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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001214-9

Rekombinante Newcastle Disease Viren für die Entwicklung von Markervakzinen- Möglichkeit der simultanen Impfung gegen die Newcastle Krankheit und die Aviäre Influenza

  • Zwei bedeutende Erkrankungen des Wirtschaftsgeflügels, die weltweit zu hohen Verlusten führen können, sind die Newcastle Krankheit und die aviäre Influenza. Mit der Verfügbarkeit des reversen genetischen Systems für das Newcastle Disease Virus (NDV) wurde es möglich, NDV als Vektor für einzelne Proteine, z.B. des aviären Influenzavirus (AIV) zu nutzen und so Viren zu generieren, die als Impfvirus gegen beide Krankheiten einen Schutz vermitteln. Um zu untersuchen, ob die Insertionsposition eines Transgens in das NDV-Genom einen Einfluss auf die Höhe der Expression des Fremdproteins hat, wurde das Hämagglutinin-Protein (HA)-Gen eines hochpathogenen (HP) AIV Isolates in die intergene Region zwischen den Genen für das Phosphoprotein (P) und das Matrixprotein (M), M und das Fusionsprotein (F) oder F und des Hämagglutinin-Neuraminidase Proteins (HN) des attenuierten NDV Clone 30 inseriert. Zusätzlich wurden Virusrekombinanten untersucht, die ein HPAIV Neuraminidase (NA)-Gen zwischen den NDV Genen F und HN alleine oder in Kombination mit dem HA im Insertionsort zwischen NDV P und M trugen. Die Quantifizierung der Expression der HA- und NA-spezifischen mRNA wurde mit Hilfe der Northern Blot Analyse durchgeführt. Die HA-Proteine wurden zusätzlich durch die Massenspektrometrie identifiziert und durch die SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell culture)-Technik quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass die HA Expression auf Transkript- und Proteinebene am höchsten war, wenn das HA-Gen zwischen NDV F und HN inseriert wurde, sich jedoch nur moderat von den anderen untersuchten Insertionsorten unterschied. Daraus kann gefolgert werden, dass die Wahl der intergenen Region zum Einbau des Fremdgens im Genomabschnitt zwischen P und HN nur einen geringfügigen Einfluss auf dessen Expression hat. Durch die simultane Integration von HA und NA in das NDV-Genom konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass NDV zwei Transgene und damit eine Vergrößerung des Gesamtgenoms um über 3 kb toleriert und dabei effizient repliziert Zusätzlich wurde untersucht, ob die gleichzeitige Insertion des NA- und HA-Gens zu einer Steigerung der Immunantwort und folglich zu einem verbesserten Schutz vor einer hoch virulenten aviären Influenzainfektion führt. Dazu wurden drei verschiedene NDV/AIV Rekombinanten generiert, bei denen das HA-Gen zwischen NDV P und M und/oder das NA-Gen zwischen NDV F und HN inseriert wurden. Die Schutzwirkung der Rekombinanten wurde gegen drei verschiedene HPAIV des H5 Subtyps in Hühnern bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Schutzwirkung vor einer letalen HPAIV-Infektion durch die Insertion beider AIV Oberflächenproteingene in das NDV Genom nicht besser war als bei alleiniger AIV HA Expression. Daraus kann geschlossen werden, dass die NA-Antikörper nur einen geringen Beitrag bei der Abwehr einer HPAIV Infektion leisten. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden durch die Sequenzierung des Gesamtgenoms des lentogenen Impfvirus Clone 30 mit Hilfe des Genome Sequenzers (Roche) neun Sequenzunterschiede im Vergleich zum ursprünglichen rekombinanten NDV (rNDV) detektiert. Durch Mutagenese der betreffenden Nukleotide konnte ein NDV generiert werden, das in seiner Sequenz dem Wildtypvirus Clone 30 entspricht. Die Virulenz und Eignung als in ovo Impfvirus des resultierenden Virus (rNDVGu) wurde im Vergleich zu den Virusrekombinanten rNDV, rNDV49, das durch einzelne Punktmutationen im F- und HN-Gen charakterisiert ist, und dem Wildtypvirus NDV Clone 30 untersucht. Bei der Bestimmung der Virulenz durch Ermittlung des intracerebalen Pathogenitätsindex (ICPI) konnte eine Reihung der Viren mit abnehmender Virulenz vorgenommen werden: NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV ~ rNDV49. Die geringere Virulenz des rNDVGu im Vergleich zum Ausgangsvirus Clone 30 deutet auf das Vorhandensein von Unterspezies in dem plaquegereinigtem NDV Clone 30 und die daraus resultierende Beeinflussung der Virulenzeigenschaften hin. Nach in ovo Applikation der drei hergestellten rekombinanten NDV und des Wildtypvirus NDV Clone 30 konnte gezeigt werden, dass das Wildtypvirus für Hühnerembryonen eine höhere Virulenz besitzt als die Virusrekombinanten. Die geschlüpften Küken waren vor einer Infektion mit hochpathogenem NDV geschützt, jedoch entsprachen die Schlupfraten nicht den Anforderungen für eine in ovo Vakzine. Diese Untersuchungen zeigten aber auch, dass mit Hilfe der in ovo Applikation eine deutlichere Unterscheidung der Restvirulenz lentogener NDV mit ähnlichen ICPI-Werten möglich ist.
