Institut für Biochemie
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Enzymes harbor immense potential for application in industrial synthesis processes, however the need for improvement in activity, selectivity, a broadened substrate scope or an increased thermal and organic solvent tolerance to meet the required non-natural industrial conditions requires optimization. Different protein engineering approaches are known and undergone to optimize specific properties of these biocatalysts. Machine learning emerged as a novel approach to alter the properties through algorithmic pattern recognition in data and has the potential for a paradigm shift in protein engineering. The complementary role of machine learning for protein engineering is exemplified for amine transaminases in Article I and Article II. Based on the key observations, a machine learning model was built that incorporated information regarding steric and electronic properties of amine substrates and active site residues. The predictor was improved in iterative computational prediction and experimental validation cycles and was used for the correct prediction of variants with improved activity and accurate activity estimation for a novel substrate. Article II envisioned further exploration of the potential of the machine learning predictor design with a focus on more challenging bulky amine substrates, prevalent in active pharmaceutical ingredient (API) precursors. Simultaneously, the key steps involved in the design of machine learning-guided protein engineering were formulated in a protocol. The predictor was successfully used for the prediction of higher active variants. In concept Article III the results of Article I are placed into context of the lack of machine learning descriptors for substrate scope enhancements. In addition, current limitations and potential improvements for data-driven protein engineering in the future are further elaborated on. Lastly, Article IV describes a developed high-throughput assay for S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases to address one of the restrictions mentioned in Article III. This facilitated data generation should accelerate methyltransferase engineering campaigns and could enable machine learning-based investigations in the future.
Tumor ist nicht gleich Tumor! Patient ist nicht gleich Patient! Neben krankheitsspezifischen Gegebenheiten spielen u.a. Lebensweise und eingenommene Medikamente eine entscheidende Rolle. Deshalb geht der aktuelle Trend zur personalisierten Krebstherapie. Dafür ist die Grundlagenforschung mit den dazugehörigen Erkenntnissen und möglichen Biomarkern essentiell. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Funktionen der miRs miR455, miR597 und miR660 und ihren Nutzen als Biomarker im OC näher zu betrachten.
Zunächst wurde deutlich gezeigt, dass im OC Gewebe beide miR Stränge exprimiert werden. Im Serum ist hingegen nur ein miR Strang nachweisbar, sodass davon ausgegangen werden kann, dass auch nur dieser sekretiert wird. Der Einfluss der miR Stränge auf die typischen Tumoreigenschaften, wie Proliferation, Migration und Apoptose, scheint unabhängig vom Strangtyp zu sein. Dennoch konnten Korrelationen zwischen klinischen Parametern und einzelnen miR Strängen gezeigt werden. So spielen die miR Stränge unterschiedliche Rollen bei der Genexpression.
Die untersuchten miRs eignen sich weniger als diagnostischer Biomarker, da eine Diagnose allein über ihre Serumkonzentration nicht ausreichend möglich ist. Aber die Menge exprimierter miR im Ovar kann eine Diagnose unterstützen und Aufschluss über das Ausmaß der Erkrankung geben. So exprimiert malignes OC Gewebe signifikant weniger miR455. Korrelationstests haben gezeigt, dass das Expressionslevel von miR455-5p, miR597-5p und miR660 eng mit dem Vorkommen von Fernmetastasen verbunden ist. Metastasen wurden diagnostiziert, wenn das Expressionslevel vergleichsweise niedrig war. Außerdem entwickelten Patientinnen mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit ein Rezidiv bei niedriger miR660-3p Expression. Mit Hilfe einer entsprechenden Datenbank könnte man die Werte einer einzelnen Patientin im Vergleich betrachten und einen wahrscheinlichen Krankheitsverlauf vorhersagen. Eine frühzeitige Metastasensuche und eine engmaschigere Nachsorge bei besonders gefährdeten Patientinnen wäre ein erheblicher Fortschritt.
