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Martin Müller

• The respiratory epithelium acts as both, a barrier of the respiratory tract to Nipah virus (NiV) entry and at the same time as a significant determinant of virus shedding. Both, for humans and pigs, replication in the respiratory tract epithelia is considered a major factor in transmission to other hosts. To understand why the virus constitutes a high-risk pathogen for livestock and humans, knowledge about viral replication and host responses in relevant cells and tissues is crucial. Most in vitro studies, however, have been performed in conventional cell lines or non-differentiated lung cells. Only a few examples exist where Henipavirus infections have been investigated in fully-differentiated lung epithelial cell models. Thus, one aim of this thesis was to investigate infection, replication, spread and host protein dynamics of NiV in primary bronchial epithelial cells (BEC) cultivated at the air-liquid-interphase (ALI). By immunofluorescence imaging, the NiV infection dynamics in BEC-ALI cultures were monitored over a 12 day time course, in order to provide detailed information about the infection process in the respiratory epithelium of pigs and ferrets. Compared to undifferentiated primary BEC, the specific infectivity of NiV in BEC-ALI cultures was low. Infections remained focal and complete infection of the cultures was not observed, even at 12 dpi. Analysis of viral titers and viral mRNA indicated a limited virion release from the infected ALI-cultures while most of the newly synthesized NiV-RNA remained cell associated. Immunofluorescence analysis of cross sections from infected ALI-cultures revealed large infected areas that exhibited a strong cytopathic effect (CPE). Disruption of the epithelium resulted in apical release of virus antigen-positive cell detritus while ciliated areas and basal cells were less affected. From these data it was concluded, that NiV transmission could be supported by exhalation of cell debris associated NiV and thus may contribute to rapid spread of infection in swine populations. A second aim was to explore the dynamics of host responses to NiV infection in differentiated BEC-ALI culture and to assess whether this differs to conventional cell line data available from literature. Even though strong CPE appeared in later phases of NiV infection, at least the porcine PBEC-ALI cultures remained robust enough to allow protein sampling over 12 days infection course. Subsequent MS-based proteomics enabled unprecedent insight in complex cell culture response upon NiV infection. Previous reports indicated a lack of efficient interferon type I induction in non-differentiated pig or human BEC which were considered a prerequisite for efficient replication in the respiratory epithelium and virusspread. In contrast to non-differentiated pig BEC (PBEC), in PBEC-ALI cultures multiple factors involved in interferon responses were upregulated upon NiV infection. Thereby it was demonstrated that NiV infection induced a robust innate immune response upon infection with elevated components of antigen processing and presentation resulting in the conversion from the constitutive proteasome to the immunoproteasome. In contrast to previous reports about NiV-infected non-differentiated PBEC or endothelial cells, incomplete immunoproteasome formation and limitations in interferon response could be excluded. Thus, a model is proposed in which NiV infection and spread in differentiated PBECs is slowed by potent innate immune responses to the virus infection. Overall, the findings highlight the important role of the respiratory epithelium not only as a physical barrier to virus infections but also indicate itsrole as a primary site of adaptive immune induction through NiV induced antigen processing and MHC I presentation. Finally, to allow functional studies of Henipaviruses at the BSL-2 biosafety level a recombinant CedPV was generated and rescued. An imaging based screening and quantitative analysis pipeline was established to investigate the role of cellular factors and to screen for potential virus and host gene directed inhibitory factors. Accordingly, different host and viral genes were targeted with a siRNA-pool either targeting virus or selected cellular mRNAs followed by the infection with the CedPV and the quantification of infected cells. With proof of concept of the siRNA screening pipeline, the recombinant CedPV clone was used as a backbone to insert variousfluorescence reporter genesin order to optimize the analysis workflow by allowing direct virus quantification in live, unstained samples. Consequently, this thesis provides a valuable proof for future approaches related to the function of virus proteins, influence of host-factors and virusreplication and Henipavirus-inhibitorscreens at low biosafety levels.
• Das respiratorische Epithel fungiert als Barriere des Respirationstrakt gegen das Eindringen von verschiedenen Viren wie dem Nipah Virus (NiV). Zusätzlich spielt es eine tragende Rolle bei der Virusausscheidung. Sowohl in Menschen als auch in Schweinen ist die Replikation in den Atemwegsepithelien essentiell für die Übertragung auf andere Wirte. Um zu verstehen wieso das Virus einen Hochrisikoerreger für Nutztiere und Menschen darstellt, ist Wissen über die Virus Replikation und Wirtsreaktion in relevanten Zellen und Geweben von entscheidender Bedeutung. Die meisten In-vitro-Studien, wurden jedoch in herkömmlichen Zelllinien oder nicht differenzierten Lungenzellen durchgeführt. Nur wenige Beispiele existieren, in denen Henipaviren in vollständig differenzierten Lungen Epithelzellmodellen untersucht wurden. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, Infektion, Replikation, Ausbreitung und Wirtsproteindynamik in NiV infizierten primären Bronchialepithelzellen (BEC), die an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI) kultiviert wurden, zu untersuchen. Die NiV Infektionsdynamik wurde mittels Immunfluoreszenz über zwölf Tage visualisiert um einen detaillierten Einblick des Infektionsprozesses im respiratorischen Epithel von Schweinen und Frettchen zu erlangen. Im Vergleich zu undifferenzierten primären BEC war die Infektiosität der BEC-ALI Kulturen gering. Die Infektion war Fokal und eine vollständige Infektion der Zellkultur wurde nicht beobachtet. Analyse von viralen Titern deuten auf eine limitierte Virus Freisetzung an der apikalen Oberfläche der Zellkulturen hin. Eine mit der Zeit ansteigende Menge an viraler mRNA, welche durch qPCR nachgewiesen wurde, gibt Hinweise darauf, dass neu synthetisierte NiV-RNA Zell assoziiert bleibt. Immunfluoreszenz Färbungen von Querschnitten zeigten, dass Infektion der Kulturen mit großflächig infizierten Bereichen, mit starkem zytopathischen Effekt (CPE) einhergehen. Zerstörung des Epithels führte zur apikalen Freisetzung von Virusantigen positiven Zelldetritus, während zilierte Zellen und Basalzellen weniger betroffen waren. Daraus wurde geschlossen, dass die Verbreitung des NiV durch das Ausatmen von NiV assoziiertem Zelldetritus vermutlich maßgeblich zur schnellen Ausbreitung der Infektion in Schweine Populationen beiträgt. Ein weiteres Ziel bestand darin, die Dynamik der Wirtsreaktion auf eine NiV Infektion in differenzierten BEC-ALI Kulturen zu untersuchen und diese mit publizierten Daten aus herkömmlichen Zellen zu vergleichen. Obwohl in späteren Phasen der NiV-Infektion ein starker CPE auftrat, blieben die Schweine PBEC-ALI Kulturen robust genug, um eine Proteinprobenahme über einen 12-tägigen Infektionsverlauf hinweg zu ermöglichen. Nachfolgende MS-basierte Proteomik ermöglichte beispiellose Einblicke in die komplexe Reaktion von Zellkulturen auf eine NiV-Infektion. Frühere Berichte deuteten auf einen Mangel an wirksamer Interferon-Typ-I-Induktion bei nicht differenzierten Schweine und Humanen BEC hin. Dies wurde als Voraussetzung für eine effiziente Replikation und Virusausbreitung im respiratorischen Epithel angesehen. Im Gegensatz zu nicht-differenzierten Schweine BEC (PBEC) wurden in PBEC-ALI-Kulturen mehrere Faktoren die an der Interferonantwort beteiligt sind, nach einer NiV-Infektion hochreguliert. Dadurch wurde gezeigt dass NiV-Infektionen eine robuste angeborene Immunantwort mit erhöhten Komponenten der Antigenverarbeitung und -präsentation induziert, was zu einer Umwandlung des konstitutiven Proteasoms zum Immunoproteasom führt. Im Gegensatz zu früheren Berichten über NiV-infizierte nicht-differenzierte PBEC oder Endothelzellen konnte eine unvollständige Bildung des Immunoproteasoms und Einschränkungen der Interferon Antwort ausgeschlossen werden. Daher wird ein Modell vorgeschlagen, bei dem die Infektion und Ausbreitung von NiV in differenzierten PBECs durch eine starke angeborene Immunreaktionen auf die Virusinfektion verlangsamt wird. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse die wichtige Rolle des respiratorischen Epithels nicht nur als physische Barriere gegen Virusinfektionen, sondern weisen auch auf seine Rolle als primärer Ort der adaptiven Immuninduktion durch NiV-induzierte Antigenverarbeitung und MHC I-Präsentation hin. Um schließlich funktionelle Studien von Henipaviren auf der BSL-2-Biosicherheitsstufe zu ermöglichen, wurde ein rekombinantes Cedar Virus (CedPV) erzeugt und erfolgreich in Zellkultur generiert. Es wurde ein bildgebungsbasiertes Screening und quantitative Analysepipeline etabliert, um die Rolle zellulärer Faktoren zu untersuchen und nach potenziell Virus hemmenden Faktoren zu screenen. Dazu wurden verschiedene Wirts- und Virusgene mit einem siRNA-Pool gegen das Virus oder ausgewählter zelluläre mRNAs gerichtet, gefolgt von der Infektion mit dem CedPV und der Quantifizierung der infizierten Zellen. Nachdem Funktionsnachweis der siRNA-Screening-Pipeline wurde der rekombinante CedPV-Klon verwendet, um verschiedene Fluoreszenzreportergene einzufügen und so den Analyse-Workflow zu optimieren, indem eine direkte Quantifizierung des Virus in lebenden, ungefärbten Proben ermöglicht wird. Folglich, liefert diese Arbeit eine wertvolle Basis für zukünftige Ansätze in Bezug auf die Funktion von Virusproteinen, Einfluss von Wirtsfaktoren auf die Virusreplikation und Henipavirus Inhibitor Screens in niedrigen Biosicherheitsstufen.