  • Newcastle Disease and Avian Influenza are important poultry diseases, which cause high losses worldwide. With the availability of a reverse genetics system for Newcastle disease virus (NDV), it was possible to use NDV as a vector for the expression of foreign proteins, for example from avian influenza virus (AIV), to generate bivalent vaccines which convey protection against both, NDV and AIV. To analyze whether the insertion site of a heterologous transgene in the NDV genome influences the level of expression of the foreign protein, the hemagglutinin protein (HA)-gene of a highly pathogenic (HP) AIV was inserted into the intergenic regions between the genes encoding the phoshoprotein (P) and the matrix protein (M), M and the fusion protein (F), or F and the hemagglutinin-neuraminidase protein (HN) of the attenuated NDV strain Clone 30. Additionally, the HPAIV neuraminidase (NA)-gene was inserted between the NDV F and HN genes alone or in combination with the HA gene located between the NDV P and M genes. The expression of HA- and NA-specific mRNA was quantified by Northern blot analysis. Expressed HA proteins were identified by mass spectrometry and quantified by SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell culture)-technique. The results show that expression of mRNA and protein was highest, when the HA gene was inserted between NDV F and HN. However, the difference in comparison to other insertion sites was only moderate. Therefore, it can be concluded that the location of the intergenic NDV genome region for insertion of a foreign gene has only a minor influence on the expression of the foreign gene. Moreover, by simultaneous integration of HA and NA into the NDV genome it was demonstrated that NDV can tolerate simultaneous insertion and expression of two transgenes, which did not impair efficient viral replication despite the increase in genome size of more than 3 kb . It was also analyzed whether the simultaneous transgenic expression of the AIV NA- and HA-genes from an NDV vector would enhance the immune response, resulting in a better protection against HPAI infection. Three different NDV/AIV recombinants were generated which carry the HA gene between NDV P and M, and/or the NA gene between NDV F and HN. The protective efficacy was determined in chickens against three different HPAIV of subtype H5. The results demonstrate that concomitant expression of both AIV surface glycoproteins from the NDV genome did not improve the protective efficacy against lethal HPAIV infection beyond the level seen with transgenic expression of only HA. Therefore, NA contributes only little to the protection against HPAIV infection. Whole genome next generation sequencing and sequence comparisons revealed nine differences within the NDV Clone 30 genome sequence in comparison to recombinant NDV (rNDV). Altered nucleotides in rNDV were modified by mutagenesis, resulting in rNDVGu which exhibited a closer match with the sequence of parental NDV Clone 30. Virus virulence as well as its usefulness as an in ovo vaccine were investigated for rNDVGu in comparison to rNDV, rNDV49 which is characterized by several point mutations within the F- and HN genes, and NDV Clone 30. The determination of virulence after intracerebral inoculation resulted in a ranking of viruses with decreasing virulence in the order NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV ~ rNDV49. Differences in virulence between rNDVGu and its parental strain NDV Clone 30 indicated the possible existence of minor species in the plaque purified NDV Clone 30 influencing pathogenicity. After in ovo application of the three generated recombinant NDVs and parental NDV Clone 30, parental virus exhibited higher virulence in chicken embryos than the recombinant viruses. Hatched chickens were protected from highly pathogenic NDV. However, hatch rates were decreased preventing use of the investigated viruses for in ovo vaccination. Nevertheless, the studies demonstrate that slight differences in virulence of lentogenic NDV can be distinguished after in ovo application.

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Metadaten
Author: Kristina Ramp
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001214-9
Title Additional (English):Recombinant Newcastle Disease Viruses for the development of marker vaccines- a possibility to vaccinate simultaneously against Newcastle disease and Avian influenza
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/04/25
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/02/29
Release Date:2012/04/25
Tag:Avian Influenza Virus, Newcastle Disease Virus, marker vaccines
GND Keyword:Aviäre Influenza Viren, Markervakzine, Newcastle Disease Virus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie