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The studies presented here in this thesis investigated the complex interplay of the human respiratory tract pathogens S. pneumoniae, S. aureus and IAV with human APCs from two different perspectives. On the one hand, our findings demonstrated that pneumococci were able to completely suppress the function of moDCs and alter the subsequent activation of T cells. This immune evasion strategy is mainly based on the release of the pneumococcal virulence factor Ply. Furthermore, pneumococcal lipoproteins are becoming increasingly prominent as potential new serotype independent vaccine candidates. We show the favorable basic potential of the pneumococcal lipoprotein DacB and the significant impact of the attachment of a lipid moiety in a human context. Both, the lipidated version of DacB and MetQ, demonstrated robust activation of human APCs and further induced the proliferation of human CD4+ T cells underscoring the potential adjuvant properties of the lipid moiety.

Throughout evolutionary history, species have always been faced with changing environments, but the unprecedented rate of change induced by current human-induced climate change poses significant challenges to many recent organisms. Besides altering large-scale weather patterns and increasing the frequency and intensity of extreme weather events, climate change is characterised by a significant rise in global temperatures. Projections indicate an increase of 1.5°C to 5°C by the end of the century, largely depending on the extent of greenhouse gas emissions. As temperature is intimately linked to nearly all biological processes, global warming may impact many aspects of animal physiology, including thermoregulation, reproduction, and morphology. In this doctoral thesis, I investigate how global warming affects the physiology of Bechstein’s bats (Myotis bechsteinii), a typical European forest-dwelling species of high conservation concern. I focus particularly on the mechanisms underlying a previously observed increase in body size among individuals born during warmer summers. Using individualised long-term data on morphological and reproductive traits from four wild bat colonies, combined with two field experiments, together with my co-authors, I examined the effects of temperature on body size and metabolism across multiple reproductive seasons. In a first experiment, we artificially raised and maintained roost temperatures at temperatures within the thermoneutral zone of the bats, simulating optimal thermal conditions for growth. Directly heating the bat boxes that were used as day roosts during the maternity season, allowed us to isolate the effects of temperature on body size from potential confounding factors such as insect availability. Our findings reveal that body size in Bechstein’s bats is directly and positively related to warmer roost temperature, likely due to reduced thermoregulatory costs, and thus, increased energy availability for growth. In other words, bats in heated roosts should have exhibited greater thermoregulatory efficiency, requiring less energy to maintain normothermia, which allowed more energy to be allocated toward juvenile growth. In a second experiment, we aimed to unveil the underlying mechanisms that drive the established direct effect of temperature on body size in M. bechsteinii. In order to do so, we used field respirometry to assess the metabolic response of communally roosting Bechstein’s bats to roost temperatures during two lactation periods. Notably, average daily metabolic rates were not different on heated than on unheated days, suggesting that the saved energy from thermoregulating more efficiently is directly reinvested in other aspects, such as growth and/or maternal care. Furthermore, the results highlight the capacity of Bechstein’s bats to cope with cooler temperatures through metabolic and behavioural mechanisms such as torpor, digestion-induced thermogenesis and social thermoregulation. However, as temperature exceeds the thermoneutral zone, the bats’ metabolic rate increased sharply, suggesting that individuals may struggle to cope with extended periods of extreme heat. Prolonged exposure to high temperatures could significantly elevate energy expenditure and lead to dehydration, jeopardising bat populations in an ever warming climate. Thermal imaging data also indicated minimal torpor use during lactation in heated colonies, with only two instances of torpor observed during the whole lactation period in one colony. A reduction in torpor use may alleviate the negative effects of torpor on milk production and growth processes and thus additionally promote offspring development. In a third analysis, we leveraged 14 years of individualised data to test whether heating had an effect on body condition in reproductive females, additionally comparing them to non-reproductive females. Interestingly, despite the thermoregulatory benefits, mothers from heated colonies did not show improved body condition compared to those from unheated colonies, suggesting that the energy saved in warmer conditions is instead allocated to maternal care, further enhancing juvenile growth. We additionally show that body condition in spring is higher in those females that had offspring the subsequent summer than non-reproductive females, suggesting that resources left after hibernation may act as capital for the decision whether or not to reproduce in a given year. In conclusion, the studies I present in this thesis provide key insights into the mechanisms behind the temperature-dependent increase in body size in Bechstein’s bats and, more broadly, how temperature influences their physiology, growth, and reproduction. These findings highlight the complex trade-offs between the apparent immediate benefits of warmer conditions for growth and the potential associated long-term negative effects posed by global warming. Given the ongoing climate crisis, understanding these physiological responses is crucial for the conservation of temperate-zone bat species such as Bechstein’s bats.

