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Henrik Rogge

• Fehlfunktionen oder der Verlust von Podozyten führen zu Glomerulopathien, welche in ca. 90 % der Fälle die Ursache für eine Niereninsuffizienz ist. Der Verlust resultiert aus einer fehlerhaften Haftung an der glomerulären Basalmembran unter anderem durch eine erhöhten mechanischen Beanspruchung, zum Beispiel bei erhöhtem Blutdruck. Die Erforschung des Zusammenspieles aus dem Aktin-Zytoskelett und den Fokaladhäsionen verspricht hier einen Erkenntnisgewinn über die Mechanismen der Adhäsion und der Resistenz gegen äußere Kräfte. Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubt eine detailreiche Abbildung dieser Strukturen. Die anschließende Beschreibung oder Quantifizierung ist allerdings aufgrund der ungeordneten und statistisch verteilten Formen und Anordnungen der Filamente und Fokaladhäsionen erschwert. Moderne computergestützte Bildauswertungsmethoden stellen hier eine Ausweg dar, weil sie eine große Anzahl von Zellen mit einer beliebigen Detailgenauigkeit nach festen Regeln untersuchen können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Testung von solchen Methoden zur quantitativen Bildauswertung für die Merkmalsextraktion von Fokaladhäsionen, des Aktin-Zytoskelettes und der Zellform bei Podozyten. Damit einzelne Zellen verglichen werden können, müssen die Zellgrenzen erkannt werden. Dies ist erschwert durch sich überlappende Zellen und die selektive Bildinformation von Fluoreszenz-Bildern. Es konnten zwei Methoden etabliert werden. Eine hat einen hohen Automatisierungsrad, basiert auf Voronoi-Diagrammen und ist geeignet zur Auswertung von vielen Zellen. Die andere ist semi-automatisiert und erreicht eine hohe Genauigkeit beim Erkennen der Zellgrenzen. Hiernach werden die Zellen durch Bestimmung gängiger Formfaktoren charakterisiert und insbesondere Filopodien in ihrer Anzahl und Größe analysiert. Der Algorithmus zur Analyse des Aktin-Zytoskelettes fußt auf einer neuen iterativen Programmstruktur. Diese ermöglicht das Beobachten von pathologischen Veränderungen des Aktin-Zytoskelettes ohne die Parameter neu zu justieren. Es wird der vollständige Datensatz aus Länge, Breite und Orientierung der beliebig gekrümmten Aktin-Fasern extrahiert. Das präsentierte Programm zur Auswertung der Fokaladhäsionen wurde für eine hohe Sensitivität und Spezifität optimiert. Es werden die wichtigen Merkmale Anzahl, Fläche und Orientierung für alle Fokaladhäsionen bestimmt. Die Orientierung der Fokaladhäsionen wird erstmals sehr robust durch die Bestimmung des Gradientenfeldes der Fluoreszenz-Intensität berechnet. Die Programme wurden mit Matlab implementiert und jeweils mit einer eigenständigen Programmoberfläche ausgestattet. Außerdem wurde auf eine intuitive Bedienbarkeit und Anwenderfreundlichkeit geachtet. Eine erste Anwendung fanden die etablierten Methoden bei der Erforschung der Bedeutung von Palladin und Fascin-1 auf das Zytoskelett. Bei Palladin-Knockdown-Podozyten konnte eine Abnahme der Aktinfilamente und eine höhere Vulnerabilität auf Toxine gefunden werden. Ein Fascin-1-Knockdown bewirkt eine Abnahme der Fokaladhäsionen in ihrer Anzahl und Fläche. Weitere Auswirkungen von intrinsischen oder extrinsischen Veränderungen auf das Zytoskelett und die Zellform können mit den hier etablierten Methoden in Zukunft untersucht werden. Tiefere Einblicke in die Funktionsweise des Zytoskelettes sind auch durch die Korrelation dieser neu zugänglichen Merkmale untereinander und ggf. durch ein Abgleich mit Modellen zur Simulation der Dynamik des Aktin-Zytoskelettes erwartbar.
• The detachment of podocytes from the glomerular basement membrane leads to glomerulopathies. Loss can be induced by increased mechanical stress such as hypertension or by a failed interaction of the actin cytoskeleton, focal adhesions and the basement membrane. Research into the actin cytoskeleton and the focal adhesions therefore promises to provide insights into the mechanisms of renal failure. Fluorescence microscopy shows detailed images of these structures. However, subsequent description and quantification is difficult due to unordered distributed arrangements and structures of the filaments and focal adhesion. The aim of this thesis is the development and testing of automated image analysis methods for feature extraction of focal adhesions, the actin cytoskeleton and the cell shape of podocytes.