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Die chronische Herzinsuffizienz (CHF) stellt eine der häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität in Deutschland dar und führt mit Gesundheitskosten von knapp 7,5 Milliarden Euro pro Jahr zu einem wachsenden sozio-ökonomischen Problem. Dabei wird die CHF mit einer medikamentösen Standardtherapie nach Leitlinien der ESC behandelt, mit dem Ziel den Progress zu verlangsamen. Darüber hinaus werden Lebensstiländerungen empfohlen, wobei insbesondere körperliches Training Gegenstand intensiver Forschung ist. Tiermodell-basierte Studien konnten hierdurch eine signifikante Verbesserung der kardialen Funktion bei CHF hervorrufen. In diesen Zusammenhang wird auch der Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) gebracht: das Neurotrophin wird bei körperlicher Aktivität u.a. durch Neuronen der Skelettmuskulatur ausgeschüttet, aber auch kardial exprimiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass ein niedriger BDNF-Serumspiegel bei CHF Patient:innen mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht, wie sich körperliches Training und die Applikation von BDNF auf kardiale Parameter und auf molekulare Mechanismen bei CHF auswirken. Als Herzinsuffizienzmodell wurden αMHC-Gαq-Mäuse genutzt. Im Alter von 5 Wochen wurde die kardiale Funktion mittels Echokardiographie evaluiert (Baseline-Untersuchung) und über 7 Wochen wöchentlich verlaufskontrolliert. Entsprechend der Gruppenzugehörigkeit erhielten die Tiere über den Versuchszeitraum entweder ein Laufrad zur freiwilligen körperlichen Aktivität oder eine wöchentliche intraperitoneale BDNF-Injektion oder eine Kombination beider Interventionen. Als Kontrolle dienten unbehandelte αMHC-Gαq-Mäuse. Nach 7 Wochen wurde den Mäusen Blut, das Herz sowie Skelettmuskulatur entnommen. Mittels ELISA, Nanostring®, einer Proteom-Analyse und Western-Blot wurden Herzinsuffizienzmarker im Serum, Expressionsänderungen im linksventrikulären Myokard, Unterschiede im kardialen Proteom und in der mitochondrialen Proteinexpression der Skelettmuskeln untersucht. Unter dem Einfluss von körperlichem Training konnte echokardiographisch eine signifikant verschlechterte systolische sowie diastolische Funktion im Vergleich zur unbehandelten transgenen Kontrollgruppe festgestellt werden. Dies ging einher mit einer kardialen Expressionssteigerung von Remodeling-, Hypertrophie und Apoptose-assoziierten Gene. Im kardialen Proteom konnte darüber hinaus trotz körperlichem Training keine Änderung in der Abundanz von Proteinen der mitochondrialen Funktion festgestellt werden. Hinsichtlich des Energiemetabolismus zeigten sich hingegen Proteine der Glykolyse und der Fettsäureoxidation in ihrer Abundanz erhöht. Durch die Applikation von BDNF zusätzlich zu körperlichem Training zeigten sich die oben beschriebenen Effekte weniger stark ausgeprägt. Die alleinige Applikation von BDNF hingegen konnte keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zur transgenen Kontrollgruppe hervorrufen. Zusammenfassend lässt sich somit ein negativer Effekt von körperlichem Training auf den Krankheitsverlauf herzinsuffizienter αMHC-Gαq-Mäuse feststellen. Durch die Applikation von BDNF zusätzlich zu körperlichem Training konnten die negativen Effekte in αMHC-Gαq-Mäuse abgeschwächt werden, sodass BDNF hier möglicherweise kardioprotektive Mechanismen fördert. Über welchen Mechanismus körperliches Training zu einem Progress der Herzinsuffizienz in αMHC-Gαq-Mäuse beiträgt und inwieweit BDNF in diesen regulatorisch eingreift, muss mittels weiterer Untersuchungen geklärt werden.

Obwohl die Aufnahme von Wirkstoffen aus dem Darm ein hochvariabler Prozess mit vielen Einflussfaktoren ist, ist die orale Arzneimittelgabe die bevorzugte Applikationsroute für Medikamente. Intestinale Metabolisierungsenzyme und Transportproteine stellen Faktoren dar, die die Absorption deutlich beeinflussen können. Obwohl bereits viel über ihre Funktion, Regulation und Lage im Darm bekannt ist, fehlen Daten über die interindividuelle Expression. Ziel dieser Arbeit war, diese im Hinblick auf die demographischen Faktoren biologisches Geschlecht, Alter und das Vorliegen der Volkskrankheit Diabetes mellitus Typ 2 hin zu charakterisieren und gegebenenfalls Schlüsse auf Implikationen für die Arzneimitteltherapie zu ziehen. Dafür wurde intraoperativ gewonnenes kryokonserviertes Jejunumgewebe verwendet und Vergleichsgruppen (Geschlecht, Alter, Typ-2-Diabetiker) anhand der zugehörigen Datenbank gebildet. Die Expression relevanter Arzneimitteltransporter und Metabolisierungsenzyme wurde auf mRNA-Ebene bestimmt, die Expression ausgewählter Arzneimitteltransporter auch auf Protein-Ebene. Der relative mRNA-Gehalt wurde mittels reverser Transkription und quantitativer PCR bestimmt. Für die Protein-Messung wurde das gesamte Gewebeprotein filterbasiert extrahiert, mittels Trypsin gespalten und anschließend die erhaltenen transporterspezifischen Peptide mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie nach etablierter Methode quantifiziert (targeted proteomics). Die Ergebnisse bewegen sich in der Größenordnung anderer Arbeiten ähnlicher Methodik. mRNA und Protein korrelierten, wie in der Literatur beschrieben, kaum. Obwohl die Untersuchung bei relativ kleiner Probenzahl der Vergleichsgruppen underpowered ist, fanden sich einige signifikante Ergebnisse zwischen den Geschlechtern sowie den Typ-2-Diabetikern und der Kontrollgruppe. Hervorzuheben ist die deutlich niedrigere mRNA-Expression des Metformin-Transporters SLC29A4 bei Diabetikern. Auf Proteinebene zeigten Typ-2-Diabetiker eine ca. 20% niedrigere Expression von PEPT1 als Nicht-Diabetiker. Frauen exprimierten P-gp ca. 20% höher. In der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein signifikanter Einfluss des Alters und lediglich ein limitierter Einfluss der Faktoren Geschlecht und Typ-2-Diabetes auf das Expressionsprofil der untersuchten Arzneimitteltransporter und -enzyme, vor allem auf Protein-Ebene. Eine pharmakokinetische Relevanz dieser Faktoren durch Beeinflussung der Expression von Transportproteinen und Metabolisierungsenzymen für die orale Arzneimitteltherapie bleibt somit fraglich.

Skeletal muscle is a dynamic tissue with high plasticity which maintains its functionality by regulating the balance between protein degradation and protein synthesis. In response to injury and other pathological conditions like inflammation and sepsis, a loss in muscle mass (muscle atrophy) and function (metabolic homeostasis, contractility) occurs. Critically ill septic patients often develop intensive care unit-acquired weakness (ICUAW), characterized by muscle weakness and atrophy as well as insulin resistance. Sepsis and inflammation are major risk factors for ICUAW. However, the pathogenesis of this syndrome is poorly understood but a disturbed glucose homeostasis and an enhanced inflammation are implicated. Previous RNA sequencing and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses of RNAs isolated from human M. vastus lateralis of critically ill patients and muscles from septic mice revealed an increased expression of the protein tyrosine phosphatases protein tyrosine phosphatase 1 B (PTP1B/PTPN1) and t-cell protein tyrosine phosphatase (TCPTP/PTPN2). In parallel a decreased expression of insulin receptor substrate (IRS) 1 and reduced insulin receptor (INSR) phosphorylation indicative for insulin resistance was observed. Because PTP1B and TCPTP are nodal enzymes in insulin and cytokine signaling in skeletal muscle and immune cells these data suggested their involvement in inflammation-mediated insulin resistance and skeletal muscle atrophy. I hypothesized that PTP1B and TCPTP are major regulators of insulin signaling and inflammation via dephosphorylation of cytokine receptor associated proteins in skeletal muscle. To investigate the mechanism responsible for Ptpn1 and Ptpn2 upregulation during inflammation I treated C2C12 myocytes with the inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6). IL-6 increased the expression of Ptpn1 and Ptpn2. Using small interfering RNA (siRNA) and chemical inhibitors, I found that this