This thesis aimed at the identification, engineering, and application of NAD(P)H dependent oxidoreductases such as Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) and enoate reductases (EREDs) due to their importance as biocatalysts in the chemical and pharmaceutical industry. To facilitate the implementation of biocatalysis in industrial processes, improved co-factor regeneration strategies as well as tools for the high-throughput characterization of enzymes are greatly demanded. Therefore, the combination of target biocatalytic reactions with the direct electrochemical regeneration of NAD(P)H co-factors have been investigated herein. Furthermore, the bioinformatic-assisted identification of novel oxidoreductases and their tailoring by protein engineering not only expands the number of available enzymes, the presented biocatalysis-based strategies offer promising alternatives to established chemical reaction schemes that are compliant with ‘The 12 Principles of Green Chemistry’. In Article I, the direct electrochemical NADH regeneration was explored on the cathode of a carbon electrode, modified with Toray paper sprayed with carbon nanoparticles. The nicotinamide product distribution was investigated and the electrochemical flow cell reactor was combined with an enzymatic reduction reaction to validate the method. Article II focuses on the discovery and characterization of BVMOs, through the bioinformatic analysis of sequence similarity networks (SSNs). An uncharacterized BVMO from Halopolyspora algeriensis (BVMOHalo) was identified after in silico clustering of protein sequences and characterized biochemically (e.g., pH optimum, organic solvent tolerance). Substrate scope elucidation enabled the annotation of BVMOHalo as aliphatic ketone monooxygenase. Expanding from the findings in Article II, Article III features the first genetically encoded biosensor system to monitor BVMO activity. This biosensor implementation accelerated the screening of a focused library of active site mutants of BVMOHalo and the identification of ester forming variants, overcoming the low-throughput analysis of BVMO reaction products by chromatographic methods. Together, the presented articles address key challenges in biocatalysis, ranging from the recycling of co-factors and the identification and evolution of novel enzymes. Article I: Product distribution of steady-state and pulsed electrochemical regeneration of 1,4-NADH and integration with enzymatic reaction Mohammed Ali Saif Al-Shaibani , Thaleia Sakoleva , Luka A. Živković, Harry P. Austin , Mark Dörr , Liane Hilfert , Edgar Haak, Uwe T. Bornscheuer, Tanja Vidaković-Koch, ChemistryOpen, 2024, e202400064 This article describes the direct electrochemical regeneration of NADH on carbon electrodes, modified with carbon nanoparticles sprayed Toray paper. The product distribution under steady-state and dynamic conditions was investigated and proved that the dynamic operation offered a faster mode, yielding the desired 1,4-NADH isomer. In parallel, side products such as different NAD dimers, the enzymatically inactive isomer 1,6-NADH, and the formation of ADP-ribose represent disadvantages of the investigated electrochemical co-factor recycling method. In addition to this, the different nicotinamide side products are enzymatic inhibitors, negatively impacting product yields. Article II: Discovery and characterization of a Baeyer-Villiger monooxygenase using sequence similarity network analysis Thaleia Sakoleva, Harry P. Austin, Chrysoula Tzima, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, ChemBioChem, 2023, e202200746 This article describes the discovery of the novel BVMOHalo by SSN analysis. The sequence was retrieved after protein clustering. The enzyme was successfully expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified. Substrate scope investigation suggested that BVMOHalo prefers linear aliphatic ketones. Optimal reaction conditions were determined in different buffer systems at varying pH, temperatures, and in the presence of commonly used organic co-solvents. Finally, the enzyme remained stable after five days of storage, which is remarkable since BVMOs regularly suffer from short half-lives. Article III: Biosensor-guided engineering of a Baeyer-Villiger monooxygenase for aliphatic ester production Thaleia Sakoleva, Florian Vesenmaier, Lena Koch, Jarne E. Schunke, Kay Novak, Sascha Grobe, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, Thomas Bayer, ChemBioChem, e202400712. This article describes the engineering of the catalytic site of BVMOHalo and the detection of active variants using a bioluminescence-based assay. Aliphatic ketones were converted into the corresponding esters by this BVMO. Subsequently, esters are transformed through an artificial enzyme cascade, consisting of an esterase and an alcohol dehydrogenase (ADH), yielding aldehydes as cascade products. The aldehyde is then substrate for a bacterial luciferase (LuxAB), which emits light through the oxidation of aldehydes to the corresponding carboxylates. This biosensor setup was used to guide the selection of ester-forming variants of BVMOHalo – not only representing the first genetically encoded biosensor system to monitor the product formation in BVMO-catalyzed reactions but offering great potential to accelerate protein and metabolic engineering campaigns in the future.

