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Das Endothel ist eine multifunktionale Struktur, die sich an die lokalen Strömungseigenschaften anpassen muss. Dieser komplexe Prozess führt zu verschiedenen Veränderungen der Gestalt und Funktion von Endothelzellen. Neben zahlreichen anderen Strukturen konnte auch von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) gezeigt werden, dass sie in diesen Prozess involviert sind. Es konnte bereits nachgewiesen werden, dass der G-Protein-gekoppelte Apelin-Rezeptor (APJ) in seiner Expression von endothelialem Scherstress reguliert wird und es wurde postuliert, dass der APJ im Konzept der endothelialen Mechanotransduktion eine Rolle spielt. Dieses Konzept beschreibt die Übersetzung von endothelialem Scherstress in intrazelluläre biochemische Signale. Die vorliegende Arbeit versucht, die bisherigen Erkenntnisse durch die weitere Beleuchtung der APJ-Funktionen in humanen umbilikalen venösen Endothelzelle (HUVEC) zu ergänzen. Es konnte gezeigt werden, dass der APJ in konfluenten Endothelzell-Monolayern in vitro auf der junktionalen Membran lokalisiert ist und mit dem wichtigen endothelialen Mechanotransducer Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) ko-assoziiert zu sein scheint. Weiterhin zeigen APJ-defiziente im Vergleich zu Wildtyp-APJ HUVEC geringere Elastizitätsmodule auf, was Hinweise auf veränderte biomechanische Eigenschaften gibt. Die short-interfering RNA (siRNA)-vermittelte „Stummschaltung“ des APJ beeinflusst weiterhin die Zytoskelettstruktur, Anheftung und Reorganisation von Zelladhäsionskomplexen. Zusammenfassend verdeutlicht die vorliegende Arbeit, dass die APJ-Expression sowohl die biomechanischen als auch die morphologischen Eigenschaften von Endothelzellen in Anpassung an die lokalen Flussbedingungen zu beeinflussen scheint.
Nach einer endothelialen Schädigung verliert die Intima sowohl ihre schützende Funktion gegenüber den biomechanischen Kräften des Blutflusses, als auch ihre regulierende Wirkung auf die angrenzenden Gefäßstrukturen. Aus einem gestörten Heilungsprozess resultieren pathologische Veränderungen mit teils schwerwiegenden Folgen für den Patienten, wie die In-Stent-Restenose nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA) mit Stent-Implantation. Es sind vor allem die flussexponierten glatten Gefäßmuskelzellen, die durch ihre Fähigkeit des Phänotypwechsels nach Denudierung an der Pathogenese maßgeblich beteiligt sind. Dieser Phänotypwechsel wird unter anderem durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der muskulären scherstressabhängigen ROS-Produktion und deren Beeinflussung durch den G-Protein gekoppelten APJ-Rezeptor mitsamt seinem Liganden, dem Apelin.
Mit Hilfe zweier Perfusionssysteme konnten koronare arterielle glatte Muskelzellen (HCASMC) genau definierten Flussbedingungen, einem mit niedrigen physiologischen und einem mit erhöhten pathologischen Scherstress, ausgesetzt werden. In der anschließenden molekularbiologischen Aufarbeitung zeigt sich ein rascher Anstieg der muskulären ROS-Konzentration unter einem für die Muskelzellen pathologischem Scherstress. Die vermehrte ROS-Produktion ist auf die NADPH Oxidasen (NOX) zurückzuführen, insbesondere die Isoform NOX4. Darüber hinaus führt pathologisch erhöhter Scherstress zu einer temporär verstärkten muskulären Expression des APJ-Rezeptors. Im Vergleich zu Apelin-13 (ROS-Anstieg) führt die Rezeptorstimulation mittels Apelin-17 zu einer Hemmung der ROS-Produktion. Somit weist diese Arbeit erstmals einen unterschiedlichen Effekt der einzelnen Apelin-Isoformen auf glatte Muskelzellen nach, ähnlich der verschiedenen Reaktionen von Endothelzellen hinsichtlich der Produktion von Stickoxiden.