Die untersuchten miRs gehören zur Gruppe der Tumorsuppressoren. Im OC Gewebe ist ihre Expression supprimiert. Dadurch können onkogene Proteine vermehrt translatiert werden und die tumorspezifischen Fähigkeiten erzeugen. Medizinisch ist es deshalb von großem Interesse das Gleichgewicht im miR Haushalt wiederherzustellen und damit dem malignen Krankheitsverlauf entgegenzuwirken. Erste Studien zum Ausgleich des miR Defizites sind bereits veröffentlicht. Eine Kombination von verschiedenen miRs wäre aufgrund der Komplexität der menschlichen Biologie auch denkbar.
Die vorliegende Studie bildet ein weiteres Puzzelteil zum Verständnis der biologischen Zusammenhänge im OC. Zusammen mit zahlreichen Erkenntnissen aus Vergangenheit und Zukunft wird es möglich sein, Frauen mit OC eine bessere Heilungschance vorhersagen zu können.
Intrazellulärer Transport lysosomaler Hydrolasen und deren Veränderung in der akuten Pankreatitis
(2024)
Die akute Pankreatitis ist einer der häufigsten gastroenterologischen Erkrankungen, wobei deren Pathogenese auf zellulärer Ebene noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Bekannt ist, dass beginnend mit einer hohen cytosolischen Ca2+-Konzentration eine intrazelluläre Aktivierung von Trypsin eintritt, was zu einer Proteasenaktivierung in den pankreatischen Azinuszellen führt. Dies resultiert letztendlich im Tod dieser Zellen und in der Aktivierung des Immunsystems. Wie Trypsin, welches im sekretorischen Kompartiment lokalisiert ist, über das überwiegend lysosomal lokalisierte Cathepsin B aktiviert wird, bleibt jedoch ungeklärt.
Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurde über einen pankreasspezifischen Knockout von Rab7 die Fusion von sekretorischen Vesikeln und Lysosomen inhibiert und nachfolgend die subzelluläre Verteilung der Enzyme vor und nach Stimulation der Mäuse mit Caerulein untersucht. Dabei fiel auf, dass bei Fehlen von Rab7 alle untersuchten Cathepsine erhöht exprimiert und verstärkt im sekretorischen Kompartiment lokalisiert vorlagen. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die Trypsinaktivität oder den Beginn der Erkrankung, was sowohl in isolierten Azinuszellen als auch in vivo gezeigt werden konnte. Zu einem späteren Zeitpunkt nahm die Schwere der akuten Pankreatitis in den knockout Mäusen zu. In einem weiteren Modell erfolgte eine Vorbehandlung von Wildtyp (C57BL/6) Mäusen mit der lysosomotropen Substanz Glycyl-L-Phenylalanin 2-Naphthylamid (GPN). Dabei konnte gezeigt werden, dass auch nach Permeabilisierung der Lysosomen durch Caerulein eine intrazelluläre Trypsinaktivierung und akute Pankreatitis induziert wurde und der pankreatische Schaden im Wesentlichen unverändert zu den Kontrollen war.
Ein zweiter Ansatz fokussierte sich auf den intrazellulären Transport der Cathepsine. Mithilfe eines knockout Mausmodells für CLN8 sollte der Export von lysosomalen Proteinen vom rauen Endoplasmatischen Retikulum in das cis-Golgi Netzwerk inhibiert und Cathepsin B weder das Lysosom noch das sekretorische Kompartiment erreichen und somit nicht für die Aktivierung von Trypsinogen zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit konnte allerdings gezeigt werden, dass trotz Deletion von CLN8 Cathepsine im lysosomalen und imsekretorischen Kompartiment lokalisiert sind, Trypsinogen nach Cholecystokinin- bzw. Caerulein-Stimulation intrazellulär aktivierbar sind und eine akute Pankreatitis initiiert werden kann. Das Fehlen von CLN8 führte im Pankreas zu einer vermehrten Bildung von Autophagosomen, zu dysmorphen und dysfunktionalen Mitochondrien und einem erhöhten ER-Stress, wie anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen, Messung des maximalen mitochondrialen Membranpotentials und der ATP-Synthese sowie Expressionsanalysen der ER-Stress Proteine BIP, ATF6 und CHOP nachgewiesen werden konnte. Expressionsanalysen und Co-Immunopräzipitationen von LC3B sowie dem ER-Phagie regulierenden Rezeptor FAM134B zeigten eine stärkere Expression beider Proteine in CLN8 knockout Mäusen, die sich während der akuten Pankreatitis weiter erhöhte, was darauf hindeutet, dass die ER-Phagie eine wichtige Rolle für die Pathogenese der akuten Pankreatitis bei Defizienz von CLN8 darstellt.