Bakterielle Pathogene können in ihren Wirten Infektionen auslösen, die gesundheitsgefährdend sind oder sogar zum Tod führen können. Zu diesen Pathogenen zählen auch das Gram-negative Bakterium Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) und die Gram-positiven Bakterien Renibacterium salmoninarum (R. salmoninarum) und Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae). Während R. salmoninarum und A. salmonicida Fischpathogene sind, die in Salmoniden die bakterielle Nierenkrankheit (bacterial kidney disease) (BKD) (R. salmoninarum) bzw. die Fischfurunkulose (A. salmonicida) auslösen können, ist S. pneumoniae ein humaner Pathogen, der den oberen Atemwegstrakt und andere Gewebe kolonisieren und Krankheiten wie Sepsis, Meningitidis und Pneumonie auslösen kann. Gegen alle diese Pathogene existieren Vakzin-Strategien bestehend aus Kapselpolysacchariden oder inaktivierten Bakterien, um einer Infektion und deren Folgen vorzubeugen. Allerdings wirken diese Vakzine oft nur gegen bestimmte Serotypen (S. pneumoniae) oder sind mit hohem Stress und Nebenwirkungen für den Wirt verbunden (A. salmonicida, R. salmoninarum). Aus diesem Grund wird aktiv an alternativen Strategien zur Vakzinierung geforscht. Eine mögliche Route sind bakterielle Membranvesikel (MV), die sich von der bakteriellen Oberfläche Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien abschnüren und viele potenziell immunogene Proteine auf ihrer Oberfläche tragen. In dieser Arbeit wurde das Proteinrepertoire der bakteriellen MV von R. salmoninarum, A. salmonicida und S. pneumoniae mittels Massenspektrometrie untersucht. In der aufgereinigten MV Fraktion von R. salmoninarum wurden die immunsupprimierenden Proteine P57/Msa und P22, die wichtige Virulenzfaktoren von R. salmoninarum sind, in hoher Abundanz detektiert. Weiterhin wurden neues Lipoprotein C/Protein von 60 kDa (NlpC/P60) Hydrolasen und weitere Zellwand-modifizierende Proteine in der MV Fraktion gefunden, was einen Hinweis darauf darstellen könnte, dass diese Proteinklasse eine Relevanz bei der Entstehung von MV in Gram-positiven Bakterien hat. Bei der Untersuchung der MV von A. salmonicida wurde analysiert, inwieweit sich das MV Proteinrepertoire durch Kultivierungsbedingungen beeinflussen lässt. Die MV, die unter Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit aufgereinigt wurden, hatten eine ähnliche Größe und Konzentration im Vergleich zu der Kontrollbedingung. Allerdings wurden zahlreiche Proteine in der MV Fraktion detektiert, die bei geringer Eisenverfügbarkeit signifikant in ihrer Abundanz erhöht waren. Hierzu zählten vor allem TonB-abhängige Eisen- und Siderophoretransporter, aber auch Hemolysin und Lipasen. Eine erhöhte Kultivierungstemperatur resultierte in einer geringeren Vesikelkonzentration verglichen mit der Kontrollbedingung. Allerdings führte die erhöhte Kultivierungstemperatur zu einer signifikant gesteigerten Hemolysin Abundanz. Bei der Kultivierung von A. salmonicida mit dem Antibiotika Florfenicol waren die MV in ihrer Größe deutlich verringert. Weiterhin wurden viele ribosomale Proteine in der MV Fraktion gefunden, was auf bakterielle Lyse hinweisen könnte. Der Vergleich zwischen dem Erntezeitpunkt der MV in der stationären Wachstumsphase und der Sterbephase von S. pneumoniae zeigte, dass Vesikel aus der Sterbephase im Durchschnitt leicht vergrößert und in der Konzentration 10-fach erhöht waren. Zusätzlich war Autolysin in den MV, die in der Sterbephase geerntet wurden, signifikant in der Abundanz erhöht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich das Proteinrepertoire der MV durch Faktoren wie die Wachstumsphase oder Kultivierungsbedingungen drastisch beeinflussen lässt. Es wurden putativ immunogene Proteine (Eisentransporter, Lipoproteine) in den MV aller untersuchten Pathogenen gefunden, was das Potenzial der MV als Vakzin-Plattform zeigt. Besonders eine Kultivierung bei Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit könnte durch die hohe Anzahl an Eisen-regulierten Membranproteinen bei einer Vakzinentwicklung von Vorteil sein.