Das Apelin-/APJ-System besitzt demnach einen regulatorischen Effekt auf den oxidativen Zustand der HCASMC und folglich einen potentiell günstigen Einfluss auf die vaskuläre Heilung nach einer endothelialen Verletzung. Inwiefern Apelin-17 als vasoprotektiver Faktor in der Akutphase nach PTCA eingesetzt werden kann und welchen Einfluss das Apelin/APJ-System auf die Restenoserate besitzt, muss in weiteren Versuchen überprüft werden.
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase Inhibitoren (Statine) bewirken hauptsächlich die Beeinflussung des Lipidstoffwechsels. Sie besitzen aber auch lipidunabhängige (pleiotrope) Effekte, wie z.B. die Verbesserung der Endothelfunktion. Aufgrund ihrer molekularen Struktur kann man zwischen hydrophilen (z.B. Pravastatin) und lipophilen (z.B. Atorvastatin) Statinen unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, ob eine unterschiedliche Lipophilie die pleiotropen Effekte von Statinen beeinflussen kann. Hierzu wurden Statine mit unterschiedlicher Lipophilie hinsichtlich der endothelialen Proliferation und flussinduzierten Migration charakterisiert sowie deren unterschiedliches Verhalten mit möglichen Signaltransduktionswegen assoziiert.
Über Bioimpedanzmessungen (xCelligence) und BrdU-Assays wurde die Proliferation von HUVEC unter Statinen oder in Kombination mit Mevalonat über 48 h untersucht. Zur Quantifizierung der flussinduzierten Migration wurden mit einem Flusskammersystem Live Cell Imaging Versuche über 15 h durchgeführt. In den Versuchen wurden Atorvastatin (ATOR) und Pravastatin (PRA) in den Konzentrationen 0,1 und 1 µM verwendet. Nach Beendigung der Versuche wurden über RT-qPCR und Microarray (Migrationsversuche) Genexpressionsanalysen durchgeführt.
ATOR und PRA hatten keinen negativen Einfluss auf die Vitalität der EC. ATOR zeigte einen positiven Effekt auf die endotheliale Proliferation und führte zu einer Verbesserung der Endothelfunktion unter statischen Bedingungen. Beide Statine zeigten unter Scherstress eine gerichtetere Migration. Allerdings erhöhte nur ATOR die Migration unter pathologischem Scherstress. Weiterhin wurden auch auf Transkriptionsebene Unterschiede festgestellt. Über den Microarray konnte mit XBP1 möglicherweise ein neuer Regulator der pleiotropen Statineffekte identifiziert werden.
Zur Vermeidung von In-Stent-Restenosen nach Perkutaner Koronarangioplastie mit Stent-Implantation ist eine optimale Reendothealisierung von großer Bedeutung für die weitere Prognose des Patienten. Basierend auf den Daten dieser Arbeit scheinen lipophile Statine, wie ATOR, insgesamt besser geeignet zu sein, da sie Proliferation, Migration und Endothelzellfunktion positiv beeinflussen. Diese Erkenntnis könnte u.a. für die zukünftige Entwicklung von Statin-freisetzenden Stents von hoher Bedeutung sein.
Trotz der kontinuierlichen Weiterentwicklung der präventiven, diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen stellt die koronare Herzkrankheit (KHK) und deren Folgen auch zukünftig eine große Herausforderung in der Medizin dar. Es besteht ein kritischer Bedarf für einen nicht-invasiven Biomarker, um Patienten mit dem größten Risiko für ein akutes pathologisches Ereignis bereits vor der klinischen Manifestation zu identifizieren. Ein solcher Biomarker wird auch für die schnelle Diagnosestellung bei symptomatisch auffälligen Patienten benötigt, bei denen die bisher etablierten Marker (Troponin, CK - Kreatinkinase) noch nicht nachweisbar sind. Als potenzieller Kandidat für einen solchen Biomarker könnten zirkulierende Endothelzellen (cEC) in Frage kommen. Obwohl die Rolle der cEC im akuten Myokardinfarkt (MI) noch nicht vollständig geklärt ist, legen die bisherigen Untersuchungen nahe, dass cEC eine differentialdiagnostische Möglichkeit für die Myokardinfarktpatienten in der so genannten ''Twighlight Zone'' - die Zeit zwischen ischämischem Ereignis und Nachweis von Troponin im Blut - sein können. Ziel dieser Untersuchung war daher, eine Einsicht in die komplexe methodische Quantifizierung der cEC und deren potentielle diagnostischen und prognostischen Rolle bei Patienten mit MI zu liefern.