Deletion von CLN8 mittels CRISPR/Cas9 in 266-6 Zellen, einer murinen Azinuszelllinie, bestätigte, dass das Fehlen von CLN8 mit einem erhöhten ER-Stress verbunden ist. Gleichzeitig waren eine verminderte Zellproliferation und Veränderungen der Zellmorphologie in CLN8-defizienten 266-6 nachweisbar.
Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse, dass die Initiation der akuten Pankreatitis ohne Lysosomen stattfinden kann. Weder eine Inhibition der Fusion von Zymogengranula und Lysosomen, noch eine Störung der Membranintegrität, hervorgerufen durch die lysosomotrophe Substanz GPN, oder eine Störung des Exports von Cathepsinen aus dem ER verhinderten die Induzierbarkeit der akuten Pankreatitis. Diese Beobachtungen stellen die Notwendigkeit der Fusion von Lysosomen mit Zymogengranula als essenzielle Vorraussetzung für den Beginn der akuten Pankreatitis in Frage. Unsere Beobachtungen lassen im Gegenteil sogar die Vermutung zu, dass Lysosomen in der akuten Pankreatitis eine krankheitsmildernde Funktion haben könnten.
Seven new 1,2,3,4,5-pentathiepino[6,7-a]indolizines were synthesized in which the pentathiepine moieties bear an indolizine backbone that is derivatized from C–H to F-, Cl-, Br-, I-, NO2-, and CH3-substitutions, respectively, in a meta position relative to the aza group on the pyridine moiety. Their preparation took place via two common steps: (i) a Sonogashira coupling between (4-substituted) 2-bromo- or 2-chloropyridines and propynyl 3,3-diethylacetal, and (ii) a ring closing reaction mediated by a molybdenum oxo-bistetrasulfido complex and elemental sulfur. The latter simultaneously facilitates the 1,2,3,4,5-pentathiepino chain/ring- and indolizine ring-formations. The fluoro derivative was addressed with 2-bromo-5-aminopyridine as the starting material via a Sandmeyer reaction. The iodo derivative was obtained from 5-bromo-2-alkynylpiridine using a metal-assisted variation of the Finkelstein reaction. The requirement to explore different reaction conditions and the varied respective yields of the final products are discussed. The influence of the distinct substitutions on the pyridine moieties, their electronic structures, and respective chemical properties was investigated through a set of spectroscopic/analytical characterizations. Intriguingly, in all cases, the nitro-substituted derivative exhibited a distinct behavior compared to the six other investigated derivatives, which was also addressed computationally. All seven new pentathiepines were crystallized, and their respective molecular structures were determined using single crystal X-ray diffraction. These structures are compared and discussed as are their respective packing patterns.
Synthesis, Characterization and Chlorination of 4-(Pentyloxy)-7-(prop-2-yn-1-yloxy)pteridin-2-amine
(2023)
A new alkyne functionalized pterin derivative was synthesized through a reaction of 7-chloropterin with propargyl alcohol in the presence of sodium hydride. The purity and chemical structure of the compound was validated by NMR (1H, 13C) spectroscopy, Mass (APCI source) spectrometry, elemental analysis, and X-ray crystallography. The title compound may be further functionalized by exploiting the yne moiety, for instance, using click chemistry. The novel pterin derivative, most notably, in contrast to typical pterin behavior, is now soluble or even well soluble in almost any solvent except water.