Krebserkrankungen sind nach Herzerkrankungen die zweithäufigste Todesursache weltweit. Rund 10 Millionen Menschen sterben pro Jahr an Krebserkrankungen und jährlich kommen etwa 19.3 Millionen Krebs-Neuerkrankungen hinzu, wobei die Zahlen weiterhin ansteigen. Trotz innovativer Fortschritte in den Bereichen der diagnostischen Methoden und Kombinationstherapieverfahren hat sich die 5-Jahres-Überlebensrate in den letzten 15 Jahren für einige Tumorentitäten nur unzureichend verbessert. Die hauptsächliche Ursache dafür ist die Entstehung von therapieresistenten Tumoren, die neben dem Therapieversagen zu einem Wiederauftreten des Krebses führen können. Um die Überlebensrate der Patienten zu erhöhen, ist es somit unumgänglich effizientere Therapieansätze zu entwickeln oder bestehende zu optimieren. Physikalisches Gasplasma ist ein medizinisches Tool mit versatilen Eigenschaften und weist unter anderem ein antitumorales Potential auf. Dieses beruht auf der Freisetzung vielfältiger reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS/RNS; Reactive Oxygen Species/Reactive Nitrogen Species) und kann eine Tumorzersetzung durch Induktion von oxidativem Stress initiieren. Durch eine Teil-Ionisation eines Gases mittels Energiezufuhr in Form von starken elektrischen Feldern werden frei bewegliche Elektronen, ionisierte Atome sowie reaktive Spezies generiert, die unterschiedliche biologische Effekte vermitteln können. Neben einer Vielzahl von in vitro und in vivo Untersuchungen suggerieren auch einige klinische Fallstudien tumorinhibierende Effekte von Gasplasmaapplikationen in Krebspatienten. Allerdings konnte lediglich bei einem Teil der Patienten eine Reduktion der Tumorlast erzielt werden. Ein anderer Teil wiederum zeigte nach einer anfänglich sichtbaren Gasplasma-vermittelten Tumorverringerung im Laufe der Zeit ein verstärktes Tumorwachstum (Therapie-Resistenz). Ziel der vorliegenden Arbeit war es 1) Möglichkeiten zur Optimierung der Behandlungseffizienz von medizinischem Gasplasma zu erforschen und 2) potentielle Wege zur Überwindung entstandener Gasplasma-Behandlungsresistenzen in Tumorzellen zu identifizieren. Die Implementation von 3D-gedruckten Gasplasma-Aufsätzen war dabei ein innovativer Ansatz zur Modulation der Gasplasmaeffekte. Nach Testung von zwei neuartigen Aufsätze zur dynamischen Druckreduktion des Gasplasmas konnte abhängig von der Gasflussstärke und des verwendeten Adapters eine gesteigerte Tumorinhibierung verzeichnet werden. Um das Potenzial der Gasplasmaanwendung in der Onkologie weiter zu explorieren und die Auftrittswahrscheinlichkeit von Resistenzen zu verringern, bietet die Kombination mit anderen Tumor-Behandlungsverfahren eine weitere Möglichkeit, die therapeutischen Effekte zu verstärken. Untersuchungen hinsichtlich eines synergistischen Wirkmechanismus einer Kombinationsbehandlung von Gasplasma mit neu synthetisierten small molecules konnten vielversprechende Ergebnisse erzielen. Sowohl in vitro als auch in ovo konnte ein erhöhter tumortoxischer Effekt beobachtet werden, welcher in einem Xenograft-Mausmodell validiert werden konnte. Durch Etablierung und Analyse Gasplasma-resistenter Tumorzellen sollten mögliche Adaptationsmechanismen entschlüsselt und neue therapeutische Ansätze zur Umgehung oder Überwindung von Resistenzen entdeckt werden. Physiologische sowie molekularbiologische Untersuchungen enthüllten, dass Gasplasma-insensitive Tumorzellen vor allem durch Aneignung Stammzell-ähnlicher Eigenschaften sowie oxidativer Adaptation dem repetitiven ROS/RNS Stress unbeschadet entkommen können. Der resistente Tumorzell-Phänotyp konnte durch Transkriptomanalysen mit einer signifikant erhöhten Expression des Interleukin-1 receptor, type 2 (IL1R2) korreliert werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit herausgearbeitet werden, dass der Antitumor-Effekt der Gasplasmabehandlung sich durch ein Anpassen der Plasma-Jet-Geometrie sowie durch Kombinationsansätze mit pharmakologischen Substanzen verbessern lässt. Des Weiteren erlaubte die Entwicklung einer Gasplasma-Resistenzmodels von Hautkrebszellen ein tieferes Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen. Diese Erkenntnisse unterstützen den Ansatz das Potential der Gasplasma-Technologie-Anwendung in der Onkologie durch weitere, zukünftige Untersuchung zu erforschen.