In der vorliegenden Arbeit wurden 31 Patienten mit Myokardinfarkt eingeschlossen, 14 mit ST-Hebungsinfarkt (ST-elevation myocardial infarction/STEMI) und 17 mit nicht ST-Hebungsinfarkt (non ST-elevation myocardial infarction/NSTEMI). Als Kontrolle wurden 12 gesunden Probanden (Blutspender) ohne das Vorliegen einer KHK in der Anamnese gewonnen. Mittels Durchflusszytometrie wurden cEC der Patienten und der Kontrollgruppe bestimmt.
Die Ergebnisse zeigen einen Anstieg der cEC bei Infarktpatienten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieser Unterschied war zwischen STEMI- und NSTEMI-Gruppe sowie STEMI- und Kontrollgruppe von statistischer Signifikanz. Des Weiteren wurde in Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen keine
Korrelation zwischen cEC-Anzahl und den kardialen Enzymen (Troponin und CK) nachgewiesen. Bezüglich der prognostischen Bedeutung der cEC konnte in dieser Arbeit eine signifikante Korrelation der cEC mit dem GRACE-Score (in hospital risk of death and 6-month probability of death) bei den Patienten adjustiert für Alter, BMI und CRP nachgewiesen werden. Diese Studie gibt erste Hinweise darauf, dass cEC als additive Biomarker bei der Diagnose des Myokardinfarktes eingesetzt werden könnten, wobei weitere klinische Studien klären sollten, inwieweit cEC für diagnostische als auch prognostische Zwecke dienen könnten.
In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Anwendung von kaltem atmosphärischen Plasma (CAP) bei der Therapie von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) evaluiert werden. Dazu wurden in vitro HNO97- und HNO41-Karzinomzellen mit Argon-CAP bzw. Helium-CAP durch den kINPen 09 bzw. einen Prototyp behandelt und einer Epithelzelllinie gegenübergestellt, um quellgasbedingte Unterschiede herauszuarbeiten. Durch die Verwendung von fetalem Kälberserum (FCS) und Panexin NTA (NTA) konnten zwei unterschiedliche Mediumzusätze verglichen werden.
In Wachstumskinetiken wurde eine Reduktion der Zellzahl von Karzinom- und Epithelzellen nach CAP-Behandlung erzielt. Daran schloss sich eine Proteomanalyse durch 2D-DIGE mit mas- senspektrometrischer Identifikation von in ihrer Menge veränderten Proteinen im Vergleich zu korrespondierenden Gaskontrollen an. Durch eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) regu- lierter Proteine konnten die behandelten Proben in Cluster aufgeteilt werden. Die Auftrennung war in absteigender Effektgröße abhängig vom verwendeten Serum, Quellgas und der CAP-Behandlung. Mit Hilfe von Ingenuity Pathway Analysen (IPA) wurden Regulatorproteine und molekulare Funktionen identifiziert. So ließ sich die Regulation von p53, HSF1 und TGF-b und eine damit verbundene Beeinflussung der Stressantwort auf ungefaltete Proteine, der mitochondrialen Membranpermeabilität und der Apoptose nachweisen. Durch Darstellung der regulierten Proteine in Netzwerken konnte der Einfluss von CAP auf den MAPK-ERK-Pathway als zentraler Bestandteil der Wirkung identifiziert werden.
Nach Analyse der Proteinveränderungen wurde explizit eine mögliche Beeinflussung von Hit- zeschockprotein 27 (HSP27) und Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) mittels Immunoblotassay untersucht. HSP27 dient u.a. der Reduktion von oxidativem Stress. GAPDH ist in Abhängigkeit vom Oxidationsstatus Bestandteil der Glykolyse oder an der Apoptose beteiligt. Es zeigte sich eine Reduktion der Proteinmenge von HSP27 durch CAP in Karzinomzellen, die unter Verwendung von NTA größer ausfiel als unter FCS. Die Proteinmenge von GAPDH änderte sich nicht, es ließ sich lediglich eine Modifikation des Proteins vermuten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Karzinomzellen an oxidativen Stress nur bedingt anpassungsfähig sind und CAP somit eine geeignete Therapieoption darstellt. Die Effektivität des CAP wird dabei durch das Quellgas, die Behandlungsdauer sowie extra- und intrazelluläre Scavengersysteme beeinflusst.
