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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002144-2

Charakterisierung des Alkalischen Schock Proteins Asp23 in Staphylococcus aureus

  • Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
  • The alkaline shock protein 23 (Asp23) of Staphylococcus aureus is the eponymous member of the Asp23 (DUF322) protein family. Proteins with Asp23 domains are highly conserved in Gram-positive bacteria but their exact function remains unknown so far. With about 25,000 molecules per cell, Asp23 is one of the most abundant proteins in S. aureus. Asp23 has been characterized as a protein that, following an alkaline shock, accumulates in the soluble protein fraction. Transcription of the asp23 gene is exclusively regulated by the alternative sigma factor σB, which controls the response of the bacterium to environmental stress. Fluorescence microscopy experiments revealed that Asp23 co-localized with the cell membrane of S. aureus. Since Asp23 has no recognizable transmembrane spanning domains, a search for proteins that link Asp23 to the cell membrane was initiated. SAOUHSC_02443 was identified as the Asp23 membrane anchor and renamed AmaP (Asp23 membrane anchoring protein). In vitro Asp23 forms corkscrew-like filaments which were visualized by electron microscopy. Using a combination of BACTH experiments, fluorescence and electron microscopy, it was investigated which parts of the Asp23 protein are important for the ability to form filaments in vitro and for the interaction with its membrane anchor AmaP. To this end, single amino acid exchanges in Asp23 and constructs representing the individual Asp23 domains (Asp23 domain, N- and C-terminus) or combinations thereof were created. It could be shown, that Asp23 had to consist of at least the Asp23 core domain linked to the C-terminus, to exhibit a clear self-interaction. Moreover, single amino acid exchanges were identified which led to an impairment of filament formation in vitro. A particularly clear effect was observed for the Asp23 K51A amino acid substitution. This amino acid exchange also had an impact on the localization of Asp23 in S. aureus cells as shown by fluorescence microscopy providing a first hint, that filaments may also form in vivo. A transcriptome analysis of an asp23 deletion mutant identified 16 genes to be induced. These genes showed an overlap with genes controlled by the VraRS-two-component-system and the vancomycin stimulon suggesting that the function of Asp23 might be linked to the cell envelope.

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Metadaten
Author: Marret Müller
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002144-2
Title Additional (English):Characterization of the alkaline shock protein Asp23 in Staphylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. Ulrich Dobrindt, Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/02/05
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/01/28
Release Date:2015/02/05
Tag:AmaP, Asp23, DUF322, Fluoreszenzmikroskopie
GND Keyword:Plasmamembran, Staphylococcus aureus, Zellwand
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie