Open Access

Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorgängen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-tät zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen präsentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das größte Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-ständig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich möglicherweise auch auf die OATPs über-tragen lassen. Für diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformationsänderung führt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein befördert. Eine Möglichkeit derartige Konformationsänderungen, die mit einer Verschiebung der Abstände innerhalb des Moleküls einhergehen, zu untersuchen, stellt der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt. Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er für die Untersuchung mittels FRET zugänglich werden würde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, während EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellulären Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellulären Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung führte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membranäre Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zunächst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abhängigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellulä-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-stände innerhalb des Moleküls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise Übereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abstände mit denen computergestützter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzuklären. Außerdem stützen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen ließen. Es konnte für fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abhängigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgeprägte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid führte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten Änderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abständen der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem ähn-lichen Prinzip folgt, wie es für den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 führen zu einer Abstandsänderung innerhalb des Moleküls, die sich am ehesten über eine Konformationsänderung erklären ließe. Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsfähigen FRET-Fusionsproteins möglich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Außerdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren für Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten geklärt werden.

Makrophagen stellen einen wesentlichen Bestandteil des leukozytären Infiltrates des Kolonkarzinoms und anderer maligner Tumoren dar. Für eine Reihe anderer Tumorentitäten konnte bereits nachgewiesen werden, dass tumor-assoziierte Makrophagen das Wachstum, die Neoangiogenese und die Metastasierung fördern. Bisherige Studien zur Rolle der Makrophagen im Kolonkarzinom zeigten hingegen widersprüchliche Ergebnisse. Um den Einfluss von Makrophagen auf das Wachstums- und Metastasierungsverhalten im Kolonkarzinom genauer zu untersuchen, wurde zum einen ein orthotopes, syngenes Kolonkarzinommodell, zum anderen ein Lebermetastasenmodell unter Verwendung der murinen Kolonkarzinomzelllinie CT-26 in der immunkompetenten Balb/c-Maus verwendet und die Makrophagen bzw. Kupffer-Zellen mittels intraperitonealer Injektion von Clodronat-Liposomen selektiv depletiert. Die Tumorvolumina bzw. die Metastasenanzahl wurden mittels 7-Tesla Kleintier-MRT bestimmt und das Tumorgewicht per Feinwaage ermittelt. Die Makrophagen- und Gefäßdichte in den orthotopen Tumoren sowie die Kupffer-Zelldichte im Lebermetastasenmodell wurden mit Hilfe der Immunhistochemie ausgewertet. Die Makrophagendepletion führte zu einer signifikanten Verringerung des Tumorwachstums im orthotopen Kolonkarzinommodell und verminderte hier gleichzeitig die Anzahl an Tieren, die eine Peritonealkarzinose bzw. Lebermetastasen entwickelten. Darüber hinaus führte die Depletion zu einer signifikanten Hemmung der Neoangiogenese im Kolonkarzinom. Im Lebermetastasenmodell führte die Kupffer-Zelldepletion zu einer signifikant geringeren Anzahl an Lebermetastasen, wobei die Kupffer-Zelldichte direkt mit der Metastasenanzahl korrelierte. Die Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass tumor-assoziierte Makrophagen im Kolonkarzinom, wie auch in einigen anderen malignen Erkrankungen, eine tumor-unterstützende Rolle ausüben. Darüber hinaus scheinen Kupffer-Zellen einen entscheidenden Promotor bei der Ausbildung von Lebermetastasen darzustellen. Zukünftige Therapien könnten darauf abzielen, selektiv bestimmte Makrophagenpopulationen wie die tumor-assoziierten Makrophagen oder Kupffer-Zellen zu depletieren. Eine weitere Möglichkeit bestünde in der Umdifferenzierung von tumor-assoziierten Makrophagen (M2) in proinflammatorische Makrophagen (M1), die dann suppressiv oder zytotoxisch auf den Tumor wirken. Des Weiteren wurden zwei Untersuchungsmethoden zur Darmbildgebung in der Maus mittels MRT entwickelt, die eine deutliche Steigerung der Bildqualität und einen zusätzlichen Informationsgewinn in Tierversuchen ermöglichen. Beide Untersuchungstechniken erwiesen sich als gut reproduzierbar und erlauben eine longitudinale Beurteilung von Darmerkrankungen über einen längeren Zeitraum. In weiteren Versuchen müsste nun die Sensitivität und Spezifität der beiden beschriebenen Methoden bei der Untersuchung pathologischer Läsionen des Darmes beurteilt werden.

Shunts stellen eine therapeutische Option bei intrakranieller Drucksteigerung dar. Diese Arbeit beruht auf den Ergebnissen einer Studie mit 22 Patienten. Analysiert wurden die Blut- und Liquorproben dieser Patienten im Hinblick auf die Veränderung der Nieren- und Eisenparameter sowie die Verteilung des liquor-spezifischen Beta-Trace-Proteins.

Ziel der vorliegende Arbeit war es, das zur Zeit national und international verbreitete nicht operative Management (NOM) bei Versorgung von parenchymatösen Organläsionen nach stumpfem Bauchtrauma zu analysieren. Es wurde untersucht, ob die nichtinvasive und kostengünstige Sonografie sowohl für die primäre Diagnostik, als auch für die Verlaufskontrollen bei kreislaufsuffizienten Kindern mit parenchymatösen Organläsionen ausreichend sicher ist. Wir untersuchten die Kinder, die in der Zeitraum von 2007 bis 2013 in der Klinik und Poliklinik für Kinderchirurgie der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald wegen eines stumpfen Bauchtraumas stationär aufgenommen wurden. Es wurden 156 Patienten in diese Studie eingeschlossen und alle Patienteninformationen retrospektiv aus dem Krankenblatt erhoben und ausgewertet. Die Auswertung zeigte, dass 98% der Kinder mit parenchymatöser Organläsion nach stumpfem Bauchtrauma erfolgreich konservativ behandelt werden konnten. 154 Patienten (98%) erhielten primär eine Sonografie des Abdomens nach der initialen körperlichen Untersuchung. Davon zeigten zweiundzwanzig Patienten (14,2%) primär einen auffälligen Sonografie-Untersuchungsbefund. Sieben Patienten davon bekamen als weitere Diagnostik eine Abdomen-CT, drei Patienten eine Abdomen-MRT und ein Patient eine MRCP. In allen elf Fällen konnte die sonografisch dargestellten Organläsionen bewiesen werden. Von 154 Patienten zeigte sich in der Abdomen-Sonografie nur ein falsch positiver und nur ein falsch negativer Befund. Mit unseren Ergebnissen aus der vorgelegten Studie kommen wir zu der Schlussfolgerung, dass bei kreislaufsuffizienten Kindern mit parenchymatöser Organläsion trotz auffälligem Sonografiebefund nicht zwingend eine Abdomen-CT erforderlich ist. Die Verlaufskontrolle kann durch wiederholte Abdomen-Sonografien durchgeführt werden. Ferner können wir den hohen Stellenwert der nicht operativen Therapie von Abdominalorganverletzungen im Kindesalter bestätigen.

In unserer Gesellschaft vollzieht sich ein demografischer Wandel, der zu einer zunehmend alternden Bevölkerung führt. Dies erfordert, Menschen höheren Lebensalters vermehrt in den Fokus von Forschung und Medizin zu rücken, einem Anspruch, dem die vorliegende Arbeit gerecht werden möchte. Zielsetzung war die Entwicklung eines auf das von Antonovsky begründeten Konzeptes der Salutogenese ausgerichteten Messinstrumentes, zur Erfassung des Kohärenzgefühls im höheren Lebensalter. Die neue Skala sollte einerseits die testspezifischen Gütekriterien Objektivität, Reliabilität und Validität erfüllen, gleichzeitig aber auch forschungsökonomischen Prinzipien gerecht werden und das vor dem Hintergrund einer zielgruppenorientierten Ausrichtung. Die Fragebogenentwicklung vollzog sich in mehreren Teilschritten. Als Einstieg diente eine explorative Vorstudie in Form von Gruppendiskussionen, die der Itemgenerierung diente. Hieraus entstand ein Pool von 90 Items, der im Anschluss einer Expertenbefragung hinsichtlich seiner Eignung für den Fragebogen unterzogen wurde. Als Resultat entstand eine 30 Items umfassende Sammlung, in der jede SOC-Komponente quantitativ gleich vertreten war. Diese wurde einer Gruppe von sechs Probanden zur Testung auf Verständlichkeit zugeführt. In der Folge wurde ein Item umformuliert, die anderen konnten unverändert in die vorläufige Fragebogenversion, Meine Lebensorientierung, übernommen werden. Diese wurde, eingebettet in eine umfangreiche Fragebogenbatterie, im Rahmen der Greifswalder Studie zur Lebensorientierung im Alter, im Oktober 2011 in drei Kleinstädten in Norddeutschland eingesetzt. Im Anschluss fand die statistische Datenauswertung statt. Mittels Itemanalyse wurden nicht geeignete Items identifiziert und aus der Sammlung eliminiert. Als Resultat entstand eine neue Skala, Das Kohärenzgefühl im höheren Lebensalter, mit 15 Items, jeweils fünf pro SOC-Komponente. In der durchgeführten Studie zeigte diese Skala eine gute interne Konsistenz. Hingegen ließen sich die theoriegeleiteten drei SOC-Komponenten faktorenanalytisch nicht reproduzieren, auch von dem Vorliegen eines Generalfaktors ist, als weitere wichtige Erkenntnis, nicht auszugehen. Die externe Validität wurde in der Untersuchung als mittelstark berechnet. Abschließend lässt sich festhalten, dass die finale Skala, Das Kohärenzgefühl im höheren Lebensalter, ein reliables und valides Messinstrument darstellt, das zur ökonomischen Erfassung des Kohärenzgefühls, z. B. als Screening-Methode im Rahmen der hausärztlichen oder geriatrischen Betreuung, sinnvoll seinen Einsatz finden kann.

Einleitung Die Heilung einer Wunde unterscheidet sich in der Narbenbildung, dem Einfluss von Risikofaktoren, dem funktionellen und ästhetischen Ergebnis und in der Wundheilungsdauer. Eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien beschäftigt sich mit Möglichkeiten, die Dauer der Wundheilung zu verkürzen. Dabei fällt auf, dass bisher keine klinischen Daten zur Wundheilungsdauer existieren, insbesondere keine, die die Dauer der Re-Epithelialisierung ohne spezifische Wundbehandlung wiedergeben. Ziel dieser Studie ist daher die Ermittlung der Re-Epithelialisierungszeit einer klinischen Wunde in Tagen und wie diese durch individuelle Faktoren beeinflusst wird. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse einer klinischen Studie von Spalthautentnahmestellen hinsichtlich der durchschnittlichen Dauer des epithelialen Wundverschlusses in Abhängigkeit verschiedener individueller Einflussfaktoren. Material und Methoden Die verwendeten Daten entstammen zweier multizentrischer Phase-III-Studien zur Untersuchung der klinischen Wirksamkeit und Sicherheit eines topischen BetulinGels bezüglich der Heilung von Spalthautentnahmestellen (EudraCT no. 2012-003390-26, EudraCT no. 2012-000777-23). Die Spalthautentnahmestellen wurden halbiert und nach Randomisierung eine Hälfte mit Betulin Gel behandelt und die andere Hälfte als Kontrollseite mit einem Standardwundverband verschlossen. Gegenstand dieser Studie waren ausschließlich die Kontrollseiten. Die Beurteilung der Wundheilung erfolgte mittels Auswertung von Fotos durch drei unabhängige und verblindete Wundexperten via eines Online-Tools. Das Studienprotokoll schloss 198 Patienten ein. Die Beobachtung endete nach Erreichen einer Re-Epithelialisierung von über 95% der Wundfläche oder spätestens 28 Tagen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kaplan-Meier-Überlebenszeitanalysen mit einem Konfidenzintervall von 95%. Dabei wurde die kumulative Ereignisrate für verschiedene Einflussfaktoren aufgetragen und mittels Logrank Test statistisch analysiert. Ergebnisse Die Re-Epithelialisierung der Wunden dauerte mindestens sieben Tage. Die schnellsten 25% der Patienten („fast healers“) zeigten einen epithelialen Wundverschluss innerhalb von elf Tagen, während die Re-Epithelialisierung im Median 14 Tage andauerte und die langsamsten 25% („slow healers“) der Studienpopulation 18 Tage benötigten. Patienten unter 40 Jahren zeigten einen signifikant schnelleren epithelialen Wundverschluss von zwölf Tagen während die Re-Epithelialisierung bei Patienten über 60 Jahren 18 Tage dauerte (p=0). Gebärfähigkeit reduziert die Dauer signifikant um vier Tage (p=0,002), während Krebserkrankungen und begleitende Glucocorticoid-Therapien die oberflächliche Wundheilungsdauer um zwölf beziehungsweise zehn Tage verlängern (p=0). Zusammenfassung Eine oberflächliche, artifiziell durch eine Spalthautentnahme entstandene Wunde zeigt ohne gezielte Wundbehandlung einen Schluss der Epitheldecke nach frühestens sieben Tagen, in der Gruppe der „fast healers“ nach elf Tagen, im Median nach 14 Tagen und benötigt 18 Tage in der Gruppe der „slow healers“. Die Wundheilung wird um vier bis zwölf Tage verlängert durch ein Patientenalter über 60 Jahren, eine maligne Grunderkrankung und eine Begleitmedikation mit Glucocorticoiden. Die Wundheilung wird durch ein Patientenalter unter 40 Jahren und die Gebärfähigkeit von Frauen um zwei bis vier Tage beschleunigt. Diese ergab die Analyse von 198 Patientendaten aus 32 europäischen Krankenhäusern basierend auf einer verblindeten Beurteilung standardisierter fotografischer Wunddokumentation.

Die nichtinvasive Vagusstimulation etabliert sich zunehmend als wirkungsvolle und nebenwirkungsarme Therapieoption bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen. Ermöglicht wird dies durch die kutane Repräsentation des N. vagus im Ohr, dem Ramus auricularis nervi vagi. 2003 wurde die Möglichkeit einer diagnostischen Nutzung dieses Hautastes untersucht und nach Stimulation der Innenseite des Tragus reproduzierbar Skalpantworten aufgezeichnet, Vagus sensorisch evozierte Potentiale genannt. Jedoch wurde die Entstehung im vagalen System bzw. überhaupt die neuronale Herkunft dieser Skalpantworten nicht eindeutig belegt. Gerade im inneren Außenohr liegt eine interindividuell variable Mischinnervation aus N. vagus, N. trigeminus und zevikalem Plexus vor. Zudem können Muskelartefakte die Potentialantworten verfälschen. In dieser Arbeit sollten die VSEP unter Ausschaltung der Muskelaktivität artefaktfrei reproduziert und weitere Untersuchungen zur Klärung von deren Herkunft durchgeführt werden. Dies beinhaltete die subkutane Blockade des Stimulationsortes mit Lidocain und NaCl-Injektion sowie die topische Blockade mit EMLA-Crème. Insgesamt wurden 31 Patienten und Probanden in 32 Sitzungen in die Auswertung eingeschlossen. In diesen Teilnehmern konnten die vorbeschriebenen Skalpantworten reproduziert werden. Bei den Teilnehmern der Relaxationsstudie verschwanden die Skalpantworten während der Vollrelaxation und kehrten nach der Erholung von dieser zuverlässig wieder zurück. In zwei Teilnehmern war vor und nach der Muskelrelaxation ein stimulationssynchrones Muskelzucken im Kopfbereich zu erkennen. Bei den meisten Teilnehmern der lokalen Blockadestudien verloren sich die Skalpantworten in der ersten Aufnahme nach der Applikation des jeweiligen Lokalanästhetikums. Die Pinpricktestung und die Wahrnehmung der Stimulation waren zu diesem Zeitpunkt im Wesentlichen negativ. Die Rückkehr der Skalpantworten unterschied sich zwischen den Teilnehmern und erfolgte bei den meisten nach der Rückkehr der Wahrnehmung. Bei drei Teilnehmern der Studie mit Lidocainblockade kehrten die Kurven im Untersuchungszeitraum nicht zurück. Nach der lokalen Injektion von NaCl blieben Kurven und Sensorik unbeeinflusst. Aus der vorliegenden Arbeit lassen sich zwei Rückschlüsse ziehen: Der Beginn der Skalpantwort ist nerval vermittelt, dafür spricht das Verschwinden unter der lokalen Blockade. Die Endstrecke verläuft, ebenfalls nerval vermittelt, über die neuromuskuläre Endplatte, dafür spricht das Verschwinden der Antworten unter Vollrelaxation. Der Verlauf des Reflexbogens sowie die beteiligten Muskeln und daraus folgend die korrespondierenden Nerven und Nervenfaserklassen sind weiterhin unklar. Ein Hinweis für eine Beteiligung der vagalen Kerngebiete ergibt sich aus der vorliegenden Arbeit nicht.

Symbiosis essentially forms the cornerstone of complex life on earth. Spearheading symbiosis research in the last few decades include the exploration of diverse mutualistic animal-bacterial associations from marine habitats. Yet, many facets of symbiotic associations remain under-examined. Here we investigated marine bivalves of the genera Bathymodiolus and Codakia, inhabiting hydrothermal vents and shallow water ecosystems, respectively, and their bacterial symbionts. The symbionts reside intracellularly within gill epithelia and supply their host with chemoautotrophically fixed carbon. They oxidize reduced substrates like sulfide (thiotrophic symbionts) and methane (methanotrophic symbionts) from surrounding fluids for energy generation. The nature of interactions between host and symbiont at the metabolic and physical level, as well as between the holobiont and its environment remain poorly understood. In vitro cultivations of both symbiont and host are difficult till date, hampering the feasibility of targeted molecular investigations. We bypassed culture-based experiments by proteogenomically investigating physically separated fractions of host and symbiont cell components for the bivalves Bathymodiolus azoricus, Bathymodiolus thermophilus and Codakia orbicularis. Using these enrichments, we sequenced the symbionts’ genomes and established semi-quantitative host-symbiont (meta-) proteomic profiles. This combined approach enabled us to resolve symbiosis-relevant metabolic pathways and adaptations, detect molecular factors mediating physical interactions amongst partners and to understand the association of symbiotic traits with the environmental factors prevailing within habitats of the respective bivalve. Our results revealed intricate metabolic interdependence between the symbiotic partners. In Bathymodiolus, these metabolic interactions included (1) the concentration of essential substrates like CO2 and thiosulfate by the host for the thiotrophic symbiont, and (2) the host’s replenishment of essential TCA cycle intermediates for the thiotroph that lacks biosynthetic enzymes for these metabolites. In exchange (3), the thiotroph compensates the host’s putative deficiency in amino acid and cofactor biosynthesis by cycling aminoacids derived from imported precursors back to the host. In case of Codakia orbicularis, the symbionts may metabolically supplement their host with N-compounds derived from fixation of molecular nitrogen, a trait that was hitherto unknown in chemosynthetic thiotrophic symbionts. Individual proteogenomic investigations of the bivalves Bathymodiolus azoricus and Bathymodiolus thermophilus showed that their symbionts are able to exploit a multitude of energy sources like sulfide, thiosulfate, methane and hydrogen to fuel chemosynthesis. The bivalves and their thiotrophic symbionts, however, are particularly adapted to thiosulfate-utilization, as indicated by mitochondrial production and concentration of thiosulfate by host and dominant expression of thiosulfate oxidation enzymes in the symbiont. This may be advantageous, because thiosulfate is less toxic to the host than sulfide. The central metabolic pathways for energy generation, carbon and nitrogen assimilation and amino acid biosynthesis in thiotrophic symbionts of both Bathymodiolus host species are highly conserved. Expression levels of these pathways do, however, vary between symbionts of both species, indicating differential regulation of enzyme synthesis, possibly to accommodate differences in host morphology and environmental factors. Systematic comparison of symbiont-containing and symbiont-free sample types within and between B. azoricus and B. thermophilus revealed the presence of ‘symbiosisspecific’ features allowing direct host-symbiont physical interactions. Host proteins engaged in symbiosis-specific functions include 1) a large repertoire of host digestive enzymes predominant in the gill, possibly facilitating symbiont population control and carbon acquisition via direct enzymatic digestion of symbiont cells and 2) a set of host pattern-recognition receptors, which may enable the host to selectively recognize pathogens or even symbionts “ripe” for consumption. Symbiont proteins engaged in symbiosis-specific interactions included 3) an enormous set of adhesins and toxins, putatively involved in symbiont colonization, persistence and host-feeding. Bathymodiolus symbionts also possess repertoires of CRISPR-Cas and restrictionmodification genes for phage defense that are unusually large for intracellular symbionts. Genomic and proteomic comparisons of thiotrophic symbionts of distinct Bathymodiolus host species from different vent sites revealed a conserved core genome but divergent accessory genomes. The B. thermophilus thiotroph’s accessory genome was notably more enriched in genes encoding adhesins, toxins and phage defense proteins than that of other Bathymodiolus symbionts. Phylogenetic analyses suggest that this enrichment possibly resulted from horizontal gene acquisition followed by multiple internal gene duplication events. In others symbionts, these gene functions may be substituted by alternate mechanisms or may not be required at all: The methanotrophic symbionts of B. azoricus, for example, has the genetic potential to supplement phage defense functions. Thus, the accessory genomes of Bathymodiolus symbionts are species- or habitat-associated, possibly facilitating adaptation of the bivalves to their respective micro- and macroenvironments. In support of this, we show that symbiont biomass in B. thermophilus, which hosts only one thiotrophic symbiont phylotype, is considerably higher than in B. azoricus that hosts thiotrophic and methanotrophic symbionts. This suggests that different symbiont compositions in each species produce distinct microenvironments within the holobiont. Our study presents an exhaustive assessment of the genes and proteins involved in this bivalve-microbe interaction, hinting at intimate host-symbiont interdependencies and symbiotic crosstalk between partners. The findings open novel prospects for microbiologists with regard to mechanisms of host-symbiont interplay within highly specialized niches, origin and distribution of prokaryote-eukaryote interaction factors across both mutualistic and pathogenic associations.

Das Cochlea-Implantat (CI)-System stellt eine etablierte Versorgungsmöglichkeit einer Taubheit oder an Taubheit grenzenden Schwerhörigkeit dar, die in vielen Fällen den Betroffenen ein gutes bis sehr gutes Sprachverstehen ermöglicht. Jedoch wird in einigen Fällen das erwünschte Ergebnis einer CI-Versorgung nur zum Teil oder nicht erreicht. Außerdem kann sich im Verlauf einer CI-Versorgung ein anfänglich guter Hörgewinn trotz anscheinend regelrechter Funktion des Implantats verschlechtern. In diesen Fällen kann eine retrocochleäre Störung vorliegen, deren Nachweis allein mit bildgebenden Verfahren schwierig ist. Die Kombination von elektrisch evozierten Summenaktionspotentialen (ECAP) und elektrisch evozierten Hirnstammpotentialen (EAEP) kann den Nachweis einer retrocochleären Störung bei Patienten mit CI verbessern. Ziel der vorliegenden Studie war es, Referenzwerte für elektrisch evozierte frühe Hirnstammpotentiale (ECAP und EBERA) von CI-Trägern zu ermitteln, deren Rehabilitationsverlauf ein durchschnittliches Versorgungsergebnis erwarten ließ. An 19 Probanden wurden insgesamt 20 Messreihen durchgeführt. Dabei wurden an diesen Probanden, unter Verwendung eines optimierten, klick-äquivalenten Stimulus, elektrisch evozierte Potentiale gemessen. Die verwendeten Stimulations- und Messparameter wurden ausführlich erläutert. Auch die Durchführung der Messreihen wurde umfassend beschrieben. Die Ergebnisse aller Messreihen zur Erstellung der Referenzwerte wurden dargestellt und analysiert. Bei der Darstellung und Diskussion wurde besonders auf die Dynamik, die Amplituden, die Absolut-Latenzen und Latenz-Differenzen der gemessenen Potentiale eingegangen. Die Referenzwerte wurden für ipsilaterale und kontralaterale Ableitung in Wertetabellen dargestellt. Besonders die von der Stimulationsintensität abhängigen Absolut-Latenzen der Potentiale eJ3 und eJ5 zeigten unterschiedliche Ausprägungen. Im Anschluss wurden fünf EAEP-Messungen aus der klinischen Routine mit jeweils unterschiedlichen Fragestellungen vorgestellt und gegen die Referenzwerte verglichen. Im letzten Abschnitt wurden sowohl die Referenzwerte als auch die Messungen aus der klinischen Routine diskutiert. Aus der Dynamik der gemessenen ECAP konnte eine Durchführungsempfehlung für EBERA-Messungen an Patienten, die die subjektiv empfundenen Lautheiten der Stimulation nicht eindeutig angeben können, abgeleitet werden. Abschließend wurden die Grenzen der Methode diskutiert und Ausblicke auf zukünftige Forschungsvorhaben gegeben.

Currently, plastic materials are an integral part of our lives, but their production mostly bases on fossil fuels or derivatives, which resources are decreasing. Extraction and processing of non-renewable resources have also negative impact on environment. One of the most promising and environmentally friendly approaches is use of microorganism. This PhD dissertation presents the non-conventional yeast Arxula adeninivorans as a host for production of bio-based and biodegradable poly(hydroxyalkanoates) plastics poly(hydroxybutyrate) and co-polymer poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate). Additionally, the constructed yeast strain was able to secrete enantiomerically pure (R)-3-hydroxybutyric acid. The production of PHAs requires three enzymes: β-ketothiolase, acetoacetyl-CoA reductase and PHA synthase. The strategy followed in this project was divided into two parts. While all three enzymes are responsible for intracellular production of PHA polymer, first two only lead to secretion of (R)-3-HB into culture media, which was used in a first stage of work to establish and optimize polymer production. Both, different bacterial strains and yeast A. adeninivorans were taken into account in screening of the genes encoding aforementioned enzymes. Bacterial genes were chemically synthesized using codon optimization pattern and endogenous genes were obtained using PCR and genomic DNA template from A. adeninivorans LS3 wild-type strain. Each gene was cloned into Xplor2 vector between TEF1 constitutive promoter and PHO5 terminator. Vector containing both thiolase and reductase genes was used for A. adeninivorans transformation. The best combination of heterologous genes was overexpression of β-ketothiolase gene from Clostridium acetobutylicum and acetoacetyl-CoA reductase gene from Cupriavidus necator which led to secretion of 4.84 g L−1 (R)-3-HB, at a rate of 0.023 g L−1 h−1 over 214 h in shaking flask cultivation. Further optimization by fed-batch culturing with glucose as a carbon source did not improve (R)-3-HB secretion, but the rate of production was doubled to 0.043 g L−1 h−1 [3.78 g L−1 of (R)-3-HB at 89 h]. The product of acetoacetyl-CoA reductase is (R)-3-HB-CoA and further removing of CoA moiety is needed for acid secretion into culture media. A. adeninivorans is able to conduct this process without any additional modification but the conversion rate is unknown. Two thioesterases, cytosolic TesBp encoded by TesB gene from E. coli and mitochondrial ATes1p encoded by ATES1 gene from A. adeninivorans, were analysed to enhance secretion process. Additionally, a cytosolic version of ATES1 gene (ATES1cyt) was tested. All three genes were expressed in A. adeninivorans cells under TEF1 constitutive promoter together with thiolase and reductase genes. Despite detected enzymatic activity the yield of (R)-3-HB synthesis and secretion was not increased. Moreover, overexpressed thioesterases negatively influenced cell growth, indicating that they act on other metabolic components. The results provided two sets of information, first, the endogenous secretion system is sufficient for (R)-3-HB production; second, further screening of suitable genes needs to be performed. Based on optimization of (R)-3-HB synthesis, thiolase gene (thl) from C. acetobutylicum and reductase gene (phaB) from C. necator were chosen to combine with PHA synthase gene (phaC) for creating the PHB-V producing strain. The PHA synthase expression module, containing TEF1 promoter and PHO5 terminator, was cloned into Xplor2 vector together with thiolase and reductase expression modules and used for A. adeninivorans transformation. The engineered strain accumulated up to 7.47% PHB of dcw. During the set of cells passaging A. adeninivorans lost the ability to accumulate polymer with maximal 23.1 % of primary accumulation level. Additionally, use of a vector including hygromycin B antibiotic resistance marker (instead of auxotrophic marker in Xplor2) did not improve polymer accumulation and stability. To counteract the effect of loss of accumulation stability, phasin gene (phaP1), originated from C. necator, was introduce together with PHA pathway genes. First screening cultivations resulted in stabilizing of polymer production reaching 9.58 % PHB of dcw and only 12.0 % loss of production ability. Further experiments increased PHB content with 19.9% PHB of dcw (3.85 g L-1) after 180 h of cultivation using rich medium. Use of another thiolase gene, the second thiolase from C. necator (bktB), which theoretically should induce production of PHBV copolymer, led to accumulation only 11.4% PHB of dcw after 139 