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Identifizierung von an chromosomalen Translokationen beteiligten Genen

  • Maligne Erkrankungen zeigen oft charakteristische genetische Veränderungen. Das Auffinden derartiger Veränderungen wurde in den letzten Jahren durch verfeinerte molekulare Techniken erleichtert. Viele genetische Ereignisse in den maligne transformierten Zellen sind jedoch noch ungeklärt. Die präzise Bestimmung der Bruchpunktregionen chromosomaler Veränderungen bei T-Zell akuten lymphatischen Leukämien ist Inhalt dieser Arbeit. Hierzu wurde die „Fine Tiling-Comparative Genomhybridisierung“ (FT-CGH) mit der „Ligation mediated-PCR“ (LM-PCR) kombiniert. Diese Methoden wurden zunächst an Zelllinien etabliert und anschließend in verschiedenen Leukämieproben eingesetzt. Chromosomale Aberrationen gehen häufig mit Verlust oder Gewinn von genetischem Material einher. Diese unbalancierten Anomalien lassen sich durch die Comparative Genomhybridisierung (CGH) ermitteln. Dieses Verfahren ermöglicht Differenzen der DNA-Menge einer zu untersuchenden Probe bezogen auf eine interne Kontrollprobe zu detektieren. Bei der Fine Tiling-CGH werden gezielt chromosomale Abschnitte hochauflösend auf eventuelle Abweichungen des DNA-Gehaltes analysiert. Anschließend werden die detektierten Bruchpunktregionen der DNA Schwankungen mittels der LM-PCR untersucht. Ein Abgleich mit einer internen Kontrollzelllinie HEK 293-T lässt atypische PCR-Fragmente bei der untersuchten Probe aufspüren. Der anschließende Sequenzabgleich unter der Verwendung des BLASTn Suchprogramms (National Center for Biotechnology Information) führte in den untersuchten Zelllinien, wie auch in den T-Zell akuten lymphatischen Leukämieproben zur Identifizierung verschiedener genomischer Veränderungen. Neben einfachen Deletionen wurden auch bisher ungeklärte komplexere chromosomale Translokationen nachgewiesen. So konnte unter anderem bei einer lymphoblastischen T-Zell-Leukämie die Translokation t(12;14)(q23;q11.2) auf genomischer Ebene geklärt werden. Hierbei fand im Abschnitt 14q11 innerhalb des TRA/D Locus eine Deletion von 89 Kilobasen statt. Die Bruchenden wurden mit der Sequenz des open reading frames C12orf42, welches im 12q23 Chromosomenabschnitt lokalisiert ist, zusammengelagert. Bei dieser chromosomalen Aberration wurde die C12orf42 Sequenz zerstört und 1,3 Kilobasen deletiert. Des Weiteren konnte bei einer akuten lymphoblastischen T-Zell-Leukämie die Inversion inv(14)(q11q32) mit involvierten TRA/D und IGH Locus auf Sequenzebene geklärt werden. Der Bruch des 14q11 Bereiches fand zwischen dem Genabschnitt der konstanten Region (TRAC) des TRA/D Locus und dem DAD1 (defender against cell death 1) Gens statt, wobei im beteiligten genetischen Abschnitt keine Rekombinasesignalsequenz (RSS) zu finden ist. Dieses belegt, dass fehlerhafte Umlagerungen innerhalb des Genoms nicht ausschließlich auf die Rekombinase zurückzuführen sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kombination aus FT-CGH und LM-PCR eine präzise Bruchpunktanalyse unbekannter chromosomaler Aberrationen, welche mit Imbalancen einhergehen, ermöglicht. Diese genaue Analyse dient der Identifizierung von Genen, welche direkt und indirekt durch diese genomischen Umlagerungen betroffen sind. Das Wissen über diese Veränderungen kann für das Verständnis der Pathogenese, für diagnostische Zwecke und zum Nachweis der minimalen Resterkrankung eingesetzt werden. Eine Klärung beteiligter Gene und Signalwege wird es erlauben, zielgerichtete und individualisierte Therapiestrategien zu entwickeln.
  • Malignant diseases show frequently characteristic genetic alterations. The detections of such alterations were facilitating by improved molecular approaches in recent years. The focus of this work is the precise characterisation of breakpoint regions of chromosomal alterations of T-cell acute lymphatic leukaemia. For this purpose the fine-tiling comparative genomic hybridization (FT-CGH) were combined with the ligation mediated-PCR (LM-PCR). These both approaches were established in cell lines and subsequently used in different leukaemia samples. Chromosomal aberrations are frequently accompanied by genetic losses or gains. Such unbalanced alterations can be detected by the comparative genomic hybridization, which allows the detection of DNA copy number differences between a test sample and a reference sample. The fine-tiling-CGH detects with high resolution the DNA amount differences in specific genomic areas. The detected breakpoint regions can be further analysed by the LM-PCR. A comparison with the internal control cell line HEK 293-T revealed atypical PCR fragments in the analysed leukaemia sample. Using the BLASTn search database resulted in the identification of different genomic alterations in cell lines and T-cell acute lymphatic leukaemia samples. The combination of the FT-CGH and the LM-PCR allowed the clarification of simple deletions as well as complex chromosomal translocations. Among other things it were possible to clarify the translocation t(12;14)(q23;q11.2) in a lymphoblastic T-cell leukaemia on genomic level. The data of this translocation revealed a deletion of 89 kb within the TRA/D locus in the chromosomal area 14q11.2. The ending of this deletion were agminate with the open reading frame C12orf42, which is localized on chromosome 12q23. This chromosomal event leads to the destruction of the C12orf42 sequence and a deletion of 1.3 kilobase within this gene. Furthermore it was possible to clarify the inversion inv(14)(q11q32) in a acute lymphoblastic T-cell leukaemia with involved TRA/D and IGH locus on genomic level. The 14q11 breakpoint took place within the sequence of the constant region (TRAC) and the DAD1 (defender against cell death 1) gene. No recombination signal sequence (RSS) was found in the involved genomic area. This result showed that incorrect rearrangements in the genome are not only due to recombination errors. The present work shows that the combination of FT-CGH and LM-PCR allows a precise breakpoint analysis of unknown chromosomal aberrations, which are accompanied by genetic imbalances. This exact analysis leads to the identification of genes, which are affected direct or indirect by this genomic alteration. The knowledge of this chromosomal alteration can lead to understanding of the pathogenesis and can be used for diagnostics and for detection of minimal residual disease (MRD). The clarification of involved genes and metabolic pathways will allow the development of target-oriented and individualized therapy concepts.

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Metadaten
Author: Kathleen Dittmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001063-8
Title Additional (English):Identification of genes located at chromosomal breakpoints
Advisor:Prof. Dr. Christian Schmidt, Prof. Dr. Reiner Siebert, Prof. Dr. Christoph Bandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/09/05
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/06/22
Release Date:2011/09/05
GND Keyword:Akute lymphatische Leukämie, Chromosomenaberration, Chromosomenanalyse, Leukämie, MATLAB, Translokation
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mathematik und Informatik
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 510 Mathematik