstraktes zu Nutze, die unter anderem den pH-Wert, die Transitzeiten oder die Enzymausstattung betreffen. Verschiedene Faktoren wie Nahrungsaufnahme oder pathophysiologische Veränderungen können allerdings dazu führen, dass pH-, Zeit- oder Enzym-getriggerte Darreichungsformen versagen und ihren Wirkstoff entweder zu früh, zu spät oder gar nicht freisetzen. Durch die Entwicklung neuer Arzneiformen, die ihren Wirkstoff aufgrund eines definierten Drucks freigeben, könnten diese Probleme unter Umständen vermieden werden. Weiterhin kann die Bioverfügbarkeit besonders von schwer löslichen Wirkstoffen negativ beeinflusst werden durch den Zeitpunkt und die Dauer der Desintegration einer Arzneiform und das Fehlen der dafür erforderlichen Wassermengen im Gastrointestinaltrakt. Besonders bei Wirkstoffen mit einem engen Absorptionsfenster im oberen Dünndarm ist ein schneller Lösungsprozess des Wirkstoffs einer Arzneiform wichtig, um eine optimale Absorption zu gewährleisten. Aus diesem Grund bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Entwicklung neuer drucksensitiver Darreichungsformen, die ihren Inhalt bei einem definierten Druck von 300 mbar, wie er am Pylorus vorherrscht, schlagartig und komplett freisetzen. Dabei sollten die Arzneiformen vor ihrer Entleerung weder durch eine verlängerte Magenverweilzeit noch durch den sauren pH-Wert des Magens angegriffen werden, um eine verfrühte Wirkstofffreisetzung zu vermeiden. Die entwickelten Darreichungsformen sollten den Wirkstoff entweder in bereits gelöster Form oder dispergiert in einer flüssigen Grundlage enthalten, die sich nach Zerplatzen über die Dünndarm-Schleimhaut verteilen und durch eine verlängerte Kontaktzeit die Absorptionsrate erhöhen kann. Für die entwickelten Arzneiformen wurden Methoden zur Gehaltsbestimmung entwickelt, um die Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit einschätzen zu können. Weiterhin wurde ein dreistündiger Freisetzungsversuch in der Paddle-Apparatur zur Simulation einer verlängerten Magenverweilzeit durchgeführt. Bruchfestigkeitsuntersuchungen am Texture Analyser sollten die Beeinflussung der aufzuwendenden Kraft in Bezug zu individuellen Parametern, wie Polymerbeladung oder Konzentration beurteilen. Mit Hilfe der Stresstest-Apparatur wurde die direkte Einwirkung von Druck im Bereich zwischen 100 und 500 mbar untersucht, und unter Verwendung eines Magenentleerungsprogramms das Verhalten der Darreichungsformen im nüchternen Magen und bei der Pyloruspassage simuliert. Es wurden sechs unterschiedliche Darreichungsformen entwickelt, deren Eignung als drucksensitive Arzneiform anhand der genannten Prüfungen untersucht wurde. Die Entwicklung der Agar-Kugeln beruhte auf der Eigenschaft des Gelbildners spröde Matrizes zu bilden, deren Bruchverhalten durch Veränderung der Konzentration oder durch eine definierte Trocknungszeit beeinflusst werden konnte. Das Prinzip der Hartfett- und PEG-Kugeln beruhte darauf, dass Hilfsstoffe, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen, mit einem wasserunlöslichen Polymer überzogen wurden, der aus der Arzneiform bei Eintritt in den Körper einen flüssigkeitsgefüllten Ballon bildete. Die mit Ethylcellulose überzogenen Paraffin-Kapseln sollten durch das Einfügen einer Sollbruchstelle in Form von acht radial angeordneten Löchern zerplatzen und ihren Inhalt freigeben. Das wässrige Medium sollte durch die Löcher eindringen, die innere Gelatinekapsel anlösen und somit zu einer dünnen Polymer-Schicht führen, die auf Druck nachgeben und den Inhalt komplett freisetzen sollte. Die entwickelten Tristearin-Kapseln bestanden aus einer festen, spröden, wasserabweisenden Hülle aus einem hochschmelzenden Hartfett, mit welchem in flüssiger Form handelsübliche Gelatine-Kapseln innenbeschichtet werden konnten und wurden mit einem wirkstoffhaltigen Hydrogel gefüllt. Bei den Kaugummi-Tabletten sollte ein dünner Mantel aus lipophiler Kaugummi-Grundmasse die Arzneiform vor dem Einfluss wässriger Medien schützen. Ein enthaltener Kern aus Hartfett, welcher bei Körpertemperatur schmilzt, sollte zusätzlich dafür sorgen, dass das Gerüst der Tablette instabil wird und sie durch definierte Druckeinwirkung zum Platzen gebracht wird. Eingefügte Sollbruchstellen sollten das Platzen steuern und ein anschließendes Dippen in eine heptanhaltige Kaugummilösung sollte die Arzneiformen soweit stabilisieren, dass sie nicht bereits bei zu niedrigen Drücken zerbrachen. Unter den entwickelten Darreichungsformen erwiesen sich vor allem die Tristearin-Kapseln und die Hartfett-Kugeln als sehr geeignet für eine drucksensitive Freisetzung, während für die anderen Arzneiformen weitere Modifikationen notwendig wären.
Rich knowledge about global nutrient cycles and functional interactions can be gained from the perspective of complex microbial proteomes. In this thesis, the application of environmental proteomics allowed for a direct in situ analysis of habitat-specific proteomes expressed by respective microbial communities from two different marine ecosystems. In the first part of this thesis, unculturable symbiont populations from tubeworms that colonize hydrothermal vents of the Pacific deep sea became accessible by use of community proteomics. This branch of environmental proteomics is generally employed to ascertain simple microbial assemblages derived from in situ samples. The proteome study was aimed at analyzing adaptations of seemingly monospecific symbionts to different hosts, the tubeworms Tevnia jerichonana und Riftia pachyptila. A comparison of the newly sequenced genomes of symbiont populations from both hosts confirmed that both symbioses involve the same bacterial species. Also the proteome analysis by 2D-PAGE showed a high physiological homogeneity for symbionts from both worm species, although the hosts are exposed to different geochemical conditions. Thus, the hosts provide their symbionts with a relatively stable internal environment by attenuation of external influences. Only minor variations in the symbionts proteomes reflected the differential environmental conditions outside the worms. Hence, the symbionts were able to fine-tune major metabolic pathways and oxidative stress in response to only minor chemical changes within their hosts. Moreover, new components of important physiological processes of the bacterial symbionts, like the sulfide oxidation and carbon fixation, were identified by in-depth proteomics of the Riftia symbiosis model system. The in situ protein samples showed as well that, in contrast to an earlier hypothesis, nitrate is used as an alternative electron acceptor. In the second part of this thesis, another branch of environmental proteomics called metaproteomics was applied to investigate the response of a bacterioplankton community to a spring phytoplankton bloom in the North Sea. Recurrent plankton blooms are a common phenomen of coastal areas, which however has only been investigated with limited resolution in biodiversity. Based on large-scale proteomic data sets it was found that specialized populations of Bacteroidetes, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria exhibited differential protein expression patterns. These involved oligomer transporters, glycoside hydrolases and phosphate acquisition proteins. A successive utilization of algal organic matter by microbes indicated a series of ecological niches occupied by the heterotrophic picoplankton. Key proteins, identified by metaproteomics, were further investigated by studying a model bacterium to define their specificities regarding the utilization of algal glycans. By isotope labeling of proteins, quantitative proteomics of the North Sea isolate Gramella forsetii KT0803, a Bacteroidetes representative could be conducted. The adaptation to the algal polysaccharides alginate and laminarin in comparison with glucose was analyzed. G. forsetii proved to be a specialist for the chosen algal polymers, in particular for glucans like laminarin. Primarily comprehensive clusters, the so-called polysaccharide utilization loci (PULs) were activated. The results of this model study complemented the basic concepts obtained by the metaproteomic approach about carbon cycling in coastal systems. The accessibility of numerous unculturable marine microbes by environmental proteomics allows to improve our understanding of interactions that drive symbioses or complex communities. Adaptations to environmental parameters, such as the abundance of substrates, can be analyzed and associated with respective populations. Thus statements can be made for functional groups of microorganisms, their ability for the creation of niches and their flexibility to respond to varying environmental impacts. The increasing number of marine model bacteria enables targeted analysis of specificities and adaptations and hence to support the environmental proteomics approach.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.
Der Naturstoff Splitomicin war als selektiver Inhibitor (der Aktivität) der NAD+- abhängigen Histon-Desacetylase des Sir2-Proteins Ausgangspunkt der Untersuchungen, ist aber an humanen Enzymen inaktiv und aufgrund der im menschlichen Körper zu erwartenden Hydrolyse der Verbindung weder als Arzneistoff noch als Grundgerüst für Analoga geeignet. Da die Stabilität der Verbindung Voraussetzung dafür ist, dass die Verbindungen ihre Wirkung entfalten können, und eine Verschiebung der Selektivität hin zu humanen Enzymen beabsichtigt war, wurde im Rahmen dieser Arbeit Splitomicin zwar als Leitstruktur übernommen aber das heterocyclische Ringsystem auf der Grundlage von Struktur-Aktivitätsbeziehungen modifiziert. Der in Splitomicin enthaltene Sechsring des Pyranons wurde durch einen Fünfring ersetzt. Neben anellierten Imidazolonen wurden Imidazolthione und Chinolinimidazolthione dargestellt, um die Stabilität der Verbindungen gegenüber Hydrolyseeinflüssen zu erhöhen.