effect was mediated by the transmembrane IL-6 receptor glycoprotein 130 (Gp130) and the downstream kinases Janus kinase 2 (JAK2) and Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). IL-6 facilitates its pro- and anti-inflammatory effects through the transcription factor STAT3, which gets tyrosine phosphorylated, translocates into the nucleus and modulates the expression of IL-6 responsive genes, such as suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3). Overexpression of PTP1B and TCPTP attenuated IL-6 mediated STAT3 tyrosine phosphorylation and Socs3 gene expression. Overexpression of PTP1B but not TCPTP inhibited insulin mediated phosphorylation of the insulin receptor beta chain and its downstream targets IRS1, Akt (protein kinase B), and Akt substrate of 160 kDa (AS160) in C2C12 myocytes. To investigate the role of PTP1B and TCPTP in skeletal muscle in vivo, I generated male and female mice devoid of Ptpn1 (Ptpn1 cKO), Ptpn2 (Ptpn2 cKO) and Ptpn1+Ptpn2 (DKO) in myocytes. I subjected these mice to polymicrobial sepsis for 24 hours or 96 hours employing cecal ligation and puncture surgery (CLP). Sham treated male and female KO and wildtype (WT) mice served as controls. Septic DKO mice showed a higher mortality compared to their sham operated littermates and septic WT mice. Morphological and histological analyses showed a higher muscle mass loss and more muscle atrophy, tissue leucocyte infiltration and leucocyte marker gene expression in muscle of septic DKO mice. This was accompanied by an increased pro-inflammatory cytokine signature with increased amounts of interleukin 1 beta (IL-1β/Il1b), tumor necrosis factor alpha (TNFα/Tnfa), interferon gamma (IFNγ/Ifng) and IL-6/Il6 in skeletal muscle and serum of septic DKO mice. Chemokines that are chemo attractants for immune cells, like C-C-motif ligand 2 and 5 (Ccl2, Ccl5) and C-X-C motif ligands 9 and 10 (Cxcl9, Cxcl10) were upregulated on gene expression level in muscle tissue as well as in serum of septic DKO mice compared to septic WT mice. Additionally, I observed an increased NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) -inflammasome activation in muscle of septic DKO mice. Inflammasomes are multiprotein complexes which facilitate innate immune responses after infection by activation of caspases which cleave and mediate the release pro-inflammatory cytokines like IL-1β and interleukin 18 (IL-18). In addition, using global proteomics analyses I observed a significantly dysregulated interferon γ (IFNγ) response in TA muscle of septic DKO mice shown by increased IFN stimulated gene (ISG) expression, increased abundancy of interferon regulatory factor 1 (IRF1) transcription factor as well as increased IFN-dependent chemokine expression. Utilizing murine myocytes in vitro and treating them with IFNγ, I reproduced the phenotype seen in mice. These data are indicative for a myocyte specific phenotype. I could also activate the NLRP3 inflammasome in primary myocytes from mice that were differentiated into myotubes. In these cells I show that the release of IL-1β and GSDMD is dependent on PTP1B and TCPTP; further validating the results seen in TA muscle of septic mice. In summary, deficiency of PTP1B and TCPTP caused a hyperinflammatory systemic and skeletal muscle phenotype which was caused by a dysregulated IFNγ and NLRP3 inflammasome response to infection. Furthermore, it pronounces the role of skeletal muscle as a highly immunomodulatory organ, which is crucial in maintaining whole body proteo- and homeostasis. Therefore, inhibition of PTPs should be carefully evaluated in a clinical setting.

Die Sepsis ist die Ursache für einen Todesfall aus zwei bis drei Todesfällen im klinischen Bereich [50]. In dieser Dissertation werden Patienten mit einer schweren Sepsis, welche nach der verwendeten Definition aus dem Jahr 1992 mindestens zwei SIRS-Kriterien erfüllen sowie zusätzlich eine Organdysfunktion oder eine Hypotension oder eine Hypoperfusion aufweisen, und Patienten mit einem septischen Schock, welche eine Sepsis induzierte Hypotension aufweisen, die trotz adäquater Volumentherapie vasopressorenpflichtig ist [3], mit zwei unterschiedlichen Blutkultur - Diagnostikverfahren untersucht. Der Goldstandard für die Diagnostik der Sepsis ist die Blutkulturdiagnostik [9]. Um eine schnellere Diagnostik und damit eine schnellere adäquate Therapie zu erzielen, wird vermehrt der molekulargenetische Ansatz eingesetzt und speziell im Rahmen meiner Dissertation das Prinzip der Fluoreszenz–in–situ–Hybridisierung untersucht [17, 18]. Ziel ist es gewesen, die vermeintliche Schnelligkeit des verwendeten Accelerate PhenoTM Systems bei der Identifizierung der sepsisinduzierenden Mikroben statistisch zu belegen, sowie einen möglichen Vorteil in der Adäquatheit der antiinfektiven Therapie für die Patienten nachzuweisen. Nach unserer Kenntnis sind in der vorliegenden BEMIDIA Studie erstmals die Blutkultur- Schnelldiagnostik in einem 24 / 7 Dienstsystem unter den Bedingungen der klinischen Routine auf einer Intensivstation untersucht worden. Somit konnten erstmals die tatsächlichen klinischen Vorteile einer Schnelldiagnostik für Blutkulturen analysiert werden. Die Ergebnisse meiner Dissertation zeigen, dass die Patienten, welche eine Blutkulturdiagnostik durch die mikrobiologische Schnelldiagnostik mittels des Accelerate PhenoTM Systems erhalten haben, neben einer früheren ID time und AST time, tendenziell auch eine frühere Therapieänderung erhalten haben, im Gegensatz zu den Patienten, deren Blutkulturen nur mit dem Standardverfahren in der medizinischen Mikrobiologie untersucht worden sind, und jene Patienten, bei denen die Blutkultur negativ geblieben ist. Außerdem erhalten insgesamt ein größerer prozentualer Anteil an Patienten, welche eine Blutkulturdiagnostik mittels des Accelerate PhenoTM Systems erhalten haben, eine Änderung in eine adäquate Therapie als die Patienten, deren Blutkulturen nicht im Accelerate PhenoTM System untersucht worden sind.Gerade die hier sichtbar werdenden Vorteile für Patienten aufgrund einer Blutkulturschnelldiagnostik, die 24 Stunden am Tag durchgeführt werden kann, erfordern weitere Forschungen. Außerdem sind jedoch weitere Studien mit größeren Patientenzahlen und zusätzlicher Analyse von geschlechts-, alters- und vorerkrankungsspezifischen Untergruppen nötig, um die statische Aussagekraft der Daten dieser Dissertation zu untermauern und die Vorteile des Accelerate PhenoTM Systems stärker zu verdeutlichen.

Mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (KM-MSC) stellen die Grundlage zahlreicher regenerativer und immunmodulatorischer Therapien dar. Das während einer periazetabulären Osteotomie (PAO) routinemäßig verworfene Knochenmark wurde bisher nicht als potenzielle Quelle für KM-MSC von zumeist jungen, gesunden Patienten erkannt. Ziel der dieser Arbeit zugrunde liegenden Publikation war es, dieses Potenzial zu evaluieren und isolierte KM-MSC mit jenen isoliert aus dem bei der Implantation einer Hüft-Total-Endoprothese (H-TEP) anfallendem Knochenmark grundlegend hinsichtlich zellulärer Eigenschaften und Funktionalität zu vergleichen. Während der PAO (n = 31) und der Implantation einer H-TEP (n = 11) verworfenes Knochenmark wurde für die Isolation von KM-MSC mittels Dichtegradientenzentrifugation verwendet. In der grundlegenden Charakterisierung der KM-MSC von PAO- und H-TEP-Patienten wurden die Zellviabilität, Zellproliferation, Zellseneszenz, Anzahl an koloniebildenden Einheiten, Expression von Oberflächenmarkern sowie das Differenzierungspotenzial und die Sekretion wichtiger Proteine bestimmt und verglichen. PAO-Patienten waren signifikant jünger als H-TEP-Patienten. Das bei PAO gewonnene Gewebe enthielt signifikant weniger Knochenmark. Für die erfolgreiche Isolation von KM-MSC war eine Mindestmenge von 0.24 g Knochenmark erforderlich. Die isolierten Zellen wiesen ein für MSC charakteristisches Expressionsmuster der Oberflächenantigene auf. KM-MSC von PAO-Patienten zeigten eine signifikant höhere Proliferation. Im Hinblick auf das osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierungspotenzial wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Nach osteogenem Stimulus sekretierten KM-MSC von PAO-Patienten signifikant mehr TGF-ß1, TIMP-2 und VEGF. Knochenmark von PAO-Patienten konnte erfolgreich als neuartige Zellquelle für KM-MSC von jungen Spendern etabliert werden. Als limitierend zeigte sich die je Probe enthaltene Menge an Knochenmark verbunden mit einer daraus resultierenden geringeren initialen Zellausbeute. Die im Vergleich zu KM-MSC von H-TEP-Patienten erhöhte Proliferation und Sekretion von pro-chondrogenen und pro-angiogenen Faktoren der KM-MSC von PAO-Patienten deutet allerdings auf ein hohes Potenzial hinsichtlich zukünftiger Therapieansätze hin. Da die durchgeführten grundlegenden Analysen nur einen ersten Schritt im Translationsprozess zur therapeutischen Nutzbarkeit darstellen, sind weitere Untersuchungen im Sinne von multizellulären in-vitro-Modellen und in-vivo-Test erforderlich, um die klinische Anwendbarkeit der Zellen evaluieren zu können.