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Virginia Friedrichs

• The order of bats (Chiroptera) account for ~20% of all mammalian species and attracted immense global attention due to their identification as important viral reservoir. Bats can harbour a plethora of high-impact zoonotic viruses, such as filoviruses, lyssaviruses, and coronaviruses without displaying clinical signs of disease themselves. Given this striking diversity of the bat virome, their ability of self-powered flight, and global distribution, understanding chiropteran immunity is essential to facilitate assessment of future spillover events and risks. However, scarcity of bat-specific or cross-reactive tools and standardized model systems impede progress until today. Furthermore, the richness of species led to generation of isolated datasets, hampering data interpretation and identification of general immune mechanisms, applicable for various chiropteran suborders/families. The key to unlocking bat immunity are coordinated research approaches that comprehensively define immunity in several species. In this work, an in-depth study of innate and adaptive immune mechanisms in the fructivorous Egyptian Rousette bat (Rousettus aegyptiacus, ERB) is presented. Detailed stability analyses identified EEF1A1 as superior reference gene to ACTB, and GAPDH, which rendered unstable upon temperature increase or presence of type-I-IFN. Since the body core temperatures of pteropid bats reach from 35°C to 41°C and it has been postulated that bats display constitutive expression of IFNs, a suitable reference gene has to be stable under these physiologically relevant conditions. To study cellular innate immunity in detail, cell lines from the nasal epithelium, the olfactory compartment and the cerebrum were generated. To include immune responses of epithelia cells, essential for immunity at sites of primary viral infection, primary epithelia cells from the nasal epithelium, trachea, lung and small intestine were generated. Cellular identities were determined by comprehensive analyses of transcripts and proteins expressed by each cell line. The capacity of each cell line to produce type-I- and III-IFNs was assessed at 37°C and 40°C upon stimulation with viral mimetics. This revealed cell type-dependent differences is the capability to express IFNs upon stimulation. Furthermore, the constitutive expression of type-I- and III-IFNs was significantly elevated in higher temperatures and quantified at mRNA copy levels. To characterize ERB innate immunity upon infection with high-impact zoonotic viruses, cells from the nasal epithelium, the olfactory system, and the brain were infected with several lyssaviruses. This revealed striking differences in susceptibility: cells from the nasal epithelium rendered least whereas cells from the olfactory epithelium rendered most susceptible to viral infection and replication. Additionally, due to a lack of IFN expression in infected cells, it could be shown that LBV possibly possesses advanced strategies to ensure successful replication in ERB cells. Since the current SARS-CoV-2 pandemic put bats even further in the focus of zoonotic research, primary epithelial cells and animals were infected with this virus to monitor ERB-specific immune transcripts in cells and tissues. These studies revealed a notably early IFNG expression in the respiratory tract of infected individuals. To understand immunomaturation in bats, the immune cell landscape in periphery and various tissue in adult and juvenile ERB was analyzed by flow cytometry and scRNA-seq, revealing intriguing, age-dependent variations in the abundance of granulocytes and lymphocytes. Flow cytometry revealed a significantly higher number of granulocytes in adults, as well as higher numbers of B cells in juveniles. scRNA-seq allowed detailed identification of different leukocyte subsets, uncovering the presence of highly-abundant NKT-like cells and a unique PLAC8 expressing B cell population. A functional characterization of phagocytic cells and lymphocytes derived from adult and juvenile ERB revealed no significant differences in cellular functionality. In conclusion, the presented work demonstrated suitability of all established ERB cell lines to study bat immunity in vitro, which led to striking findings regarding IFN expression at steady state, or upon stimulation or viral infection. In addition, established qRT-PCR protocols allowed definition of constitutive and temperature-dependent elevation of IFN expression magnitudes, as well as insights into expression of immune-related transcripts in SARS-CoV-2 infected ERB. Finally, based on optimized scRNA-seq technologies and flow cytometry, frequencies and absolute cell counts could be determined in ERB of different ages, revealing e.g. age-dependent variations in leukocyte profile compositions.
• Die Ordnung der Fledertiere (Chiroptera) macht etwa 20% aller Säugetierarten aus und zieht wegen ihres einzigartigen Viroms weltweit großes Interesse auf sich. Fledertiere können, unter Ausprägung geringer oder keiner Krankheitsanzeichen, eine Vielzahl von hochpathogenen zoonotischen Viren wie Filo , Lyssa und Coronaviren beherbergen. Angesichts der Virom-Vielfalt, ihrer Fähigkeit zum autonomen Flug und ihrer globalen Verbreitung ist das Verständnis der Immunität von Fledertieren von entscheidender Bedeutung, um die Einschätzung künftiger Spillover-Ereignisse und Risiken zu optimieren. Der Mangel an Fledertier-spezifischem oder kreuzreaktivem Material und standardisierten Modellsystemen erschwert dies jedoch bis heute. Darüber hinaus hat die schiere Anzahl der Arten zu isolierten Datensätzen geführt, was Interpretation und Identifizierung allgemeiner und artspezifischer Immunmechanismen erschwert. Um die Immunität der Fledertiere gezielt zu adressieren, benötigt es koordinierte Forschungsansätze zur möglichst umfassenden Untersuchung vieler Arten. In dieser Arbeit wird eine eingehende Untersuchung der angeborenen und adaptiven Immunmechanismen des Nilflughundes (Rousettus aegyptiacus, Egyptian Rousette bat [ERB]) vorgestellt. Detaillierte Stabilitätsanalysen identifizierten EEF1A1 als überlegenes Referenzgen gegenüber ACTB und GAPDH, deren Expression bei Temperaturerhöhung oder Anwesenheit von Typ-I-Interferon (IFN) instabil ist. Die Expression eines Referenzgens muss auch unter diesen für Fledertiere physiologischen Bedingungen stabil sein. Zur Untersuchung der molekularen angeborenen Immunität, wurden Zelllinien aus dem Nasenepithel, dem Riech-system und dem Großhirn generiert. Um die Immunreaktionen von primären Epithelzellen einzubeziehen, die für Immunität an Orten der initialen Virusinfektion entscheidend sind, wurden Zellen aus Nasenepithel, Trachea, Lunge und Dünndarm generiert. Die Zellidentitäten wurden mit umfassenden Analysen der von jeder Zelllinie exprimierten Transkripte und Proteine bestimmt. Die Fähigkeit jeder Zelllinie, Typ I- und III-IFN zu produzieren, wurde bei 37°C und 40°C nach Stimulation mit viralen Mimetika untersucht. Dabei zeigten sich zelltypabhängige Unterschiede in der Fähigkeit, IFN zu exprimieren. Darüber hinaus war die konstitutive Expression von Typ-I- und III-IFN bei 40°C erhöht. Um die angeborene Immunität von ERB bei Infektionen mit zoonotischen Viren zu charakterisieren, wurden Zellen aus dem Nasenepithel, dem Riechsystem und dem Gehirn mit verschiedenen Lyssaviren infiziert. Darüber hinaus zeigten sich auffällige Unterschiede in der Suszeptibilität, da Zellen aus dem Nasenepithel weniger, Zellen aus dem Riechepithel hingegen vermehrt suszeptibel waren. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Lagos bat Lyssavirus (LBV) aufgrund einer fehlenden IFN-Expression in infizierten Zellen vermutlich fortgeschrittene Immunoevasions-Eigenschaften besitzt. Da die aktuelle SARS-CoV-2-Pandemie Fledertiere weiter in den Fokus der Zoonoseforschung gerückt hat, wurden primäre Epithelzellen und Tiere mit diesem Virus infiziert, um ERB-spezifische Immuntranskripte in Zellen und Geweben zu untersuchen. Diese Studien ergaben eine auffallend frühe IFNG-Expression im Respirationstrakt infizierter Individuen. Darüber hinaus wurde das Leukozytenprofil in Peripherie und verschiedenen Geweben bei adulten und juvenilen ERB mittels Durchflusszytometrie und Sequenzierung auf Einzelzellebene (scRNA-seq) analysiert. Die Durchflusszytometrie ergab eine signifikant höhere Anzahl von Granulozyten bei adulten, sowie eine höhere Anzahl von B-Zellen bei juvenilen Tieren. Das scRNA-seq ermöglichte eine detaillierte Identifizierung verschiedener Leukozyten-Untergruppen, unter anderem NKT-ähnlichen Zellen und einer PLAC8-exprimierenden B-Zell-Population. Eine funktionelle Charakterisierung von phagozytierenden Zellen und Lymphozyten aus adulten und juvenilen ERB ergab keine signifikanten Unterschiede in zellulärer Funktionalität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit die Eignung aller etablierten ERB-Zelllinien für Untersuchungen der Fledertier-Immunität in vitro gezeigt hat. Zu den Kernergebnissen zählt die Analyse der IFN-Expression im Ruhezustand, bei Stimulation oder Virusinfektion. Darüber hinaus konnten mit Hilfe etablierter qRT-PCR-Protokolle die konstitutive und temperaturabhängige Erhöhung der IFN-Expression sowie die Expression immunbezogener Transkripte in mit SARS-CoV-2 infizierten ERB bestimmt werden. Mithilfe von optimierten scRNA-seq Technologien und Durchflusszytometrie konnten Frequenzen und absolute Zellzahlen in ERB unterschiedlichen Alters bestimmt werden, was z. B. altersabhängige Schwankungen in der Zusammensetzung des Leukozytenprofils aufzeigte.