h and no PHV fraction was detected. Variation of the ratio between flask volume and amount of media influences the level of aeration. Importantly, decrease of aeration level significantly increased polymer synthesis. Additionally, PHB-V copolymer accumulation has been induced by use of different carbon source co-substrates. Use of rich media supplemented with ethanol allow the strain with thl thiolase to accumulate up to 42.9 % PHB of dcw without PHV fraction and with bktB thiolase to 30.5 % PHB of dcw. Nevertheless, despite of lower total amount of polymer, supplementation with 1-propanol allow both strains to accumulate PHB-V copolymer with 7.30 %mol and 22.5 %mol of PHV for thl and bktB strains, respectively. Optimization based on genetic engineering further enhanced polymer production yield led to exceeding of 50 % PHB-V of dcw. For doubling the gene dosage, PHA synthesizing strains of A. adeninivorans were again transformed with Xplor2 vector containing PHA pathway genes. Resulting strains exhibited twice the level of enzymatic activities of thiolase and reductase compared with strains transformed once with expression vector. In a shaking flask experiment the strain transformed twice with vector containing bktB thiolase reached after 240 h 52.1% PHB-V of dcw (10.8 g L-1) with 12.3 %mol of PHV fraction which is the highest level found in yeast. As another genetic approach, a fusion strain has been created. Two different strains have been established and merged using protoplast fusion technique. Doubling of genetic material resulted in similar level of copolymer produced by Arxula as in former experiments (50.2% of dcw, 10.7 g L-1). Culture conditions were optimized in controllable cultivation using fed-batch mode. Although optimal oxygen and pH level and continuous carbon source and nitrogen feeding were maintained, final polymer level in % of dry mass was around three times lower than for shaking flask experiment. Nevertheless, efficient growth of Arxula in fed-batch mode led to increase of total copolymer level in g L-1 (16.5 g L-1 compare to 10.8 g L-1 for shaking flasks) showing the feasibility of using Arxula strain for up-scaling production of copolymer. Acetyl-CoA is a main precursor in synthesis of PHB-V copolymer and change of its pool was investigated. ATP citrate lyase is a cytosolic enzyme converting citrate into oxaloacetate and acetyl-CoA, supporting the biosynthesis of fatty acids. Two genes encoding Acl subunits from Aspergillus nidulans (AnAcl1 and AnAcl2) were again cloned into Xplor2 vector and transformed into A. adeninivorans PHA producing strain. Despite of higher enzymatic activity of AnAclp, accumulation of polymer was around three times higher for control without expression of lyase genes. Expectedly, the strain expressing AnAcl1/2 genes accumulated larger amount of each stearic, palmitic and oleic acid in both standard and fatty acid inducing conditions (lower nitrogen level). Thus, overexpression of AnAcl1/2 genes in A. adeninevorans cells may improve biosynthesis of fatty acids but is ineffective for PHB polymer accumulation. The aim of the project was use of starch-based media, manufactured as by-products, for polymer production. Genetically engineered Arxula strains were cultivated using these media instead of glucose-based media. Although yeast cells were both able to secrete (R)-3-HB and to accumulate PHB, the yield was lower than for previous media. Additionally, only trace of PHV was found at the end of cultivation time when 1-propanol was supplemented. Obtained results showed that use of cheaper media is a promising approach to decrease production costs but further optimization needs to be performed especially for extended scale of production. Determination of produced copolymer has been done based on microscopic analysis and studies of physical and chemical properties. Results revealed that Arxula accumulated PHA polymer in cytosolic granules with a similar size range compared to the ones produced by bacteria. The physicochemical study showed that produced polymer exhibited slightly different properties in comparison to bacterial polymer with similar content of PHV, i.e. very-low molecular mass, higher melting and glass transition temperature. All above results showed that A. adeninivorans is a promising host for PHB-V production. Expression of phasin greatly increased production and stability of polymer, which led to an accumulation level never found before in yeast. Further optimization in higher production scale using cheap starch-based media may establish Arxula strain as a valuable tool for industrial production of PHB-V copolymer.