Mo/W-containing formate dehydrogenases (FDH) catalyzed the reversible oxidation of formate to carbon dioxide at their molybdenum or tungsten active sites. While in the reaction of formate oxidation, the product is CO2, which exits the active site via a hydrophobic channel; bicarbonate is formed as the first intermediate during the reaction at the active site. Other than what has been previously reported, bicarbonate is formed after an oxygen atom transfer reaction, transferring the oxygen from water to formate and a subsequent proton-coupled electron transfer or hydride transfer reaction involving the sulfido ligand as acceptor.
The large amount of waste synthetic polyester plastics has complicated waste management and also endangering the environment due to improper littering. In this study, a novel carboxylesterase from Thermobacillus composti KWC4 (Tcca) was identified, heterologously expressed in Escherichia coli, purified and characterized with various plastic substrates. Irregular grooves were detected on polybutylene adipate terephthalate (PBAT) film by scanning electron microscopy (SEM) after Tcca treatment, and Tcca can also hydrolyze short–chain diester bis(hydroxyethyl) terephthalate (BHET). The optimal pH and temperature for Tcca were 7.0 and 40 °C, respectively. In order to explore its catalytic mechanism and improve its potential for plastic hydrolysis, we modeled the protein structure of Tcca and compared it with its homologous structures, and we identified positions that might be crucial for the binding of substrates. We generated a variety of Tcca variants by mutating these key positions; the variant F325A exhibited a more than 1.4–fold improvement in PBAT hydrolytic activity, and E80A exhibited a more than 4.1–fold increase in BHET activity when compared to the wild type. Tcca and its variants demonstrated future applicability for the recycling of bioplastic waste containing a PBAT fraction.
Structural Differences at Quadruplex‐Duplex Interfaces Enable Ligand‐Induced Topological Transitions
(2024)
Quadruplex‐duplex (QD) junctions, which represent unique structural motifs of both biological and technological significance, have been shown to constitute high‐affinity binding sites for various ligands. A QD hybrid construct based on a human telomeric sequence, which harbors a duplex stem‐loop in place of a short lateral loop, is structurally characterized by NMR. It folds into two major species with a (3+1) hybrid and a chair‐type (2+2) antiparallel quadruplex domain coexisting in a K+ buffer solution. The antiparallel species is stabilized by an unusual capping structure involving a thymine and protonated adenine base AH+ of the lateral loop facing the hairpin duplex to form a T·AH+·G·C quartet with the interfacial G·C base pair at neutral pH. Addition and binding of Phen‐DC3 to the QD hybrid mixture by its partial intercalation at corresponding QD junctions leads to a topological transition with exclusive formation of the (3+1) hybrid fold. In agreement with the available experimental data, such an unprecedented discrimination of QD junctions by a ligand can be rationalized following an induced fit mechanism.
Several synthetic cross-coupling procedures were (re-)evaluated for the tethering of pyrazine to dithiocarbonates. The resultant species constitute pro-ligands and can be converted by removal of the C=O moiety into ene-dithiolate ligand systems that model molybdopterin. The coupling of 2-iodopyrazine with the stannylated dithiocarbonate units mediated by copper(I)-thiophene-2-carboxylate in stoichiometric equivalents proved to be the most efficient and the only reliable route to the targeted compounds. Single-crystal X-ray structural analysis confirmed the final structures of two pursued pyrazine-derived dithiocarbonates and those of two intermediates.
Enzyme-catalyzed late-stage functionalization (LSF), such as methylation of drug molecules and lead structures, enables direct access to more potent active pharmaceutical ingredients (API). S-adenosyl-l-methionine-dependent methyltransferases (MTs) can play a key role in the development of new APIs, as they catalyze the chemo- and regioselective methylation of O-, N-, S- and C-atoms, being superior to traditional chemical routes. To identify suitable MTs, we developed a continuous fluorescence-based, high-throughput assay for SAM-dependent methyltransferases, which facilitates screening using E. coli cell lysates. This assay involves two enzymatic steps for the conversion of S-adenosyl-l-homocysteine into H2S to result in a selective fluorescence readout via reduction of an azidocoumarin sulfide probe. Investigation of two O-MTs and an N-MT confirmed that this assay is suitable for the determination of methyltransferase activity in E. coli cell lysates.